激光顯微切割條斑紫菜葉狀體的參數(shù)優(yōu)化*

曹逸飛, 李小姣, 曲偉華, 茅云翔，2**, 杜國(guó)英**

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院， 山東 青島 266003； 2. 海南熱帶海洋學(xué)院水產(chǎn)與生命學(xué)院， 海南 三亞 572022)

條斑紫菜是重要的經(jīng)濟(jì)海藻之一，為大型多細(xì)胞紅藻，其葉狀體具有精子囊、果孢、營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞等多種組織分化。紫菜中分離細(xì)胞有多種辦法：酶解法，即用海螺酶酶解紫菜獲取原生質(zhì)體，海螺酶是研磨粒蠑螺消化腺制成的粗酶液[1]，這種粗酶液是一種沒有準(zhǔn)確成分的混合物，酶解效率不穩(wěn)定且酶解原生質(zhì)體發(fā)育成葉狀體細(xì)胞比例較低；機(jī)械破碎[2]和氧化脅迫法[3]，通過迫使紫菜碎片放散無性的單孢子獲得分離的細(xì)胞，單孢子可再發(fā)育成葉狀體。這些方法多是進(jìn)行大量紫菜處理，其目的是獲取大量單孢子而非分離特定細(xì)胞，而分離特定細(xì)胞時(shí)往往進(jìn)行手工切割[4]，由于實(shí)驗(yàn)人員的操作水平和設(shè)備條件限制，往往會(huì)引入雜質(zhì)或者取材不均一。目前高等植物中常用激光顯微切割技術(shù)(Laser Microdessection，LMD)從樣品中精確分離特定組織或細(xì)胞類型的目的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

本研究中使用的LMD系統(tǒng)型號(hào)為L(zhǎng)eica LMD 7000，由德國(guó)Leica公司制造生產(chǎn)。該系統(tǒng)采用正置顯微鏡，利用電腦精確控制的355 nm紫外顯微激光光束切割樣品，收集系統(tǒng)使用樣品自身重力收集，不需要借助其他任何裝置，同時(shí)減少了實(shí)驗(yàn)消耗并避免了污染，并可搭載不同類型載物系統(tǒng)完成不同實(shí)驗(yàn)。由于該系統(tǒng)只能切割單層細(xì)胞，目前多使用石蠟、冷凍切片技術(shù)以滿足單層細(xì)胞樣品制備，且需要進(jìn)行染色處理從而提高不同細(xì)胞類型的辨識(shí)程度，最低可分離直徑1 μm的樣品[5]。固定與染色處理都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，因此LMD多用于動(dòng)植物轉(zhuǎn)錄組、基因組研究以及少量無需進(jìn)行固定、染色的動(dòng)物、微生物成活細(xì)胞團(tuán)分離，在藻類中鮮有應(yīng)用。條斑紫菜具有單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)、組織形態(tài)特征明顯，無需額外進(jìn)行切片、固定和染色的優(yōu)勢(shì)，具備經(jīng)過制片與切割流程的優(yōu)化分離成活細(xì)胞的可行性。運(yùn)用LMD技術(shù)分離的細(xì)胞團(tuán)可用于多種后續(xù)研究，如精確分離不同品系紫菜的精子囊與果胞進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)；精確分離不同部位、不同時(shí)期、不同類型的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞發(fā)育、生長(zhǎng)速率測(cè)定等實(shí)驗(yàn)。

本研究系藻類中首次應(yīng)用LMD技術(shù)從樣品中分離活細(xì)胞團(tuán)，擬從條斑紫菜制片方法、干燥時(shí)間、切割參數(shù)、切割直徑等方面建立各種類型細(xì)胞團(tuán)所適用的切割參數(shù)體系。為評(píng)估切割后的細(xì)胞受激光脅迫程度，本研究采用無損的葉綠素?zé)晒怙@微成像技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的光合活性，結(jié)合細(xì)胞成活率共同作為細(xì)胞活力的指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

