海南三七根莖芽基部的組培快繁

李冬梅+趙超藝+劉小飛

摘 要 以海南三七根莖芽基部為外植體，對(duì)根莖芽基部進(jìn)行初代誘導(dǎo)、繼代增殖、生根壯苗培養(yǎng)，并對(duì)其組培苗移栽基質(zhì)進(jìn)行篩選，建立海南三七根莖芽基部的組培快繁技術(shù)體系。結(jié)果表明：根莖芽基部最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%椰汁；繼代增殖比較合適的培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0～8.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%椰汁；生根最佳的培養(yǎng)基為MS+ NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%香蕉泥+活性碳1.0 g/L；組培苗移栽合適的基質(zhì)為進(jìn)口泥炭、紅壤和腐葉土的混合基質(zhì)或純進(jìn)口泥炭。

關(guān)鍵詞 海南三七 ；山奈屬 ；基部 ；根莖 ；組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào) S567.23+6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.09.007

Rapid Propagation of Kaempferia rotunda via Basal Part of Rhizome Buds

LI Dongmei ZHAO Chaoyi LIU Xiaofei

（Environmental Horticulture Research Institute，

Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510640）

Abstract The basal part of rhizome buds of Kaempferia rotunda were used as explants which were induced into calli， subcultured for proliferation and rooted to produce rooted strong plants， and their mediums for tissue culture and transplanting were screened to establish a rapid propagation system for K. rotunda. The results showed that the inducing medium MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3% sucrose + cara rubber powder 10.0 g/L+10% coconut milk was optimum for the basal parts of rhizome buds. The optimum subculture medium for proliferation was MS+6-BA 3.0-8.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3% sucrose + cara rubber powder 10.0 g/L+10% coconut milk. The optimum rooting medium was MS+NAA 0.10 mg/L+3% sucrose + cara rubber powder 10.0 g/L+10% mashed banana + activated carbon 1.0 g/L. The optimum transplanting substrate included red soil， humus soil and imported peat， or pure imported peat.

Keywords Kaempferia rotunda ； Kaempferia ； base ； rhizome ； propagation

姜科（Zingiberaceae）植物可通過(guò)種子有性繁殖和切分根莖營(yíng)養(yǎng)繁殖[1]。然而，有些種類是自交不親和的，有些是多倍體，均不能結(jié)種子，只能通過(guò)根莖繁殖[1]。切分根莖分株時(shí)，不要分得太小，一般不要少于3～4顆，太少會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢或死亡，同時(shí)需要帶有新生的塊莖，新分開(kāi)的塊莖需去掉所有莖、葉，以減少水分的流失[1]。有些屬的植物可以通過(guò)莖桿扦插來(lái)繁殖，如閉鞘姜屬、舞花姜屬、姜花屬、姜屬的部分種類，將成熟的莖桿切成帶3～4個(gè)節(jié)的莖段，直立插入沙土中2節(jié)深，或?qū)⑶o段平放，用沙土稍微覆蓋，保持濕潤(rùn)和遮蔭，一段時(shí)間后，其節(jié)上的芽就會(huì)萌蘗形成小植株，稍大后分離栽培[1]。

海南三七（Kaempferia rotunda）屬于姜科山奈屬（Kaempferia）植物，分布于廣東、廣西、云南、臺(tái)灣及亞洲南部至東南部[2]，其葉叢生，葉片長(zhǎng)橢圓形，葉面淡綠色，具暗綠色斑紋，不耐霜凍，冬季地上部分枯死；花先于葉直接從根莖抽出，頭狀花序具4～6朵花（白色），唇瓣較大（紫紅色），花期3～4個(gè)月；根莖有消腫止痛的功效。觀葉類，株形好，葉漂亮，花晶瑩美麗，在夏秋季節(jié)可作為觀賞價(jià)值高的室內(nèi)觀葉植物[1-4]。由于海南三七不結(jié)果，所以不能進(jìn)行有性繁殖，而且它也沒(méi)有莖桿，因此，只能采用上述的切分根莖進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖。因?yàn)槟副玖坎蛔悖蟹指o分株繁殖速度有限，而且對(duì)母株的損傷也很大，短期內(nèi)得不到大量植株。

