基于反應(yīng)型熒光探針檢測過氧化亞硝酰陰離子的進(jìn)展

楊曉琨，趙昊冉，王佳敏，王建紅

（河南大學(xué)天然藥物與免疫工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南開封475004）

1990年，BECKMAN等科學(xué)家在研究超氧陰離子自由基和一氧化氮對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)了 ONOO－的產(chǎn)生［1－2］。 ONOO－是由 O2·－和NO快速結(jié)合而成，其反應(yīng)生成的速率為0.4～1.9×1010M－1·s－1，具有很強(qiáng)的氧化性、親核性和硝化性［3］。 在堿性條件下，ONOO－可以穩(wěn)定存在；而在酸性條件下，其質(zhì)子化的形式ONOOH能夠快速分解，且半衰期小于 10 ms［4］。

在生物體內(nèi)，ONOO－在信號傳導(dǎo)、抗菌和殺菌方面發(fā)揮著積極的作用。但是，由于ONOO－的強(qiáng)氧化性和硝化性，過量的ONOO－與許多重要的生物分子（包括脂質(zhì)、DNA和蛋白質(zhì)等）發(fā)生作用并對其造成損害，導(dǎo)致它與許多疾病相關(guān)，比如神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、炎癥以及癌癥等［5－8］。 在最近的研究中也表明，ONOO－可以作為藥物性肝損傷的生物標(biāo)志物［9－14］，并以此作為藥物安全評估中的指示劑，故有必要開發(fā)靈敏、高效以及原位檢測ONOO－的方法。

相比于紫外?可見光譜法、電化學(xué)分析法、免疫組織化學(xué)法等檢測方法，熒光分析法因具有操作簡便、靈敏度高、無損檢測以及高時(shí)空分辨率等特點(diǎn)引起了研究者的廣泛關(guān)注［15－19］。近年來，越來越多的用于檢測ONOO－的熒光探針被報(bào)道出來。本文以反應(yīng)機(jī)制為基準(zhǔn)將近幾年檢測ONOO－的小分子熒光探針進(jìn)行了歸納和總結(jié)，并對其分子設(shè)計(jì)、熒光性質(zhì)以及生物應(yīng)用加以討論。

1 選擇性檢測ONOO－的熒光探針

1.1 基于氧化硫族元素

在生命體系中存在著大量的含硫族元素（S、Se、Te）的物種，比如，硒存在于谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）的活性中心位點(diǎn)。在含硫族元素的熒光探針中，富電子的硫族元素能夠被ONOO－氧化，從而發(fā)生熒光信號的變化。

2011年，韓克利課題組［20］報(bào)道了一例含有硒元素的可逆近紅外熒光探針1（見圖1）。花菁熒光團(tuán)通過光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移過程（PET）導(dǎo)致熒光猝滅，當(dāng)硒元素被氧化成硒亞砜后阻止了PET過程，從而使熒光恢復(fù)；當(dāng)還原性物質(zhì)谷胱甘肽（GSH）存在時(shí)，可以將硒亞砜還原為硒元素從而實(shí)現(xiàn)一個(gè)可逆的循環(huán)。向探針1的溶液中加入ONOO－后，溶液的熒光強(qiáng)度增加了約23.3倍，量子產(chǎn)率從0.05增加到0.12，最大發(fā)射波長從800 nm藍(lán)移至775 nm。此外，探針1不僅可用于檢測RAW 264.7細(xì)胞內(nèi)源性O(shè)NOO－，還成功應(yīng)用于對細(xì)胞內(nèi)源性O(shè)NOO－和GSH的可逆檢測。

