氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在阿爾茨海默病中的作用

張立敏，顧超，安紅梅

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院腦病科，上海 200032)

隨著年齡的增長，阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)的患病率逐年升高，給患者家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。AD的主要病理特征是β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積形成的老年斑和高磷酸化Tau蛋白形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元和突觸丟失，盡管AD中神經(jīng)變性的發(fā)病機(jī)制有待進(jìn)一步闡明，但與年齡相關(guān)的氧化應(yīng)激損傷是AD早期發(fā)生、發(fā)展的核心因素[1-2]。氧化應(yīng)激作為一種級(jí)聯(lián)反應(yīng)，由氧化和抗氧化系統(tǒng)不平衡導(dǎo)致，其特征是機(jī)體內(nèi)活性氧類(reactive oxygen species，ROS)、活性氮類(reactive nitrogen species，RNS)等自由基的顯著升高；機(jī)體代謝過程中不斷產(chǎn)生自由基，而抗氧化酶、抗氧化蛋白通過清除自由基維持氧化還原平衡[3]。腦作為高耗氧器官，其抗氧化能力較弱，易發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。在AD疾病早期，神經(jīng)元內(nèi)異常聚集的Aβ和磷酸化Tau蛋白可作為ROS的效應(yīng)分子逐漸沉積[4]；異常沉積的Aβ和Tau蛋白導(dǎo)致二價(jià)鐵離子、銅離子等過渡金屬離子增加和線粒體功能障礙，氧化還原失衡所致的ROS增加、抗氧化酶活性改變以及各種凋亡信號(hào)通路的相互影響均可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，加速AD的發(fā)生[5-6]?，F(xiàn)就氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在AD中的作用予以綜述。

1 線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡在AD中的作用

線粒體不僅是細(xì)胞能量代謝的中心，也是氧化還原反應(yīng)的主要場(chǎng)所，線粒體氧化損傷和ROS的相互作用是AD病理損傷的因素。AD患者腦中神經(jīng)元細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cytc)氧化酶活性降低、ATP生成減少、ROS含量增加，線粒體通道中的淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)累積，隨著神經(jīng)細(xì)胞線粒體損傷的加重，AD的嚴(yán)重程度增加[7]。另外，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠模型中檢測(cè)出60個(gè)線粒體相關(guān)蛋白表達(dá)改變，這些蛋白大多參與了線粒體電子傳遞、三羧酸循環(huán)及氧化應(yīng)激，與神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)[8]。采用Aβ孵育人骨髓神經(jīng)母細(xì)胞或過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)孵育PC12細(xì)胞，均可誘導(dǎo)ROS生成和線粒體功能障礙，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)脂質(zhì)過氧化和DNA氧化損傷，最終導(dǎo)致神經(jīng)突觸丟失、細(xì)胞凋亡[9-10]。因此，明確線粒體氧化應(yīng)激損傷介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，可以為AD的早期預(yù)防和治療提供依據(jù)。

1.1Cytc Cytc是細(xì)胞呼吸鏈中重要的電子傳遞體，主要存在于線粒體中。研究顯示，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，線粒體膜電位下降、Cytc釋放增多、神經(jīng)突觸丟失、細(xì)胞凋亡；而加入ROS阻斷劑N-乙酰半胱氨酸則可顯著抑制細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位下降，減少Cytc釋放以及胱天蛋白酶(caspase)3生成，降低細(xì)胞凋亡率[11-12]。神經(jīng)細(xì)胞凋亡途徑與其他細(xì)胞大致相同，即氧化應(yīng)激損傷時(shí)線粒體呼吸鏈能量代謝障礙，導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔(mitochondrial permeablity transition pore，MPTP)不可逆開放，位于線粒體內(nèi)的Cytc釋放并與凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptosis protease-activating factor-1，Apaf-1)形成多聚復(fù)合體，活化caspase-9 前體，進(jìn)而激活下游的caspase-3，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[13]。