室內(nèi)培養(yǎng)條斑紫菜純系RZ(PYL201306-440)，取長(zhǎng)度約3 cm、寬度約0.5 cm的幼苗葉狀體，長(zhǎng)度約25～30 cm、寬度約4～5 cm的成熟葉狀體。培養(yǎng)條件為：溫度10 ℃，光強(qiáng)60 μmol photons·m-2·s-1，光暗比L∶D=12 h∶12 h。切割前培養(yǎng)于2 L通氣瓶中，切割后的細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)于自制的腔室載玻片中。

1.2 樣品前處理及制片

取生長(zhǎng)狀況良好長(zhǎng)勢(shì)相似的條斑紫菜葉狀體，在干凈的滅菌海水中漂洗表面可能附著的多余鹽分及雜質(zhì)，用鑷子將葉狀體撕成含有目的細(xì)胞的小碎片。在鋼框載玻片薄膜中央滴加100 μL滅菌海水，將葉狀體均勻展平，盡量多吸去水分，以免水分吸收激光能量造成切割困難。

1.3 激光顯微切割處理

1.3.1 不同干燥時(shí)間 在干燥15、30、45、60、90 min(從制片完成開始計(jì)時(shí))時(shí)切割直徑為300 μm的成熟條斑紫菜營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞團(tuán)，每株紫菜在臨近區(qū)域切割五次，五次平行實(shí)驗(yàn)(各樣品切割均提前在非目的區(qū)域進(jìn)行預(yù)切割，篩選出適合當(dāng)次切割的較小激光能量，最大程度減少激光能量對(duì)細(xì)胞的損傷，下同)。

1.3.2 不同材料 選擇成熟、幼苗條斑紫菜頂部(將紫菜沿縱軸平均劃分為10部分，取最頂端)和基部(取最底端)的中央(將紫菜沿橫軸平均劃分為5部分，取最中心部分)與邊緣(取最外側(cè)部分)位置細(xì)胞，切割直徑300 μm的細(xì)胞團(tuán)，每株紫菜在臨近區(qū)域切割五次，五次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 不同切割直徑 選取成熟條斑紫菜頂部細(xì)胞與幼苗條斑紫菜基部細(xì)胞，分別在6.3、10、20倍鏡下切割直徑300和200 μm細(xì)胞團(tuán)；在6.3、10、20、63倍鏡下切割直徑150和100 μm細(xì)胞團(tuán)，每株紫菜在臨近區(qū)域切割五次，五次平行實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞成活率測(cè)定

分別統(tǒng)計(jì)細(xì)胞團(tuán)中成活細(xì)胞數(shù)量與細(xì)胞總量，切割邊緣的破碎細(xì)胞不納入統(tǒng)計(jì)范圍。細(xì)胞成活率=(成活細(xì)胞/細(xì)胞總量)×100%。

1.5 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定

顯微切割條斑紫菜獲得的細(xì)胞團(tuán)(見表1)，應(yīng)用葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)測(cè)定光合活性。測(cè)定前暗適應(yīng)20 min，由于直接在載玻片上進(jìn)行制片，水分含量低，極易蒸發(fā)從而引起細(xì)胞的失水脅迫，進(jìn)行影響測(cè)量結(jié)果。為避免細(xì)胞失水，直接對(duì)腔室載玻片中培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行測(cè)定，可為細(xì)胞提供穩(wěn)定的液體環(huán)境且便于后續(xù)培養(yǎng)或者連續(xù)觀察，最大程度確保測(cè)量的準(zhǔn)確性。使用顯微多光譜熒光動(dòng)態(tài)成像與光譜分析系統(tǒng)(Fluorescence kinetic microscopy，F(xiàn)KM，捷克PSI)，于40倍顯微鏡頭下，對(duì)細(xì)胞團(tuán)內(nèi)部活細(xì)胞密集區(qū)進(jìn)行熒光淬滅曲線(Quenching curve)測(cè)定，程序設(shè)定如下：