基于碲酶類似物GPx的活性比硒酶的活性高這一現(xiàn)象［21－22］，韓克利課題組［23］還報(bào)道了一例基于花菁熒光團(tuán)的含碲元素的可逆近紅外熒光探針2（見圖1）。向探針溶液中加入 ONOO－后，產(chǎn)生的Cy?NTeO最大吸收峰在793 nm，最大發(fā)射波長在820 nm。與此同時(shí)，熒光強(qiáng)度增加，熒光量子產(chǎn)率增加了約14倍。探針2能夠?qū)€粒體內(nèi)的ONOO－響應(yīng)，同時(shí)在細(xì)胞內(nèi)可以被GSH還原，從而實(shí)現(xiàn)可逆氧化還原循環(huán)。

YUDHISTIRA等［24］基于 BODIPY染料報(bào)道了一種開關(guān)型熒光探針3（見圖1）。探針3通過在BODIPY的meso位引入二硫代苯基馬來酰亞胺基識別基團(tuán)來實(shí)現(xiàn)對ONOO－的特異性檢測。探針3由于PET機(jī)制自身沒有熒光，當(dāng)向測試體系中加入ONOO－后，二硫代苯基馬來酰亞胺基上的硫原子被氧化為亞砜，PET機(jī)制被阻止，熒光恢復(fù)。與此同時(shí)，512 nm處熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了約18倍且檢測限低至0.4 μM。探針3對ONOO－具有較好的選擇性且響應(yīng)時(shí)間短，能夠檢測HeLa細(xì)胞中產(chǎn)生的內(nèi)源性O(shè)NOO－。

圖1 探針1～3選擇性檢測ONOO－示意圖Fig.1 Schematic diagram of probe 1－3 selective detection of ONOO－

1.2 基于碳碳雙鍵斷裂反應(yīng)

含有碳碳雙鍵的化合物可以與許多物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，比如硫化物［25］、活性氧［26］、亞硫酸鹽［27］等。 當(dāng)探針中的碳碳雙鍵被ONOO－氧化后，碳碳雙鍵會(huì)發(fā)生斷裂生成相應(yīng)的醛或羧酸（圖2），熒光信號因此發(fā)生變化。

圖2 基于碳碳雙鍵斷裂反應(yīng)的熒光探針檢測ONOO－示意圖Fig.2 Schematic diagram of fluorescent probe detection ONOO－ based on carbon?carbon double bond cleavage reaction

錢旭紅課題組［28］報(bào)道了一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的小分子比率式熒光探針4（見圖3）。探針4的最大吸收峰分別在540 nm和640 nm，對應(yīng)于染料Cy3和Cy5的最大吸收值。以530 nm為激發(fā)波長（對應(yīng)于Cy3），探針4在660 nm處有強(qiáng)烈的熒光發(fā)射峰（對應(yīng)于Cy5）。向探針溶液中加入ONOO－后，Cy5被氧化分解，探針4在640 nm處（對應(yīng)于Cy5）吸收值降低，而在540 nm處（對應(yīng)于Cy3）的吸收值保持不變，溶液由深紫色變?yōu)榉奂t色。同時(shí)，探針在660 nm處的熒光發(fā)射峰降低，而在560 nm處的熒光發(fā)射峰增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度增加了324倍（F560nm／F660nm）。 探針 4不僅可以定位于線粒體，還可以用于活細(xì)胞中ONOO－的半定量測定，并且已成功的檢測到RAW 264.7細(xì)胞中內(nèi)源性的ONOO－。

張小玲課題組［29］基于萘酰亞胺?半花菁混合熒光染料報(bào)道了一例可以同時(shí)檢測粘度和ONOO－的熒光探針5（見圖3）。該探針有兩種發(fā)射峰，一種在綠色區(qū)域（510 nm）對ONOO－敏感，一種在紅色區(qū)域（610 nm）對粘度敏感。在水?甘油混合溶液中，探針5在610 nm處的熒光強(qiáng)度隨著甘油比例的增加而增強(qiáng)。與在水溶液中相比，探針5在甘油中的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了約50倍，熒光量子產(chǎn)率提高了約22倍。向探針5溶液中加入ONOO－后，由于萘酰亞胺部分和吲哚環(huán)之間的雙鍵發(fā)生斷裂，探針在510 nm處的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。探針中引入了嗎啉環(huán)使其定位于溶酶體中，并成功應(yīng)用于檢測活細(xì)胞中的ONOO－和溶酶體內(nèi)的粘度。

