基于衍生化GC-MS代謝組學方法 分析鳳香型年份基酒的差異

楊輝，劉麗麗，荊雄，張亞芳，徐晨，閻宗科，祁耀華

（1.陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西西安 710021）（2.陜西西鳳酒股份有限公司，陜西寶雞 721000）

白酒是我國特有的傳統酒種，它與白蘭地、威士忌、郎姆酒、伏特加和金酒共同構成了世界六大蒸餾酒[1]。中國白酒按照釀造工藝和質量特點可以 分為12種香型[2]，其中西鳳酒作為鳳香型白酒代 表，具有“濃而不艷，清而不淡”的典型風格。新蒸出的白酒通常比較辛辣暴沖，同時伴有強烈的新酒味和其他邪雜味，需要貯存口感會變得更加醇厚[3]。酒海作為西鳳酒特殊的貯酒容器，選用秦嶺山脈生長的藤條編制而成，內壁采用白棉布裹糊后以雞蛋清、豬血、石灰等螯合劑進行上百層裱糊，最后涂以菜籽油、蜂蠟等使之光滑平整。新酒在貯存過程中乙醇和水分子之間通過氫鍵作用締合形成大分子群，從而減輕乙醇對口腔的刺激，同時酒中多種呈香呈味物質之間通過發(fā)生氧化、還原、酯化、水解等一系列反應，在動態(tài)條件下逐漸趨于平衡，使得酒體形成完美膠體溶液，在提高基酒品質中發(fā)揮著非常重要的作用[4-8]。

代謝組學誕生于20世紀90年代初，是一門繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學之后迅速發(fā)展起來的新興學科，作為系統生物學的重要組成部分，已被廣泛應用于食品分析中[9-13]。如Jang等[14]對7種商業(yè)醋和2種傳統醋的代謝物譜進行分析，解釋了商業(yè)醋和傳統醋在代謝物上的差異。田宏等[15]利用代謝組學技術得到不同系列白酒的特征化合物，并用于真假酒的區(qū)分。王珂佳等[16]介紹了代謝組學技術在白酒風味物質鑒定、分析和釀造工藝優(yōu)化等方面的應用，從而揭示了代謝組學方法在白酒釀造中的重要作用。

白酒中含量最高的是乙醇和水，約占總量的98%左右，除此之外還有約2%的微量成分，這些微量成分中包括揮發(fā)性物質和非揮發(fā)性物質。目前對于白酒中揮發(fā)性物質研究比較多，如范文來等[17-19]應用頂空固相微萃取（HS-SPME），結合香味提取物稀釋技術（AEDA），以及采用氣相色譜-聞香（GC-O）與氣相色譜-質譜（GC-MS）相結合技術，對濃香型白酒中126種揮發(fā)性物質進行了定性和香氣描述。范海燕等[20]在豉香型白酒中檢測到64種香氣化合物。牛云蔚等[21]采用頂空固相微萃取、氣相色譜-嗅聞-香氣稀釋分析，結合氣相色譜-質譜對不同年份五糧液的香氣成分和關鍵香氣成分進行了分析。而對于白酒中非揮發(fā)性物質研究較少，因此本文采用硅烷衍生化方法，并結合代謝組學分析技術對不同年份鳳香型基酒進行差異性分析，以期獲得更加全面的酒類物質數據，探索鳳香型白酒在貯存過程中物質變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品準備

選取酒海貯存不同年份鳳香型基酒共6組，每組取3個平行樣品進行試驗，樣品信息和編號如下：A組（A-1、A-2、A-3）：新酒；B組（B-1、B-2、B-3）：2年基酒；C組（C-1、C-2、C-3）：3年基酒；D組（D-1、D-2、D-3）：5年基酒；E組（E-1、E-2、E-3）：7年基酒；F組（F-1、F-2、F-3）：9年基酒。

1.1.2 試驗試劑

十九碳酸，Aladdin公司；甲氧基胺鹽酸鹽、吡啶、BSTFA+TMCS、ddH2O，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；丙氨酸、纈氨酸、L-亮氨酸、脯氨酸、甘氨酸、琥珀酸、L-絲氨酸、β-丙氨酸、蘋果酸、焦谷氨酸、L-苯丙氨酸、木糖、木糖醇、葡萄糖、核糖醇、半乳糖、甘露醇、肌醇、麥芽糖、異麥芽糖、山梨糖醇、巖藻糖、4-氨基丁酸、蘇氨酸、甘油酸25種標準品，美國Sigma公司。

1.1.3 試驗設備

H1650-W冷凍離心機，湖南湘儀儀器有限公司；QL-866混勻儀，上海川翔生物科技有限公司；5305真空濃縮儀，艾本德中國有限公司；DHG-9240鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；7890A氣相色譜儀、5975C質譜儀，Agilent公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 化合物提取