表1 顯微切割樣品

FlasheBlue=8，ActinicBlue=20；FlashGreen=0，ActinicGreen=0；FlashRed=0，ActinicRed=0；FlashDRED=0，ActinicDRED=0；FlashFAR=0，ActinicFAR=0；Super=35，Sensitivity=35；Act1=20，Shutter=2。

培養(yǎng)24 h后再次進(jìn)行測(cè)量，對(duì)照組設(shè)置為未經(jīng)切割的同株紫菜臨近部位。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)變化

高能激光能量切割時(shí)的局部的高溫和高光強(qiáng)會(huì)對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重的損傷，且越靠近切割邊緣影響程度越深。切割后的細(xì)胞團(tuán)內(nèi)細(xì)胞可分為三類：死亡細(xì)胞、受損細(xì)胞、成活細(xì)胞(見圖1)。死亡細(xì)胞內(nèi)容物流出，細(xì)胞形狀變?yōu)椴灰?guī)則多邊形，透光度增加，細(xì)胞變透明。受損細(xì)胞體積增大，色素體無法清楚觀察。成活細(xì)胞維持原有細(xì)胞形態(tài)，呈圓形，顏色深，可以清楚觀察到中心色素體。

(a. 成活細(xì)胞；b. 死亡細(xì)胞；c. 受損細(xì)胞。a. Living cell; b. Dead cell; c. Damaged cell.)

2.2 干燥時(shí)間對(duì)細(xì)胞成活率影響

經(jīng)過不同時(shí)間干燥處理后，切割獲得的直徑300 μm的成熟紫菜細(xì)胞團(tuán)成活率見圖2。在制片后短時(shí)間內(nèi)，由于細(xì)胞內(nèi)的自由水與制片時(shí)無法避免帶入的水分會(huì)吸取大量激光能量，并且還可能偏折激光，致使無法完成切割過程。細(xì)胞成活率隨干燥時(shí)間延長(zhǎng)下降，干燥45 min后成活率大幅度下降。為保證較高的細(xì)胞成活率，通常在30 min內(nèi)完成切割流程。

圖2 不同干燥時(shí)間對(duì)細(xì)胞成活率影響

2.3 材料選擇對(duì)細(xì)胞成活率影響

切割所得直徑300 μm的不同類型紫菜細(xì)胞團(tuán)成活率見圖3。精子囊細(xì)胞成活率可達(dá)到(81.5±6.0)%；成熟紫菜頂部中央細(xì)胞與邊緣細(xì)胞成活率分別(62.8±22.3)%、(48.8±15.3)%；紫菜幼苗基部中央細(xì)胞與邊緣細(xì)胞成活率分別為(35.8±12.3)%、(29.6±11.3)%；其他組別細(xì)胞成活率均低于20%。不同類型的細(xì)胞團(tuán)成活率由高至低為：精子囊、成熟紫菜頂部、紫菜幼苗基部、成熟紫菜基部、幼苗頂基部，相同區(qū)域的中央與邊緣細(xì)胞切割后成活率相近。

(M=成；T=頂；C=中；E=邊；B=底；S=幼；Spe=精子囊。M=mature；T=top；C=center；E=edge；S=seedlin；B=botom；Spe=spermatangium.)