近年來(lái)，不少科研工作者對(duì)海南三七的揮發(fā)性成分、保育、花粉發(fā)育、傳粉、組培快繁等方面進(jìn)行了研究，并取得了較大進(jìn)展[5-10]。劉盼盼[9]研究表明，海南三七最佳的外植體為組培苗的幼芽或莖尖，將其接種于MS+6-BA 3.0 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L的培養(yǎng)基中，20 d左右有愈傷組織產(chǎn)生，30 d左右有絨毛狀根生成；但研究也發(fā)現(xiàn)，接種到2種培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0/3.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L上誘導(dǎo)，均只有10%被誘導(dǎo)成苗。吳丹[10]研究表明，海南三七無(wú)菌苗的假莖基部在暗培養(yǎng)條件下能夠獲得高質(zhì)量的愈傷組織，最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合為6-BA 2.0 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L，但從外植體誘導(dǎo)出愈傷到分化成苗就需時(shí)110 d，周期長(zhǎng)，每塊愈傷分化成2.38～3.75棵苗。為了建立更優(yōu)良的海南三七組培快繁體系，本研究以海南三七的根莖芽基部為外植體，進(jìn)行了叢生芽誘導(dǎo)、繼代增殖、生根培養(yǎng)和組培苗移栽等系列研究，建立了高效穩(wěn)定的海南三七組培擴(kuò)繁體系，為海南三七種苗的工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

用自來(lái)水將從野外采集的海南三七根莖清洗干凈，剪掉貯藏根和須根后，放入質(zhì)量濃度0.1%的多菌靈可濕性粉劑溶液中浸泡消毒30 min，然后取出晾干表面水分（圖1-A）；再放入經(jīng)洗凈消毒的河沙中恒溫發(fā)芽，洗凈后取其根莖上長(zhǎng)出的芽（圖1-B）。

1.2 方法

1.2.1 外植體處理

將海南三七的根莖芽用自來(lái)水洗凈，以質(zhì)量百分比濃度計(jì)，先用0.1%高錳酸鉀溶液浸泡根莖芽30 min，再用0.1%的百菌清溶液浸泡根莖30 min；接著在自來(lái)水下反復(fù)沖洗根莖芽30 min；晾干表面水分后，在超凈工作臺(tái)上，切掉根莖芽上的葉片和莖尖，留約2～3 cm高的根莖芽基部；用棉球蘸取70%酒精擦拭芽基部，最后用0.1%升汞溶液消毒15～18 min，滅菌水沖洗4～5次，切掉距離芽基部?jī)啥烁骷s0.3～0.5 cm之外的部分，留約1～2 cm的芽基部，并將芽基部接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

1.2.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室各階段溫度為25～30℃，光照強(qiáng)度為2 000～2 300 lx，光照時(shí)間控制為14 h/d。

1.2.3 試驗(yàn)培養(yǎng)基配方

（1）初代誘導(dǎo)培養(yǎng)。試驗(yàn)了3種芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：（A1）MS，pH 5.8；（A2）MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%椰汁，pH 5.8；（A3）MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%椰汁，pH 5.8。60 d后統(tǒng)計(jì)接種的外植體啟動(dòng)率和出芽指數(shù)，啟動(dòng)率=（啟動(dòng)的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%；出芽指數(shù)：所有外植體上出芽數(shù)的平均數(shù)。

（2）繼代增殖培養(yǎng)。當(dāng)初代芽基部叢生芽長(zhǎng)至4～7 cm時(shí)，切下芽，截取芽基部1.0～1.5 cm接種到增殖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)叢生芽。試驗(yàn)了3種增殖培養(yǎng)基：（B1）MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%椰汁，pH 5.8；（B2）MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%椰汁，pH 5.8；（B3）MS+6-BA 8.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%椰汁，pH 5.8。每個(gè)處理接種20個(gè)芽基部，重復(fù)3次，25 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)，增殖系數(shù)=統(tǒng)計(jì)的總芽數(shù)/接種的總芽數(shù)。

（3）生根培養(yǎng)。選擇苗高4～6 cm的組培苗接入生根培養(yǎng)基中，每處理各接6瓶，每瓶接6株，重復(fù)3次。采用以下3種培養(yǎng)基進(jìn)行海南三七組培苗的生根培養(yǎng)：（C1）MS+活性碳1.0 g/L，pH 5.8；（C2）MS+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+活性碳1.0 g/L，pH 5.8；（C3）MS+ NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%香蕉泥+活性碳1.0 g/L，pH 5.8。分別在20 d后統(tǒng)計(jì)生根率和單苗平均根數(shù)，生根率=（生根的芽苗數(shù)/接種芽苗總數(shù)）×100%；單苗平均根數(shù)=總的根數(shù)/生根的苗數(shù)。