Aβ作為AD的病理產(chǎn)物，極易損傷胞內(nèi)神經(jīng)元線粒體，誘發(fā)氧化應(yīng)激，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Aβ由39～42個(gè)氨基酸組成，來源于APP的淀粉樣水解途徑，APP的胞外區(qū)首先被β-分泌酶水解，然后在膜雙分子層內(nèi)Aβ的40或42位氨基酸被γ-分泌酶水解，生成Aβ40或Aβ42[14]。胞內(nèi)神經(jīng)元生成的Aβ聚集形成寡聚物，與線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)酶結(jié)合而被內(nèi)吞，從而抑制線粒體呼吸鏈電子傳遞和能量代謝，降低細(xì)胞色素氧化酶和丙酮酸脫氫酶活性，干擾線粒體裂變和融合，導(dǎo)致胞內(nèi)谷氨酸和鈣離子(Ca2+)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙以及線粒體氧化損傷，釋放大量的ROS，最終致蛋白質(zhì)脂質(zhì)過氧化、DNA損傷[15-16]。此外，受損的線粒體MPTP不可逆開放，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，而位于線粒體內(nèi)的Cytc等促凋亡蛋白釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，啟動(dòng)神經(jīng)元凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[17]。

1.2B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)基因 Bcl-2位于線粒體膜上，參與調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞凋亡，其中Bcl-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X-protein，Bax)與線粒體的氧化和抗氧化作用密切相關(guān)。一方面，Bcl-2是線粒體上MPTP的組成蛋白，可維持正常的線粒體膜電位，抑制pH異常條件下離子通道的形成；另一方面，線粒體上的Bcl-2與Bax結(jié)合，封閉Bax形成的孔道的活性，使一些小分子不能通過線粒體外膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而起到細(xì)胞保護(hù)作用[18]。Bax與Bcl-2的作用相反，氧化損傷時(shí)下調(diào)的Bcl-2不能拮抗Bax形成的孔道的活性，使Cytc、Apaf-1等小分子自由透過線粒體膜，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[19]。在應(yīng)用Aβ或H2O2孵育的PC12細(xì)胞中，Cytc和Bax表達(dá)上調(diào)、Bal-2表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，其凋亡機(jī)制與細(xì)胞內(nèi)ROS積累激活Bax、抑制Bal-2活性以及促使Cytc、Apaf-1等促凋亡蛋白釋放有關(guān)[20-21]。

神經(jīng)突觸周圍有大量線粒體，提供神經(jīng)遞質(zhì)傳遞和Ca2+流入所需的能量，線粒體極易受到聚集Aβ?lián)p傷，導(dǎo)致線粒體電子傳遞和能量代謝障礙、細(xì)胞內(nèi)Ca2+失衡、大量ROS生成，加速Aβ和Tau的病理學(xué)作用；同時(shí)，逐漸沉積的Aβ和磷酸化的Tau蛋白進(jìn)一步加劇線粒體損傷，導(dǎo)致線粒體膜電位下降、Bal-2活性受到抑制、MPTP不可逆開放，Cytc、Apaf-1和Bax等促凋亡蛋白釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，激活caspase途徑，造成神經(jīng)元和突觸丟失，進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知障礙和記憶喪失，參與AD的發(fā)病[22]，見圖1。

2 ROS-凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1-c-Jun氨基端激酶/p38信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在AD中的作用

ROS作為細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的效應(yīng)分子，可引起凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促使信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)變化。其中，ROS-凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1)-c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)/p38信號(hào)通路的激活與ROS相互作用，加速了神經(jīng)細(xì)胞凋亡和突觸丟失[23-24]。促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是廣泛表達(dá)的絲氨酸/酪氨酸激酶，主要包含胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated kinase，ERK)、JNK和p38 MAPK三個(gè)家族，ROS觸發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)依次通過MAPK激酶激酶-MAPK激酶-MAPK通路將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)凋亡。

2.1ASK1 ASK1是MAPK激酶激酶家族成員之一，其結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，在炎癥、缺血和氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡通路活化過程中起橋梁作用。神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷時(shí)，過量的ROS、沉積的Aβ均可磷酸化ASK1的蘇氨酸殘基，磷酸化后的ASK1作為MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所致神經(jīng)毒性的上游，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡途徑[25-26]。人和鼠的蘇氨酸殘基分別是Thr-838和Thr-845，高表達(dá)的磷酸化ASK1激活下游的JNK/p38，通過p53磷酸化誘導(dǎo)細(xì)胞核凋亡靶基因的表達(dá)；磷酸化的ASK1還可通過活化線粒體相關(guān)Bax的表達(dá)及caspase-3途徑誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，參與AD的發(fā)病和進(jìn)展[27]。