2.4 切割直徑對(duì)細(xì)胞成活率影響

成熟條斑紫菜在6.3倍鏡下切割所有細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞幾乎全部死亡，10倍鏡僅適用于直徑300 μm以上細(xì)胞團(tuán)切割，細(xì)胞成活率高于30%，20倍鏡適用于直徑150～300 μm細(xì)胞團(tuán)切割，細(xì)胞成活率在(27±6.37)%～(37.2±6.24)%之間，63倍鏡是唯一適用于切割直徑100 μm細(xì)胞團(tuán)的參數(shù)選擇，細(xì)胞成活率為(9.98±3.82)%，其余倍鏡下的細(xì)胞幾乎全部死亡，僅20倍鏡下有微量細(xì)胞存活，成活率為(0.67±0.32)%(見圖4A)。幼苗紫菜在低倍鏡下具有更高的成活率。在6.3倍鏡下切割直徑200～300 μm細(xì)胞團(tuán)成活率在7.3%～24.3%之間；10倍鏡是最適用于幼苗紫菜切割的參數(shù)選擇，切割直徑300、200 μm細(xì)胞團(tuán)的成活率為(39.7±15.1)%、(19.7±7.0)%，且10倍鏡是唯一能切割直徑150 μm幼苗紫菜細(xì)胞團(tuán)的選擇，但細(xì)胞成活率較低為(3.3±0.15)%；20倍鏡下切割直徑200、300 μm細(xì)胞團(tuán)成活率略低于6.3倍鏡；而直徑100 μm的細(xì)胞團(tuán)在各個(gè)倍鏡下均全部死亡(見圖4B)。

(A. 成熟條斑紫菜；B. 幼苗條斑紫菜。A. Mature P. yezoensis; B. Seeding P. yezoensis.)

2.5 細(xì)胞團(tuán)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)

2.5.1Fv/Fm變化Fv/Fm為暗適應(yīng)后的最大原初光量子效率，反應(yīng)植物的最大光合效能。成熟條斑紫菜Fv/Fm為0.29±0.028，幼苗條斑紫菜Fv/Fm為0.37±0.013，24 h后再次測(cè)量同一部位Fv/Fm數(shù)值基本保持穩(wěn)定(見圖5)。成熟紫菜切割細(xì)胞團(tuán)Fv/Fm均發(fā)生顯著(p<0.05)下降。其中300 μm基部與頂部細(xì)胞團(tuán)、150 μm基部與頂部細(xì)胞團(tuán)、100 μm頂部細(xì)胞團(tuán)可以維持一定水平的Fv/Fm，較對(duì)照組分別下降約79.9%、58.9%、57.9%、31.4%、76.6%。培養(yǎng)24 h后，300 μm基部與頂部細(xì)胞團(tuán)較培養(yǎng)前升高53.6%、90.0%；150 μm基部細(xì)胞較培養(yǎng)前升高33%。其他組別上升幅度均小于20%。幼苗紫菜細(xì)胞團(tuán)則在低倍鏡下能維持較高水平的Fv/Fm，400與300 μm細(xì)胞團(tuán)Fv/Fm下降均不超過27%。培養(yǎng)24 h后，300 μm頂部細(xì)胞較培養(yǎng)前上升22.6%，其他組別上升幅度均小于20%。

(基Bottom；頂Top。A. 成熟條斑紫菜；B.幼苗條斑紫菜。6.3倍鏡切割直徑400 μm、10倍鏡300 μm、20倍鏡150 μm、63倍鏡100 μm。表示差異性顯著，P≤0.05；表示差異性極顯著，P≤0.01。A. Mature P. yezoensis; B. Seeding P. yezoensis. 6.3 len means 400 μm dissection diameter;10 len means 300 μm dissection diameter; 20 len means 150 μm dissection diameter; 63 len means 100 μm dissection diameter, similarly hereinafter. means significant difference, P≤0.05；means hishly significant difference, P≤0.01.)

2.5.2Y(Ⅱ)變化Y(Ⅱ)即光穩(wěn)態(tài)下實(shí)際光量子效率,它可以反映有熱損耗存在時(shí)，PSⅡ反應(yīng)中心完全開放時(shí)的光化學(xué)效率。成熟與幼苗條斑紫菜對(duì)照組的Y(Ⅱ)均為0.1±0.01，培養(yǎng)24 h后仍均為0.1±0.01(見圖6)。各材料組別變化趨勢(shì)與Fv/Fm變化一致。

(基Bottom；頂Top。A. 成熟條斑紫菜；B. 幼苗條斑紫菜。倍鏡與直徑關(guān)系及含義見圖5。 A. Mature P. yezoensis; B. Seeding P. yezoensis. The corresponding relation between lens and diameter and the meoring of is shown in the Fig.5.)