王素華課題組［30］基于苯并噻唑修飾的菁染料報(bào)道了一種近紅外熒光探針6（見圖3）。向探針溶液中加入ONOO－后，菁染料中的C＝C雙鍵被氧化斷裂，與此同時(shí)，探針6在630 nm處的紫外吸收峰逐漸降低，在460 nm處的吸收強(qiáng)度逐漸增加且溶液的顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。探針6對ONOO－的檢測限低至26 nM，不僅可以對RAW 264.7細(xì)胞中產(chǎn)生的外源性和內(nèi)源性O(shè)NOO－進(jìn)行檢測，還成功應(yīng)用于檢測血清樣品中的ONOO－。

呂弋課題組［31］報(bào)道了一種靶向線粒體的雙光子近紅外熒光探針7（見圖3）。該探針利用雙光子熒光團(tuán) 1?（6?二甲胺基萘?2?基）乙酮和吲哚鎓衍生物直接縮合得到。與ONOO－發(fā)生反應(yīng)后，探針7在718 nm處的發(fā)射峰逐漸降低，在535 nm處發(fā)射峰逐漸增加。推斷此現(xiàn)象是因?yàn)樘结樀碾p鍵斷裂所致，通過電噴霧電離質(zhì)譜分析和核磁共振滴定驗(yàn)證了這一猜測。探針7具有較低的毒性，可以檢測RAW 264.7細(xì)胞中內(nèi)源性和外源性O(shè)NOO－的生成。除此之外，由于不同狀態(tài)下肺切片中ONOO－的濃度不同，探針7可以通過觀察熒光強(qiáng)度的變化早期預(yù)測肺纖維化進(jìn)展。

圖3 探針4～7選擇性檢測ONOO－示意圖Fig.3 Schematic diagram of probes 4－7 selective detection of ONOO－

1.3 基于酰肼的氧化反應(yīng)

酰肼官能團(tuán)是ONOO－的一個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)，但是對其他物種也比較敏感，比如 ClO－［32］、Cu2＋［33］、Hg2＋［34］等。通過改變與酰肼官能團(tuán)連接的結(jié)構(gòu)可以改變探針的選擇性。當(dāng)酰肼官能團(tuán)檢測到ONOO－后，酰肼官能團(tuán)上的氮原子會(huì)與ONOO－發(fā)生親核加成反應(yīng)生成中間體a，然后中間體a發(fā)生分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移和水解反應(yīng)導(dǎo)致酰胺鍵斷裂，非熒光螺環(huán)結(jié)構(gòu)被打開，熒光開啟（圖4）。

圖4 基于酰肼氧化反應(yīng)的熒光探針檢測ONOO－示意圖Fig.4 Schematic diagram of fluorescent probe detection ONOO－based on hydrazide oxidation reaction

馬會(huì)民課題組［35］報(bào)道了一種靶向線粒體的熒光探針8（見圖5）。探針8以羅丹明為熒光團(tuán)，苯肼為識別集團(tuán)，三苯基膦陽離子為線粒體靶向部分。由于螺環(huán)羅丹明內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)，探針8在可見光區(qū)顯示出非常弱的吸收，熒光強(qiáng)度非常低。當(dāng)探針8與ONOO－反應(yīng)后，溶液由無色變?yōu)榉奂t色，并且在550 nm處出現(xiàn)新的吸收峰，在578 nm處熒光強(qiáng)度增加了約80倍。探針8已成功地應(yīng)用于對線粒體中內(nèi)源性和外源性O(shè)NOO－的形成進(jìn)行成像。

圖5 探針8～14選擇性檢測ONOO－示意圖Fig.5 Schematic diagram of probes 8－14 selective detection of ONOO－