1.2.4 組培苗的移栽

當(dāng)生根培養(yǎng)基上的苗長(zhǎng)至5～7 cm時(shí)，在溫室自然光照下煉苗7～10 d；取出組培苗，洗凈根部培養(yǎng)基，用0.1%的百菌清溶液浸泡30 min，移栽到如下基質(zhì)：（1）紅壤；（2）腐葉土∶紅壤=1∶1（V∶V）；（3）進(jìn)口泥炭：紅壤=1∶1（V∶V）；（4）進(jìn)口泥炭∶紅壤∶腐葉土=1∶1∶1（V∶V∶V）；（5）進(jìn)口泥炭。統(tǒng)計(jì)成活率和觀察長(zhǎng)勢(shì)，成活率=成活的苗數(shù)/種的苗數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用excel 2016和SPSS16.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 海南三七根莖芽基部的初代誘導(dǎo)

從表1可看出，不同的激素種類和濃度對(duì)根莖芽基部叢生芽的啟動(dòng)有著明顯的影響。其中，在A3培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，經(jīng)約20 d培養(yǎng)，能觀察到肉眼可見(jiàn)的綠點(diǎn)（圖2-A）；至離體培養(yǎng)60 d左右時(shí)，出芽指數(shù)達(dá)4.60，啟動(dòng)率為98.50%，大部分外植體可以分化出3～5個(gè)叢生芽，長(zhǎng)勢(shì)較好，是各處理中的最適培養(yǎng)基（圖2-B）。此外，A2處理的啟動(dòng)率和出芽指數(shù)也較高，次于A3；A1處理的啟動(dòng)率最低，芽分化得慢，可能是因?yàn)闆](méi)有添加椰汁和外源激素。

2.2 叢生芽增殖培養(yǎng)

不同激素濃度對(duì)海南三七根莖芽基部增殖培養(yǎng)的影響見(jiàn)表2。從表2可看出，與B1相比，提高6-BA的濃度，可顯著增加叢生芽的增殖系數(shù)，其中，在B2培養(yǎng)基上經(jīng)約25 d培養(yǎng)，增殖系數(shù)為5.87，大部分叢生芽基部可分化出5～7個(gè)叢生芽，長(zhǎng)勢(shì)好（圖2-C）；在B3培養(yǎng)基上經(jīng)約25 d培養(yǎng)，增殖系數(shù)為7.56，大部分叢生芽基部可分化出6～9個(gè)叢生芽，長(zhǎng)勢(shì)好；在B1培養(yǎng)基上經(jīng)約25 d培養(yǎng)，增殖系數(shù)為4.69，大部分叢生芽基部可分化出3～5個(gè)叢生芽。因此，適合海南三七根莖芽基部增殖培養(yǎng)的6-BA濃度范圍為3.0～8.0 mg/L，在此范圍內(nèi)均有較多長(zhǎng)勢(shì)好的叢生芽。

2.3 無(wú)菌小苗生根培養(yǎng)

從表3可看出，添加NAA可促進(jìn)長(zhǎng)根，但有黃葉；同時(shí)添加NAA和香蕉泥，根和苗均粗壯，而且葉片綠色。因此，海南三七組培苗的生根培養(yǎng)中，宜選用配方C3，即MS+ NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%香蕉泥+活性碳1.0 g/L，在此配方中植株粗壯，無(wú)菌苗長(zhǎng)勢(shì)最好（圖2-D）。

2.4 海南三七組培苗移栽成活情況

將海南三七組培苗根部培養(yǎng)基洗凈并消毒（圖2-E），分別移栽至5種基質(zhì)的苗床上，經(jīng)過(guò)1個(gè)月的栽培管理，其組培苗成活率高低順序依次是：進(jìn)口泥炭（98%）>進(jìn)口泥炭∶紅壤∶腐葉土=1∶1∶1（V∶V∶V）（95%）>進(jìn)口泥炭∶紅壤=1∶1（V∶V）（80%）>腐葉土：紅壤=1∶1（V∶V）（75%）>紅壤（65%）。5種基質(zhì)中，在以進(jìn)口泥炭作為栽培基質(zhì)的苗床上成活率達(dá)98%以上（圖2-F）；其次是進(jìn)口泥炭∶紅壤∶腐葉土=1∶1∶1（V∶V∶V）的基質(zhì)，成活率達(dá)95%以上。因此，海南三七組培苗宜選用較疏松且營(yíng)養(yǎng)成分含量高的基質(zhì)，如將進(jìn)口泥炭∶紅壤∶腐葉土按一定體積混合，不宜單獨(dú)選用不透氣易板結(jié)的基質(zhì)，如紅壤。endprint