成熟紫菜300 μm基部與頂部細(xì)胞團(tuán)、150 μm基部與頂部細(xì)胞團(tuán)、100 μm頂部細(xì)胞團(tuán)可以維持一定水平的Y(Ⅱ)。培養(yǎng)24 h后，多個(gè)組別發(fā)生較大幅度上升， 其中150 μm頂部細(xì)胞團(tuán)上升幅度最高約為95.6%。幼苗紫菜400與300 μm細(xì)胞團(tuán)以及150 μm基部細(xì)胞團(tuán)保持較高水平的Y(Ⅱ)，且恢復(fù)培養(yǎng)后上升幅度較小。

2.5.3qN變化qN即非光化學(xué)淬滅，可以反映植物耗散過剩光能為熱的能力。成熟與幼苗條斑紫菜對(duì)照組qN分別為0.34±0.59、0.28±0.029；培養(yǎng)24 h后分別為0.33±0.034、0.28±0.033(見圖7)。成熟條斑紫菜300 μm頂部、150 μm基部與頂部細(xì)胞團(tuán)較對(duì)照組無顯著上升，300 μm細(xì)胞團(tuán)基部細(xì)胞上升33.4%。幼苗條斑紫菜400與300 μm細(xì)胞團(tuán)qN均保持原有水平甚至部分組別略有下降，150 μm細(xì)胞團(tuán)基部細(xì)胞較對(duì)照組上升44.2%。培養(yǎng)24 h后，除幼苗紫菜400 μm細(xì)胞團(tuán)頂部細(xì)胞較培養(yǎng)前上升29.2%，其他各組別變化均在20%以內(nèi)。

(基Bottom；頂Top。A. 成熟條斑紫菜；B. 幼苗條斑紫菜。倍鏡與直徑關(guān)系見圖5。 A. Mature P. yezoensis; B. Seeding P. yezoensis.The corresponding relation between lens and diameter is shown in the Fig.5.)

2.5.4qP變化qP即光穩(wěn)態(tài)光適應(yīng)光化學(xué)淬滅，可以反映PSⅡ聚光色素吸收光能用于電子傳遞所占份額。成熟條斑紫菜對(duì)照組qP為0.41±0.067，幼苗紫菜qP為0.29±0.028；培養(yǎng)24 h后分別為0.42±0.097、0.30±0.034(見圖8)。與對(duì)照組qP相比，成熟條斑紫菜除300 μm基部細(xì)胞團(tuán)，150 μm頂部與基部細(xì)胞團(tuán)下降幅度幅度較小外，100 μm頂部細(xì)胞團(tuán)下降50.7%。而幼苗紫菜同樣在400與300 μm細(xì)胞團(tuán)基本保持原有qP水平，150 μm細(xì)胞團(tuán)基部細(xì)胞較對(duì)照組下降51.0%，頂部細(xì)胞下降62.3%。培養(yǎng)24 h后，各組別變化幅度均不超過20%。

(基Bottom；頂Top。A. 成熟條斑紫菜；B. 幼苗條斑紫菜。倍鏡與直徑關(guān)系見圖5。 A. Mature P. yezoensis; B. Seeding P. yezoensis.The corresponding relation between lens and diameter is shown in the Fig.5.)