2.2JNK/p38 JNK和p38同屬應(yīng)激活化蛋白激酶。JNK由JNK1、JNK2和JNK3基因編碼形成，編碼后的JNK1/JNK2蛋白在全身廣泛表達(dá)，而JNK3則主要表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)。在AD的小鼠動(dòng)物模型以及大鼠神經(jīng)元和人成纖維細(xì)胞體外細(xì)胞模型中，活化的JNK均參與了磷酸化Tau蛋白的形成，加速了AD的發(fā)病[28]。在H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤氧化應(yīng)激損傷中，磷酸化的JNK和p38 MAPK的表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[29]。ASK1-JNK通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要包括：①通過調(diào)節(jié)線粒體和胞質(zhì)內(nèi)的蛋白介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如活化Bax等促凋亡蛋白的表達(dá)并經(jīng)caspase途徑誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡[30]。在PC12細(xì)胞中加入ROS抑制劑N-乙酰半胱氨酸可導(dǎo)致磷酸化JNK表達(dá)下調(diào)、caspase-3表達(dá)減少，H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率降低[31]。②磷酸化的JNK可以由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，促使核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)，如通過磷酸化p53、c-Jun、c-Fos誘導(dǎo)下游相關(guān)凋亡靶基因的表達(dá)，上調(diào)FasL、腫瘤壞死因子等死亡分子受體的表達(dá)[32]。p38與JNK激活及凋亡的機(jī)制大致相同，活化后的p38與JNK又可刺激產(chǎn)生大量ROS，形成ROS、MAPK與caspase間相互作用的正反饋機(jī)制，從而加速AD的進(jìn)展[33]，見圖1。

2.3ERK1/2 ERK1/2也是MAPK家族成員，當(dāng)內(nèi)環(huán)境改變(缺血、氧化、鈣積累等)時(shí)，ERK1/2磷酸化導(dǎo)致下游蛋白表達(dá)改變，參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡的調(diào)控[34-35]。在H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷的環(huán)境中，磷酸化ERK1/2表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致胞內(nèi)caspase-3水平升高，進(jìn)而致細(xì)胞凋亡[36]。APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元以及AD大鼠模型海馬神經(jīng)細(xì)胞中ERK1/2、p38磷酸化表達(dá)上調(diào)，神經(jīng)元丟失[37]。由此推測(cè)，活化的ERK1/2主要參與AD發(fā)病以及氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)下神經(jīng)元凋亡的調(diào)控，但其調(diào)控機(jī)制與p38和JNK的凋亡通路是否相同，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 酶類抗氧化系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在AD中的作用

酶類抗氧化系統(tǒng)是體內(nèi)對(duì)抗ROS的第一道防線，AD患者腦內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)活性降低，且伴隨大量蛋白質(zhì)、脂質(zhì)過氧化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[38]?？寡趸到y(tǒng)功能失衡參與了AD的氧化應(yīng)激損傷以及神經(jīng)元、突觸丟失。

3.1抗氧化酶

3.1.1SOD SOD作為機(jī)體內(nèi)清除超氧陰離子的酶，主要分布于線粒體和細(xì)胞質(zhì)中，SOD通過歧化反應(yīng)將胞內(nèi)的超氧陰離子生成H2O2和O2。生理情況下，生成的H2O2可以在GPx、CAT等作用下形成H2O和O2，防止胞內(nèi)H2O2水平過高對(duì)機(jī)體造成損傷；當(dāng)氧化損傷發(fā)生時(shí)，SOD活性受到抑制，生成的H2O2不能被及時(shí)清除，通過細(xì)胞膜和線粒體與二價(jià)鐵離子等其他過渡金屬反應(yīng)形成毒性更大的羥基，加重氧化應(yīng)激損傷[39]。SOD在AD發(fā)生過程中起保護(hù)作用，當(dāng)小鼠的SOD2基因被敲除時(shí)，腦內(nèi)核酸出現(xiàn)氧化損傷；同樣，SOD缺乏使Aβ水平升高，促使轉(zhuǎn)基因小鼠癡呆的發(fā)生[40]。因此，當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)受損時(shí)，SOD活性可作為氧化應(yīng)激損傷程度的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。