3 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，海南三七根莖芽基部可誘導(dǎo)叢生芽，誘導(dǎo)結(jié)果主要受6-BA和NAA濃度的影響，此外，是否添加附加物椰汁也會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定影響。與劉盼盼[9]和吳丹[10]的海南三七組培快繁方式不同的是，本研究不經(jīng)過(guò)愈傷組織階段，而是直接采用以芽繁芽的方式，區(qū)別于上述2種海南三七的組培快繁方式，繁殖系數(shù)顯著提高，且繁殖周期縮短，短期內(nèi)可獲得大量組培苗。此外，本研究與劉盼盼[9]和吳丹[10]均選用MS為基本培養(yǎng)基，不同的是，本研究在培養(yǎng)基中添加了椰汁，至于椰汁在叢生芽誘導(dǎo)和增殖方面的作用，尚需要做進(jìn)一步研究。

本研究也發(fā)現(xiàn)，不同栽培基質(zhì)對(duì)海南三七組培苗的成活率影響顯著。采用進(jìn)口泥炭作為基質(zhì)時(shí)，成活率最高；其次是進(jìn)口泥炭∶紅壤∶腐葉土=1∶1∶1（V∶V∶V）的混合基質(zhì)；以紅壤為基質(zhì)的成活率最低。由此可見(jiàn)，海南三七組培苗需要保水、透氣、保肥好的基質(zhì)。紅壤易板結(jié)和不透氣，導(dǎo)致成活率低；腐葉土與紅壤混合的基質(zhì)雖透氣，但保肥性差，組培苗成活率略高，但長(zhǎng)勢(shì)不好；進(jìn)口泥炭中含有保水劑且透氣，組培苗長(zhǎng)勢(shì)最好；進(jìn)口泥炭∶紅壤∶腐葉土=1∶1∶1（V∶V∶V）的混合基質(zhì)，同時(shí)具有保水肥和透氣的特點(diǎn)。因此，組培苗成活率較高，長(zhǎng)勢(shì)也好。綜合經(jīng)濟(jì)和實(shí)用角度考慮，海南三七組培苗宜選用進(jìn)口泥炭、紅壤和腐葉土的混合基質(zhì)進(jìn)行栽培。

綜上所述，以海南三七根莖芽基部為外植體進(jìn)行海南三七的組培快繁，是海南三七可行的組培苗繁殖方式之一，其中最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%椰汁；繼代增殖比較合適的培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0～8.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%椰汁；最佳生根培養(yǎng)基為MS+NAA 0.10 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10.0 g/L+10%香蕉泥+活性碳1.0 g/L。組培苗移栽合適的基質(zhì)為進(jìn)口泥炭、紅壤和腐葉土的混合基質(zhì)或純進(jìn)口泥炭。

參考文獻(xiàn)

[1] 高江云，夏永梅，黃加元，等. 中國(guó)姜科花卉[M]. 北京：科學(xué)出版社，2006：128-129.

[2] 吳德鄰，陳升振，蔡希陶，等. 中國(guó)植物志（第十六卷第二分冊(cè)）[M]. 北京：科學(xué)出版社，1981：42.

[3] 路國(guó)輝，王英強(qiáng). 姜科植物花卉應(yīng)用現(xiàn)狀及開(kāi)發(fā)前景[J]. 北方園藝，2011（10）：82-86.

[4] 吳德鄰，劉 念，葉育石. 中國(guó)姜科植物資源[M]. 武漢：華中科技大學(xué)出版社，2016：107.

[5] 徐世濤，陰耕云，劉勁云，等. 海南三七的揮發(fā)性成分研究[J]. 云南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，34（6）：701-704.

[6] 劉 念. 中國(guó)姜科植物的多樣性和保育[J]. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，16（4）：7-11.

[7] 李冬麗. 姜科三種不同類型花粉發(fā)育的組織化學(xué)研究[M]. 廣州：華南師范大學(xué)，2010.

[8] 路國(guó)輝，李新亮，武文華，等. 海南三七（姜科）的食源性欺騙傳粉[J]. 廣西植物，2012，32（1）：33-39.

[9] 劉盼盼. 兩種姜科花卉的組培快繁及生長(zhǎng)調(diào)控研究[D]. 廣州：華南師范大學(xué)，2013.

[10] 吳 丹. 三種野生姜科花卉組培快繁體系的建立[D]. 廣州：華南師范大學(xué)，2014.endprint