3 討論

激光顯微切割儀本質(zhì)上是以紫外激光作為能量，以細(xì)胞自身重力進(jìn)行收集的機(jī)械切割方法，被切割細(xì)胞的受傷程度，由外向內(nèi)逐漸減少。通常而言，細(xì)胞成活率隨切割直徑升高而升高。研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)切割直徑超過400 μm時(shí)，細(xì)胞團(tuán)自身重力較大，在切割還未完成時(shí)，細(xì)胞團(tuán)已切割部分會(huì)發(fā)生卷曲，激光極易對(duì)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行二次切割，嚴(yán)重降低細(xì)胞的成活率。Podgorny等[6]利用LMD分離直徑200～600 μm的成活HeLa細(xì)胞，Zhou等[7]利用LMD分離的成活擬南芥平均直徑約為500 μm，而本研究提供直徑100～400 μm的切割方案，可以分離成活同質(zhì)細(xì)胞。

水分和激光能量相互拮抗，高含水量幫助細(xì)胞吸收激光灼燒產(chǎn)生的高溫，避免失水脅迫，提高細(xì)胞的成活率，但由于自由水和結(jié)合水中含有的微小顆粒對(duì)激光具有吸收和散射作用[8]，又要求使用較高的能量才能成功切割樣品，反過來又會(huì)降低細(xì)胞成活率。條斑紫菜是潮間帶生物，自然條件下可以干露10 h以上[9]，但在顯微鏡的近距離光照下，干燥超過1 h再進(jìn)行切割，細(xì)胞幾乎全部死亡，考慮到切割多個(gè)樣品的操作時(shí)間，通常干燥15 min即可開始切割，總切割時(shí)間控制在30 min之內(nèi)。具體切割參數(shù)與材料批次，空氣濕度、溫度等有關(guān)，切割前應(yīng)在非目的區(qū)域進(jìn)行試切割，調(diào)整選擇適合的參數(shù)。

實(shí)際切割過程中發(fā)現(xiàn)，不同倍鏡不僅是視野改變，同樣的激光參數(shù)，其切割能力也會(huì)改變，不同儀器設(shè)備之間同樣可能具有差異，本研究?jī)H從本儀器進(jìn)行討論。據(jù)觀察，激光在6.3、10倍鏡下的發(fā)散程度明顯高于20、63倍鏡。在切割能力相同的條件下，激光能量越發(fā)散，相應(yīng)的激光強(qiáng)度越高，因此需要比較不同倍鏡下切割相同直徑細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞成活率。研究表明，6.3倍鏡適合切割直徑300 μm以上細(xì)胞團(tuán)，10倍鏡適合切割300 μm以上細(xì)胞團(tuán)，20倍鏡適合切割150～300 μm細(xì)胞團(tuán)，63倍鏡適合切割100-150 μm細(xì)胞團(tuán)。

本研究發(fā)現(xiàn)，以各類型細(xì)胞所適用的低能量參數(shù)分離的成熟、幼苗紫菜頂部、基部細(xì)胞成活率具有明顯不同，這可能與細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞分布、細(xì)胞抗逆性等多種因素有關(guān)。楊曉玲等研究表明，紫菜基部細(xì)胞的直徑及細(xì)胞壁厚度高于頂部細(xì)胞，且成熟紫菜細(xì)胞直徑及細(xì)胞壁厚度高于幼苗紫菜[10]?？傮w而言，成熟紫菜的細(xì)胞成活率高于幼苗紫菜，這與用刀片進(jìn)行進(jìn)行機(jī)械切割的結(jié)論相符[11]。具體分析這種現(xiàn)象的可能原因：在6.3、10倍鏡下切割要求使用較高的激光能量，能量對(duì)細(xì)胞成活率起到主導(dǎo)作用。成熟細(xì)胞細(xì)胞壁厚，細(xì)胞體積大含水量高，需要進(jìn)一步提高能量，最終導(dǎo)致切割后的細(xì)胞幾乎全部死亡；而幼苗紫菜則可使用較低能量進(jìn)行切割，內(nèi)層細(xì)胞受激光輻射影響較輕微，僅外緣細(xì)胞死亡。在20、63倍鏡下激光能量集中，無需高強(qiáng)度能量即可完成切割，但由于切割直徑減少，內(nèi)層細(xì)胞同樣會(huì)受到較強(qiáng)的影響，此時(shí)細(xì)胞自身的抗逆性起到主導(dǎo)作用。成熟紫菜細(xì)胞的抗逆性強(qiáng)，細(xì)胞成活率較高，63倍鏡100 μm切割條件下，頂部細(xì)胞團(tuán)中央細(xì)胞仍存活，但基部細(xì)胞全部死亡，其原因可能是基部細(xì)胞體積大，每個(gè)細(xì)胞都有部分位于外緣位置，受損嚴(yán)重導(dǎo)致細(xì)胞死亡；幼苗紫菜頂部細(xì)胞在20倍鏡150 μm條件下幾乎全部死亡，而基部細(xì)胞由于細(xì)胞體積大，具有較強(qiáng)抗逆性得以成活，但63倍鏡100 μm切割條件下幼苗紫菜全部死亡。

