RP?HPLC法測(cè)定黃體酮注射液中苯甲醇的含量

李明珠，白 云，張?chǎng)卧?，王先?/p>

（河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南開封475004）

黃體酮注射液是黃體酮的滅菌茶油溶液，內(nèi)含苯甲醇等輔料，其主要成分黃體酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)為孕甾?4?烯?3，20?二酮［1］。 苯甲醇通常作為增溶劑和防腐劑在黃體酮注射液生產(chǎn)中使用，而苯甲醇易氧化成苯甲醛，有較強(qiáng)的毒性［2－4］，對(duì)人體具有危害性，比如對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用主要表現(xiàn)為記憶力減退、頭痛頭暈、疲勞無力、視力模糊、惡心嘔吐、步態(tài)不穩(wěn)以及手腳發(fā)麻等癥狀［5］；對(duì)于身體機(jī)能尚未完善的新生兒來說，苯甲醇和其被氧化產(chǎn)物苯甲醛更容易透過血腦屏障，最終可能會(huì)導(dǎo)致新生兒中毒甚至死亡［6－7］。另外，肌肉注射苯甲醇過量會(huì)增大臀肌攣縮癥的風(fēng)險(xiǎn)。2020版《中國(guó)藥典》關(guān)于黃體酮注射液中苯甲醇的含量未作明確規(guī)定，只要求加入苯甲醇應(yīng)適量，因此需要嚴(yán)格控制制劑中苯甲醇的含量［8］。本研究采用HPLC法測(cè)定黃體酮注射液中苯甲醇的含量，結(jié)果表明在同一色譜條件下可同時(shí)測(cè)定兩種物質(zhì)的含量，為其質(zhì)量控制提供了一種簡(jiǎn)單便捷方法［9］。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200 C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）， 十萬(wàn)分之一電子天平：Sartorius BT125D。

乙腈：色譜純；醋酸：分析純；無水醋酸鈉：分析純；黃體酮注射液（市售，苯甲醇處方量：2%）。

1.2 溶液的配制

1.2.1 樣品溶液

精密量取黃體酮注射液1 mL，用甲醇振搖提取3次（每次3mL），每次振搖5 min后再離心10 min，將甲醇提取液移至10 mL容量瓶中，合并提取液。最后用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過。

1.2.2 對(duì)照品溶液

精密量取苯甲醇對(duì)照品2 mL置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，即得苯甲醇對(duì)照品溶液。

精密量取苯甲醛對(duì)照品0.2 mL置于50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻作為貯備液（1）；精密量取1 mL貯備液（1）置于100 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，作為貯備液（2）；精密量取1 mL貯備液（2）置于20 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，即得苯甲醛對(duì)照品溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱：Agilent 1200 C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）， 流動(dòng)相：醋酸?醋酸鈉緩沖液（pH＝3.6）與乙腈體積比為 70 ∶30， 流速：1.0 mL／min， 柱溫：30℃，λD＝ 254 nm， 進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性實(shí)驗(yàn)

按照上述色譜條件測(cè)定，得到對(duì)照品和樣品色譜圖如圖1。苯甲醇的保留時(shí)間約為7.5 min，苯甲醛的保留時(shí)間約為14 min，分離度大于14，理論塔板數(shù)大于8 000。

圖1 對(duì)照品溶液（a）和樣品溶液（b）色譜圖Fig.1 Chromatogram of reference solution （a）and Sample solution （b）

2.1.2 線性范圍

精密量取苯甲醇對(duì)照品溶液適量，配制出濃度梯度約為 0.010、0.015、0.020、0.025、0.030 μL／L 的對(duì)照品溶液，按照“1.3”色譜條件測(cè)定，線性回歸，測(cè)得苯甲醇峰面積Y和濃度X的線性方程為Y＝1 661.2X＋24.036 （R2＝ 0.999 8）。 結(jié)果表明， 苯甲醇濃度在 0.01 ～ 0.03 μL／L 范圍內(nèi)， 線性關(guān)系良好。

2.1.3 系統(tǒng)精密度

取濃度為 0.020 μL／L的對(duì)照品溶液，按照上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，測(cè)得苯甲醇峰面積的RSD為0.14%。

2.1.4 供試品溶液穩(wěn)定性

分別測(cè)定供試品溶液在 0、2、4、6、8、12 h 后的峰面積，測(cè)得苯甲醇的RSD為0.40%，證明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批黃體酮注射液，按照前述方法制備6份樣品溶液，按“1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，測(cè)得苯甲醇含量的RSD值為1.2%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.6 回收率實(shí)驗(yàn)

取含量已知的黃體酮注射液適量，加入一定量的苯甲醇對(duì)照品適量，按照前述方法測(cè)定，計(jì)算出平均回收率為 99.26%，RSD＝ 1.1% （n＝6）。

2.2 樣品中苯甲醇的含量測(cè)定

分別取三個(gè)批號(hào)的黃體酮注射液適量，按“1.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 按照上述色譜條件測(cè)定，三批含量結(jié)果見表1。

表1 樣品中苯甲醇的含量Table 1 Content of benzyl alcohol in sample

各批樣品檢測(cè)結(jié)果與理論投料（苯甲醇處方量：2%）基本一致，符合標(biāo)示量80% ～120%的要求。

2.3 苯甲醛的檢查

苯甲醇易被氧化成苯甲醛，根據(jù)中國(guó)藥典（2020版，二部）苯甲醇規(guī)定［10］，苯甲醇中苯甲醛的含量不能超過0.1%。在對(duì)黃體酮注射液中苯甲醇含量的分析過程中，發(fā)現(xiàn)有苯甲醛色譜峰，且苯甲醇與苯甲醛的色譜峰分離度大于14，因此可采用苯甲醇的色譜分析方法對(duì)苯甲醛的含量進(jìn)行測(cè)定。

按照“1.2.2”項(xiàng)下操作制備苯甲醛對(duì)照品溶液，亦用外標(biāo)對(duì)照法計(jì)算，結(jié)果顯示苯甲醇中苯甲醛的相對(duì)含量在0.07% ～0.08%，其限度符合藥典規(guī)定。經(jīng)考察苯甲醛在0.5～5 μL／L范圍內(nèi)的峰面積Y和濃度X的線性方程為 Y＝ 3 285.2X＋53.643（R2＝0.998 6）。

3 結(jié)論

1）由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可看出，本次實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)便、提取液干擾少、分離度高、重復(fù)性好，適合用于黃體酮注射液中苯甲醇的含量測(cè)定。

2）苯甲醇作為注射劑中最為常用的抑菌劑之一，連續(xù)的肌肉注射會(huì)使局部產(chǎn)生硬結(jié)從而影響藥物吸收。因不同廠家的生產(chǎn)工藝不同，不同注射劑中苯甲醇的含量相差會(huì)較大。一般情況下，苯甲醇在注射劑中的加入量為1% ～2%［9］。從此次實(shí)驗(yàn)樣品檢測(cè)的結(jié)果來看，該樣品不同批號(hào)的黃體酮注射液中苯甲醇的含量均符合規(guī)定。