3.1.2GPx GPx主要分布于線粒體和細(xì)胞質(zhì)中，其不僅可以利用還原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)作為底物催化H2O2生成H2O，還可以清除脂質(zhì)過氧化物。GSH作為GPx的底物主要參與過氧化物的清除，GSH具有抗氧化性可以清除胞內(nèi)自由基和一些過氧化物。GR通過將氧化型GSH還原成GSH，維持GSH的動(dòng)態(tài)平衡，其中氧化型GSH水平是決定ROS、RNS介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的關(guān)鍵因素，體內(nèi)氧化型GSH水平的降低需要多種抗氧化酶的參與，以維持GSH/氧化型GSH的比例；在嚴(yán)重氧化應(yīng)激條件下，細(xì)胞不能維持適當(dāng)?shù)腉SH/氧化型GSH比例，導(dǎo)致氧化型GSH積累，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)過氧化修飾[41]。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)GSH是維持質(zhì)膜完整性和突觸體中ATP水平的關(guān)鍵，GSH減少導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS、RNS水平升高，H2O2清除減弱，羥基形成增多，進(jìn)而觸發(fā)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致神經(jīng)突觸丟失[42]。在H2O2誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞內(nèi)，SOD、CAT、GPx、GR活性降低，丙二醛(malondialdehyde，MDA)生成增加，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[43]。

3.2脂質(zhì)、蛋白質(zhì)過氧化 隨著氧化應(yīng)激的發(fā)生，胞內(nèi)逐漸堆積的ROS、RNS可抑制抗氧化酶活性，導(dǎo)致胞內(nèi)大分子蛋白質(zhì)、脂質(zhì)過氧化，使蛋白質(zhì)、脂質(zhì)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能障礙。MDA是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化的分解產(chǎn)物，而8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG)是DNA分子中鳥嘌呤堿基的第8位碳原子被氧化形成的氧化產(chǎn)物，MDA與8-OHdG的積累表明體內(nèi)抗氧化酶活性改變導(dǎo)致脂質(zhì)和DNA氧化損傷。研究表明，AD患者腦脊液中氧化修飾的核苷水平升高，尤其是8-OHdG、MDA水平升高導(dǎo)致總抗氧能力降低[44]。在相同飼養(yǎng)條件下，與野生型小鼠相比，AD模型小鼠尿液中的8-OHdG、H2O2、MDA水平顯著升高[45]。隨著氧化應(yīng)激損傷的發(fā)生，胞內(nèi)抗氧化酶被過度消耗、抗氧化酶活性受到抑制，氧化與抗氧化失衡，不斷堆積的ROS、RNS使蛋白質(zhì)、脂質(zhì)發(fā)生過氧化、DNA損傷，誘導(dǎo)神經(jīng)元和突觸丟失[46]。SOD、CAT、GPx、GR共同構(gòu)成了機(jī)體的抗氧化防御體系，SOD催化產(chǎn)生的H2O2需要GPx、GR和CAT的及時(shí)清除，以防止胞內(nèi)H2O2積累與超氧陰離子反應(yīng)生成毒性更大的羥基，而SOD清除超氧陰離子可避免CAT與GPx失活[42,45]。當(dāng)酶類抗氧化系統(tǒng)失衡時(shí)，過氧化物及ROS積累，導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)過氧化以及DNA損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，維持抗氧化酶活性及胞內(nèi)抗氧化動(dòng)態(tài)平衡是預(yù)防和治療AD的關(guān)鍵研究指標(biāo)。

4 小 結(jié)

AD的致病過程是一個(gè)多因素、多機(jī)制、漸進(jìn)性的復(fù)雜過程，涉及Aβ病理級(jí)聯(lián)、Tau蛋白過度磷酸化、炎癥反應(yīng)、膽堿能缺失以及氧化應(yīng)激等，其中與年齡相關(guān)的氧化損傷積累是AD發(fā)病早期的變化之一。ROS作為氧化應(yīng)激過程中的主要效應(yīng)分子，可導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)過氧化，抑制抗氧化酶的活性，同時(shí)可影響線粒體功能，活化caspase-3，還可通過ASK1-JNK/p38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，參與AD的發(fā)病。目前AD仍無法治愈，臨床常應(yīng)用膽堿酯酶抑制劑和N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑改善患者癥狀。因此，尋找有效的治療手段及藥物以減輕大腦氧化應(yīng)激損傷，早期防治AD、降低AD的發(fā)病率和致殘率，已成為目前AD的重要研究策略及評(píng)價(jià)指標(biāo)。