在激光切割后，F(xiàn)v/Fm、Y(Ⅱ)、qP大多發(fā)生顯著下降，qN發(fā)生顯著上升，該變化趨勢(shì)與其他失水[12]、高溫[13]、高光[14]脅迫下的變化趨勢(shì)一致。部分受損嚴(yán)重的細(xì)胞團(tuán)，其Fv/Fm、Y(Ⅱ)、qP測(cè)量值接近0，qN測(cè)量值接近1，細(xì)胞的PSⅡ反應(yīng)中心完全關(guān)閉，與黃磊等人測(cè)量受到嚴(yán)重高溫脅迫的藍(lán)莓細(xì)胞一致[15]。細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)24 h再次測(cè)量，F(xiàn)v/Fm、Y(Ⅱ)、qP大多上升，qN下降，變動(dòng)幅度大多在20%以內(nèi)，這種差異可能是實(shí)驗(yàn)誤差造成的。但變化幅度超過20%的測(cè)量組如300 μm成熟細(xì)胞Fv/Fm、Y(Ⅱ)，400 μm幼苗基部細(xì)胞qP、300 μm成熟頂細(xì)胞qN等變化可能與受損細(xì)胞培養(yǎng)后恢復(fù)光合活性有關(guān)。這些變化幅度較大的細(xì)胞團(tuán)均具有較高的細(xì)胞成活率，所受的激光脅迫均在細(xì)胞自我保護(hù)能力限度內(nèi)。這種細(xì)胞自我修復(fù)引起的葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化與黃純倩等[16]、Akbar等[17]趨勢(shì)一致。本研究中，F(xiàn)v/Fm、Y(Ⅱ)的變化趨勢(shì)明顯，是反映細(xì)胞受損程度的靈敏指標(biāo)，該參數(shù)也常用于其他紫菜脅迫實(shí)驗(yàn)中[18-19]，但Fv/Fm、Y(Ⅱ)會(huì)在培養(yǎng)后發(fā)生較大改變，部分組別甚至發(fā)生90%以上程度的上升現(xiàn)象，建議培養(yǎng)至少24 h后再進(jìn)行測(cè)量，獲得較為準(zhǔn)確的細(xì)胞光合活性。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究首次在條斑紫菜中應(yīng)用激光顯微切割技術(shù)，建立了利用激光顯微切割技術(shù)分離成活紫菜細(xì)胞的流程，為紫菜的細(xì)胞分離提供了精確、快捷的全新方法。結(jié)合細(xì)胞成活率與葉綠素?zé)晒鈪?shù)評(píng)價(jià)切割細(xì)胞團(tuán)活力，結(jié)果表明：成熟條斑紫菜適宜在高倍鏡(如20、63倍鏡)下分離直徑100～300 μm細(xì)胞團(tuán)；幼苗條斑紫菜適宜在低倍鏡(如6.3、10倍鏡)下分離直徑200～400 μm細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞成活率可到達(dá)20%～60%，細(xì)胞的光合活性可達(dá)到原有水平的40%～100%。