YOON課題組［36］基于羅丹明衍生物報(bào)道了一種熒光探針9（見圖5）。由于螺環(huán)結(jié)構(gòu)阻礙了被取代的氨基與芳烴之間的共軛作用，探針9自身沒有顏色也無熒光。當(dāng)探針9與ONOO－發(fā)生反應(yīng)后，在638 nm處其熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了約80倍，檢出限為45 nM。探針9可檢測HeLa細(xì)胞中產(chǎn)生的外源性O(shè)NOO－和RAW 264.7細(xì)胞中產(chǎn)生的內(nèi)源性O(shè)NOO－。除此以外，此探針還可用于檢測倍銅綠假單胞菌（PAO1）感染的小鼠骨髓中性粒細(xì)胞所產(chǎn)生的內(nèi)源性O(shè)NOO－。

朱寶存課題組［37］報(bào)道了一種靶向線粒體的遠(yuǎn)紅外熒光探針10（見圖5）。由于螺內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，其自身的熒光發(fā)射可以忽略不計(jì)。探針10與ONOO－反應(yīng)后，在630 nm處熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了約40倍。值得注意的是，探針10可以與ONOO－快速發(fā)生響應(yīng)（＜5 s），而且對ONOO－的選擇性高，檢出限為17 nM。除此之外，探針10已被成功用于監(jiān)測HeLa細(xì)胞的線粒體中產(chǎn)生的內(nèi)源性O(shè)NOO－，其肼籠狀半萘并羅丹芴螺環(huán)結(jié)構(gòu)被證明是ONOO－的理想識別基團(tuán)，而且已被成功的用于比率型熒光探針的設(shè)計(jì)。

使用同樣的策略，馮國強(qiáng)課題組［38］基于色烯?花菁雜化物，報(bào)道了一種可視化的近紅外熒光探針11（見圖5）。由于螺內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)，探針11自身沒有顏色也沒有熒光。當(dāng)其檢測到ONOO－后，探針溶液由無色變?yōu)樗{(lán)色，并且在698 nm處熒光強(qiáng)度增加了約120倍。而且探針11與ONOO－的響應(yīng)時(shí)間非常短（≈ 2 s），可用于檢測HeLa細(xì)胞和RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源性O(shè)NOO－。

2019年，馮國強(qiáng)課題組［39］又報(bào)道了一種靶向溶酶體的近紅外熒光探針12（見圖 5）。該探針選用羅丹明苯并吡咯（BP650）為熒光團(tuán)，螺酰肼作為反應(yīng)位點(diǎn)。由于螺內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)，探針12自身沒有熒光，當(dāng)其與ONOO－發(fā)生反應(yīng)后溶液由無色變?yōu)樗{(lán)色，并且在650 nm處熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了約220倍。除此之外，探針12與ONOO－可以迅速發(fā)生反應(yīng)（≈25 s），檢出限低至16 nM，并且可以在HeLa細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)對ONOO－進(jìn)行成像。

朱寶存課題組［40］開發(fā)了一種新型羅丹明B環(huán)狀六氫噠嗪熒光探針 13（見圖 5）。探針 13與ONOO－發(fā)生反應(yīng)后，六氫噠嗪部分將會(huì)斷裂得到開環(huán)產(chǎn)物，熒光開啟。反應(yīng)后溶液由無色變?yōu)榧t色，并且在570 nm和580 nm處分別出現(xiàn)新的吸收峰和發(fā)射峰。探針13與ONOO－可以在10 s內(nèi)快速發(fā)生響應(yīng)，其不僅可以檢測巨噬細(xì)胞和斑馬魚中的ONOO－，而且可以用于監(jiān)測通過刺激所引起的ONOO－的上調(diào)。