移取1500 μL樣本于2 mL離心管中，渦旋振蕩1 min；加入60 μL十九碳酸（0.2 mg/mL）作為內標，渦旋振蕩60 s；真空濃縮儀濃縮至盡干；加入60 μL甲氧基胺鹽酸鹽溶液渦旋振蕩30 s，37 ℃反應2 h；最后加入60 μL BSTFA試劑（含1%三甲基氯硅烷），37 ℃條件下反應90 min；12000 r/min離心5 min，取上清液90～100 μL加入到檢測瓶中，作為待測樣；自每個待測樣本各取20 μL混合成QC樣本（用來校正混合樣品分析結果的偏差以及由于分析儀器自身原因所造成的失誤）。

1.2.2 GC-MS條件

GC條件：HP-5MS毛細管柱（5%苯/95%甲基聚硅氧烷30 m（長）×250 μm（內徑），0.25 μm（膜厚），Agilent，美國）；升溫程序：60 ℃持續(xù)2 min，以10 /min℃ 的速率上升到300 ℃，保持5 min；載氣（氦氣）流速1 mL/min，1 μL樣品以分流比20:1的方式通過自動進樣器注入。

MS條件：電子電離源；電離電壓70 eV；進樣口溫度280 ℃；傳輸線溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃；質量掃描范圍m/z35～750。

1.3 數據處理

利用R的XCMS程序包進行峰識別、峰過濾、峰對齊，得到包括質荷比和保留時間及峰面積等信息的數據矩陣；結合AMDIS程序進行代謝物的鑒定，注釋所用數據庫為NIST14商業(yè)數據庫和Wiley Registry代謝組數據庫，對數據進行峰面積的內標歸一化。通過Metabo Analyst 4.0進行多元統計分析。

2 結果與分析

2.1 樣本分析

在進行基于質譜技術的代謝組學研究時，為了獲得可靠且高質量的代謝組學數據，通常需進行質量控制。理論上，QC樣本都是相同的，但是在樣品提取、檢測分析過程中會有系統誤差，導致QC樣本間有差異，差異越小說明方法穩(wěn)定性越高、數據質量越好。圖1為樣本PCA得分圖，綠色為實驗樣本，紅色為QC樣本；從圖中可以發(fā)現QC樣本分布較密集，重復性較好，系統穩(wěn)定性高，說明數據具有可靠性。

圖1 QC樣本PCA得分Fig.1 Principal component analysis score of quality control samples

2.2 不同年份基酒化合物分析

不同年份鳳香型基酒經衍生化后使用GC-MS進行分析，不同酒樣共檢測到59種化合物，包括30種有機酸、10種氨基酸、7種糖類物質、7種糖醇類物質和5種其他化合物，其中有25種化合物經過標準品鑒定。不同年份鳳香型基酒化合物信息見表1。

從表1中可以看出6個不同貯存年份基酒之間在化合物種類和含量上的差異。新酒中檢測到的化合物共有51種，是所有年份基酒中化合物種類最少的，經過酒海貯存2年以上的基酒中化合物種類增多到59種，包括30種有機酸、10種氨基酸、7種糖類物質、7種糖醇類物質和5種其他化合物，并且基酒在貯存過程中各化合物含量也隨之變化，新酒中化合物含量較低，經貯存后各化合物含量明顯升高，如：乳酸、丙氨酸、巖藻糖、甘油等物質。

有機酸作為白酒中重要的呈香、呈味物質，同時還具有一定的抑菌作用[22,23]。不同年份基酒酒樣中有機酸含量較高的有乳酸、己酸、草酸、棕櫚酸，尤其是乳酸含量遠遠高于其他有機酸，乳酸主要是在發(fā)酵過程中由乳酸菌代謝產生的，乳酸比較柔和，可以增加酒體的醇厚感[24]。蘇糖酸、4-羥基苯甲酸、核糖酸和右旋奎寧酸在新酒中未被檢出，但在貯存過程中含量逐漸升高，可能是由于基酒在酒海貯存過程中有部分內壁物溶出導致的。

不同年份基酒中氨基酸、糖類和糖醇類物質含量較少。氨基酸具有一定酸、甜、鮮、苦、澀等多種風味，可以賦予白酒更豐富的味覺體驗，增強酒體協調、一致性[25]。白酒中糖和糖醇類物質主要來源于釀酒原料和發(fā)酵過程微生物代謝的代謝產物，它們是構成白酒甜味和醇厚味的主要成分。同時部分糖醇類物質還具有一定的保健作用，如山梨糖醇可以作為糖尿病人的健康甜味劑并且可以防齲齒[26]；甘露醇可以降低顱內壓[27]等。β-丙氨酸、赤蘚糖醇和半乳糖在新酒中未檢出，而在貯存過程中含量逐漸升高。