張貴生課題組［41］通過擴(kuò)展傳統(tǒng)的羅丹明π共軛體系，報(bào)道了一種雙光子近紅外熒光探針14（見圖5）。當(dāng)探針與ONOO－發(fā)生反應(yīng)后，在660 nm處熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了約340倍。探針14具有深的組織穿透力（204 μm），可以可視化內(nèi)源性 ONOO－的產(chǎn)生并評估由各種疾病引起的炎癥。除此之外，其已成功地應(yīng)用于檢測炎癥小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的ONOO－，并且可以實(shí)時(shí)監(jiān)測由對乙酰氨基酚（APAP）誘導(dǎo)的肝損傷期間及修復(fù)過程中ONOO－的產(chǎn)生。

1.4 基于氧化N?脫芳基化反應(yīng)

氧化N?脫芳基化反應(yīng)是檢測ONOO－最常用的機(jī)理之一。在含N芳基的熒光團(tuán)上引入富電子基團(tuán)，有利于發(fā)生PET過程，從而有效地淬滅探針的熒光。與此同時(shí)，引入富電子基團(tuán)可以增加苯環(huán)上的電子云密度，有利于探針與ONOO－發(fā)生N?脫芳基化反應(yīng)。當(dāng)檢測到ONOO－后，探針中的酚羥基會(huì)被氧化，并伴隨著亞胺離子的生成，隨后亞胺離子發(fā)生水解反應(yīng)，釋放出苯醌和氨基熒光團(tuán)，熒光信號發(fā)生改變（圖 6）。

圖6 基于氧化N?脫芳基化反應(yīng)的熒光探針檢測ONOO－示意圖Fig.6 Schematic diagram of fluorescent probe detection ONOO－based on oxidative N?dearylation reaction

劉陽平課題組［42］基于 1，8?萘酰亞胺熒光團(tuán)報(bào)道了一種熒光探針15（見圖 7）。該探針由1，8?萘酰亞胺與4?甲氨基苯酚硫酸鹽直接共軛得到。由于4?甲氨基苯酚電子云密度高，會(huì)發(fā)生PET過程使得探針沒有熒光。當(dāng)探針15檢測到 ONOO－后，ONOO－會(huì)與4?甲氨基苯酚發(fā)生氧化 N?脫芳基反應(yīng)生成發(fā)射綠色熒光產(chǎn)物NP?P，并且在545 nm處熒光強(qiáng)度增加了約12倍。探針15的檢出限低至11 nM，主要定位于細(xì)胞核中，并且已被成功用于觀察RAW 264.7細(xì)胞中產(chǎn)生的外源性O(shè)NOO－和刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生的ONOO－。

王升富課題組［43］基于二氰基亞甲基?4H?吡喃的衍生物（DCM染料）報(bào)道了一種遠(yuǎn)紅外熒光探針16（見圖7）。由于α?酮酰胺部分具有吸電子能力，減弱了PET過程和分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）過程，探針具有非常弱的熒光。當(dāng)檢測到ONOO－后，酰胺鍵斷裂并釋放出熒光團(tuán)DCM?NH2，溶液由淺黃色變成橙色。與此同時(shí)，探針的最大發(fā)射波長由650 nm藍(lán)移至630 nm，并且顯示出大的斯托克斯位移（約160 nm）。探針16對ONOO－的檢出限低至78 nM，可以在 pH＝3.0～11.0 的范圍內(nèi)檢測 ONOO－。 除此之外，利用探針16可以對J774A.1細(xì)胞中產(chǎn)生的內(nèi)源性O(shè)NOO－成像。

基于同一類熒光團(tuán)，喬仁忠課題組［44］報(bào)道了一種近紅外熒光探針17（圖7）。當(dāng)探針檢測到ONOO－時(shí)，C－N鍵將會(huì)發(fā)生斷裂，共軛體系減少，釋放出具有強(qiáng)熒光的DCM?NH。與ONOO－反應(yīng)后，探針17的最大吸收峰從514 nm藍(lán)移至497 nm，并且在650 nm處熒光強(qiáng)度增加了約30倍。探針17與ONOO－反應(yīng)速度快（≈5 s），可以用于檢測 HepG 2 和 RAW 264.7 細(xì)胞中的內(nèi)源性O(shè)NOO－，且實(shí)現(xiàn)了小鼠炎癥模型中的氧化應(yīng)激的可視化。

圖7 探針15～20選擇性檢測ONOO－示意圖Fig.7 Schematic diagram of probe 15－20 selective detection of ONOO－

李新課題組［45］報(bào)道了兩例超靈敏熒光探針18和19（圖7）。由于苯酚環(huán)在BODIPY環(huán)上自由旋轉(zhuǎn)會(huì)消耗能量，兩個(gè)探針自身都沒有熒光。當(dāng)向探針溶液中加入ONOO－后，對羥基苯酚部分發(fā)生氧化反應(yīng)釋放出有熒光的物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，探針19與ONOO－反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度大約是探針18的148倍。值得注意的是，即使ONOO－濃度低至0.5 nM仍然可以觸發(fā)探針19熒光強(qiáng)度的增加。探針19具有理想的理化性質(zhì)，通過靜脈注射到小鼠體內(nèi)后，很容易穿透小鼠的血腦屏障。利用這一優(yōu)勢，探針19可以追蹤凝結(jié)的微血管中ONOO－的通量，對缺血引起的腦損害進(jìn)行成像。除此之外，該探針還成功的檢測到在血栓形成過程中和缺血的早期階段腦實(shí)質(zhì)中ONOO－的過量產(chǎn)生。

王鵬課題組［46］基于查爾酮類似物報(bào)道了一種開關(guān)型熒光探針20（圖7）。該探針以苯基乙醛酸為識別位點(diǎn)，被硝基取代后的苯基乙醛酸由于缺少電子，會(huì)猝滅探針的熒光。探針20的最大吸收峰大約在350 nm處，熒光信號非常低，當(dāng)加入ONOO－后，探針20的最大吸收峰紅移至400 nm處，同時(shí)在560 nm處觀察到了熒光強(qiáng)度的增加。在生理?xiàng)l件下，探針與ONOO－可以在15 min內(nèi)完成反應(yīng)，而且對ONOO－的選擇性高于其他分析物，可以很容易地檢測到內(nèi)源性O(shè)NOO－。除此之外，探針20具有較好的細(xì)胞膜滲透性和低的細(xì)胞毒性，已成功地應(yīng)用于檢測MCF?7細(xì)胞和藥物性肝損傷的組織中產(chǎn)生的內(nèi)源性O(shè)NOO－。

1.5 基于硼酸或硼酸酯的氧化反應(yīng)

硼酸和硼酸酯已被廣泛地應(yīng)用于檢測H2O2的熒光探針中，研究發(fā)現(xiàn)硼酸或硼酸酯與ONOO－的反應(yīng)速度比與H2O2的反應(yīng)速率快近六個(gè)數(shù)量級［47］，因此基于硼酸或硼酸酯設(shè)計(jì)開發(fā)特異性檢測ONOO－的探針引起了廣泛的關(guān)注。以苯基硼酸頻哪醇酯與ONOO－的反應(yīng)機(jī)理為例，ONOO－具有強(qiáng)親核性可以與硼發(fā)生親核加成反應(yīng)形成過氧硼酸酯中間體，然后通過電子遷移得到芳氧基硼烷，隨后芳烴水解形成苯酚（圖 8）［48－49］。

圖8 苯基硼酸頻哪醇酯與ONOO－反應(yīng)示意圖Fig.8 Schematic diagram of the reaction between phenylboronic acid pinacol ester and ONOO－

KIM等［50］基于N?甲基苯并噻唑?yàn)闊晒鈭F(tuán)，結(jié)合芐基硼酸酯保護(hù)單元報(bào)道了一種反應(yīng)性探針21（圖9）。由于硼酸酯基團(tuán)阻礙了激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（ES?IPT）過程，探針21的熒光強(qiáng)度較低。當(dāng)檢測到ONOO－時(shí)，探針中的羥基苯胺部分將會(huì)發(fā)生氧化裂解，產(chǎn)生熒光強(qiáng)度較高的N?甲基?苯并噻唑質(zhì)子供體，此供體最大發(fā)射波長在400 nm處。探針21可以用于檢測Hela細(xì)胞和RAW 264.7細(xì)胞中的ONOO－。朱寶存課題組［51］通過將半萘并羅丹熒光染料和4?（溴甲基）苯硼酸頻哪醇酯的組合構(gòu)建了一種比率式遠(yuǎn)紅外熒光探針22（圖9）。由于探針分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移能力較弱，熒光發(fā)射在短波長。當(dāng)探針22檢測到ONOO－時(shí)，硼酸化芐基保護(hù)基會(huì)斷裂，產(chǎn)生具有強(qiáng)給電子能力的氧陰離子，分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移能力增加，最大發(fā)射波長從560 nm紅移至630 nm，同時(shí)溶液由無色變?yōu)榉奂t色。探針22的檢出限低（0.9 nM），可以在短時(shí)間內(nèi)（＜5 s）與 ONOO－發(fā)生反應(yīng)。除此之外，探針22可以對RAW 264.7細(xì)胞中內(nèi)源性O(shè)NOO－成像。

圖9 探針21～25選擇性檢測ONOO－示意圖Fig.9 Schematic diagram of probes 21－25 selective detection of ONOO－

王鵬課題組［52］基于亞氨基香豆素?苯并噻唑設(shè)計(jì)合成了一種熒光探針23（圖9）。探針中連接雙鍵的基團(tuán)可以自由旋轉(zhuǎn)促進(jìn)單重激發(fā)態(tài)的快速非輻射躍遷，因此探針自身顯示出弱的熒光發(fā)射。當(dāng)檢測到ONOO－后，探針23中芳基硼酸酯部分將會(huì)發(fā)生氧化、水解、消除反應(yīng)生成酚鹽，然后再進(jìn)行分子內(nèi)親核反應(yīng)生成具有高熒光強(qiáng)度的KC?2。反應(yīng)產(chǎn)生的KC?2的最大發(fā)射波長在530 nm處，且探針的檢出限低至1.5×10－8M。探針23對細(xì)胞的毒性較低，已被成功用于追蹤HepG 2細(xì)胞和藥物性肝損傷的過程中產(chǎn)生的ONOO－。

韓得滿課題組［53］基于DCM染料與硼酸部分的親核取代反應(yīng)報(bào)道了一種熒光探針24（圖9）。在水溶液中，探針24的硼酸部分在30 s內(nèi)與乳木果發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生復(fù)合物KB7?Lactulose后，在610 nm處熒光強(qiáng)度增加了約13倍。該復(fù)合物與ONOO－發(fā)生反應(yīng)后，在40 s內(nèi)熒光被猝滅。探針24已被證明可以用于檢測HepG 2細(xì)胞中產(chǎn)生的外源性O(shè)NOO－和真實(shí)水樣中的痕量ONOO－。

葉勇課題組［54］基于喹諾林?丙二腈設(shè)計(jì)合成了一種可激活的具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)的熒光探針25（圖9）。探針25具有長波長發(fā)射（λem＝620 nm）和大的斯托克斯位移（190 nm）。當(dāng)其與ONOO－反應(yīng)后會(huì)釋放出QM?OH，然后QM?OH在活化位點(diǎn)形成熒光聚集物，限制分子的自由旋轉(zhuǎn)，恢復(fù)其固有的聚集誘導(dǎo)發(fā)光。在345 nm和430 nm處探針25具有雙重吸收。當(dāng)加入ONOO－后，探針在345 nm處吸收峰降低，在430 nm處吸收峰增加，且在620 nm處熒光強(qiáng)度逐漸增加。除此之外，探針25可以檢測在EC1細(xì)胞中產(chǎn)生的內(nèi)源性和外源性O(shè)NOO－。

1.6 基于其他反應(yīng)

CHURCHILL課題組［55］基于二苯基次磷酯的親核裂解反應(yīng)報(bào)道了一例熒光探針26（圖10）。探針26由于ICT過程本身幾乎沒有熒光，其有兩個(gè)最大吸收峰分別位于 415 nm和 440 nm，當(dāng)檢測到ONOO－時(shí)，次磷酸酯鍵將會(huì)發(fā)生斷裂放出DCPO，最大吸收峰紅移至550 nm，熒光恢復(fù)，在690 nm處熒光強(qiáng)度增加了約120倍并達(dá)到最大值。探針26對細(xì)胞沒有顯著的毒性，并且可以在HeLa細(xì)胞中選擇性檢測ONOO－。

圖10 探針26和27選擇性檢測ONOO－示意圖Fig.10 Schematic diagram of probes 26 and 27 selective detection of ONOO－

李春艷課題組［56］通過將半乳糖連接在香豆素?苯并吡咯的熒光團(tuán)上合成了比率式近紅外熒光探針27（圖10）。當(dāng)檢測到ONOO－時(shí)，探針27被氧化裂解釋放出coumarin 343，反應(yīng)后體系熒光性質(zhì)發(fā)生改變。探針27自身的最大發(fā)射波長在720 nm處，以440 nm激發(fā)波長激發(fā)探針后，其在500 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增加，在熒光燈下熒光由黑色變?yōu)榫G色。與此同時(shí)，探針27的最大吸收峰從650 nm藍(lán)移至440 nm，溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。探針27對細(xì)胞毒性低，已成功的在HepG 2細(xì)胞中對藥物性肝損傷過程中ONOO－的上調(diào)進(jìn)行監(jiān)測。除此之外，探針27能夠特異性靶向肝細(xì)胞，從而可以有效地評價(jià)在小鼠肝臟中使用保護(hù)肝臟的藥物后對APAP誘導(dǎo)所引起的肝損傷的修復(fù)效果。

2 結(jié)論與展望

根據(jù)不同的反應(yīng)機(jī)制歸納總結(jié)了近幾年檢測ONOO－的小分子熒光探針的構(gòu)建及其在生物活性中的應(yīng)用。氧化還原反應(yīng)是細(xì)胞周期中發(fā)生的最重要的細(xì)胞過程之一。ONOO－作為氧化劑和硝化劑參與各種生化反應(yīng)，例如DNA和蛋白質(zhì)的硝化。隨著科研工作者對 ONOO－研究的深入，人們對ONOO－的認(rèn)知也越來越多，例如在近年來的研究中，科研工作者發(fā)現(xiàn)在藥物致肝損傷和腎損傷中都能檢測到較高含量的ONOO－。但是ONOO－的濃度低、半衰期短等性質(zhì)與其他活性氧物種的性質(zhì)相似，因此在復(fù)雜的生命體系中建立一種能夠高選擇性和高靈敏度檢測ONOO－的方法仍具有一定的挑戰(zhàn)。

隨著特異性檢測ONOO－的熒光探針的不斷發(fā)展，科研工作者會(huì)開發(fā)出對ONOO－具有更高靈敏度以及更好的生物相容性且不限于以上反應(yīng)類型的熒光探針，基于這些新的探針，可以實(shí)現(xiàn)對內(nèi)源性O(shè)NOO－參與各種生理和病理過程的監(jiān)測，從而實(shí)現(xiàn)利用細(xì)胞和組織中ONOO－濃度的變化來提供一些與疾病相關(guān)的重要信息，在不久的將來，其將在生化和臨床領(lǐng)域提供更多應(yīng)用。此外，ONOO－在除線粒體之外的亞細(xì)胞器中的功能也應(yīng)該被關(guān)注，期望能夠發(fā)現(xiàn)與ONOO－相關(guān)疾病的更多的病理過程等，從而為相關(guān)疾病的預(yù)防以及早期預(yù)測診斷提供新的方法。