除此之外還有5種其他化合物被檢出，包括甘油、尿素、腺苷、3-羥基吡啶和單棕櫚酸甘油酯，其中甘油含量最高，甘油可能是由釀酒原料中的脂肪經甘油磷脂代謝途徑分解產生的，白酒中適當的甘油可以提高酒的粘度，使得口感更加醇厚。單棕櫚酸甘油酯在新酒中沒有被檢出，在貯存過程中逐漸出現，含量較低，并且該物質也是首次在白酒中檢出，至于其形成機理和在白酒中的作用有待進一步確定。

表1 不同年份鳳香型基酒中的風味物質 Table 1 Flavor substances in different years-stored Fengxiang base liquor

續(xù)表1

2.3 不同年份基酒化合物聚類分析

將所有樣本及相關數據進行距離矩陣計算，并采用層次聚類對所有樣本進行聚類，形成表現樣本間相似度的樹狀圖，結果如圖2所示。圖2中圖形的底部是這顆樹的橫軸，數字是各類別的相對距離，是按距離比例重新設定的結果，這個類的相對距離，能說明類別之間距離的變化。好的聚類結果，類之間的距離應該盡可能大一些，聚類數越多，類的距離越近，類的特征也就越來越不清晰?？傮w來說，基于白酒非揮發(fā)性組分總體特征的聚類分析把六組白酒分成了兩大類，第一類包括貯存7年和9年基酒，第二類是貯存5年及以下基酒，說明貯存7年以上基酒和5年以下基酒之間差異性顯著；第二類中新酒和貯存2年基酒相似度高（距離最近），貯存3年、5年基酒較新酒和貯存2年基酒總體差異較大（相對距離較遠），說明貯存3年以上基酒和2年以下基酒在化合物種類和含量差異顯著。六組樣酒亦可分成三類，即新酒和貯存2年的酒歸為一類，貯存3年和5年的酒歸為一類，貯存7年和9年的酒歸為一類，新酒所在的類與貯存3年、9年酒所在類間的距離較遠，而兩種貯存酒類間的距離較近，說明貯存酒（年份酒）與新酒間具有的化合物種類和含量差異性顯著，而貯存酒間差異性不明顯。聚類分析能夠較好的提取白酒非揮發(fā)性組分的總體特征，并對不同年份的白酒進行分類。

圖2 不同年份基酒聚類圖Fig.2 Dendrogram of different years-stored base liquor

2.4 PCA分析

主成分分析（PCA）是將代謝物變量按一定的權重通過線性組合后產生新的特征變量，通過主要新變量（主成分）對各組數據進行歸類，去除重復性差的樣本（離群樣本）和異常樣本（在置信區(qū)間橢圓外的樣本）。圖3為不同年份基酒的PCA得分圖，提取了PC1、PC2兩個主成分，解釋了不同酒樣特征變量86%的方差信息，從圖3可以看出各樣本組內重復性較好，并且所有樣本均在95%置信區(qū)內，沒有異常值。酒海貯存三年以下的基酒和貯存三年以上的基酒酒樣明顯分開，其中新酒（A）和酒海貯存2年（B）的基酒酒樣相距最近，說明兩類酒樣差距較??；酒海貯存3年（C）和5年（D）后的基酒相近，說明新酒經3～5年時間貯存，化合物組分之間種類和含量相似；酒海貯存7年（E）和9年（F）的基酒與其他酒樣相距較遠，說明基酒在貯存過程中化合物變化明顯，貯存時間不同，變化不一致，貯存時間越長，變化越明顯。

圖3 不同年份基酒PCA得分Fig.3 PCA scores of different years-stored base liquor

2.5 PLS-DA分析

無監(jiān)督分析方法（如PCA）不能忽略組內誤差、消除與研究目的無關的隨機誤差，過分關注于細節(jié)、忽略了整體和規(guī)律，最終不利于發(fā)現組間差異和差異化合物。在這種情況下，就需要利用樣本的先驗知識將數據分析進一步聚焦到我們要研究的方面，采用有監(jiān)督模式識別方法，如偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)。

圖4 不同年份基酒PLS-DA得分Fig.4 PLS-DA scores of different years-stored base liquor

圖4為不同年份基酒PLS-DA的得分圖，從圖中可以看出6種不同年份基酒在各自置信區(qū)間內區(qū)分明顯，顯示了較好的組間差異，不同貯存年份基酒差異明顯，與PCA分析結果一致。不同年份基酒PLS-DA模型的解釋變量R2和預測變量Q2分別為0.960和0.951，說明模型具有較好的可靠性。

2.6 差異代謝物的篩選

通過PLS-DA模型的建立和驗證，應用VIP變量重要性方法來確定最具判別的特征化合物。圖5為化合物變量重要性示意圖，從圖5可以看出所篩選的20種差異化合物VIP貢獻值均大于1，其中包括包括乳酸、乙醇酸、DL-β-羥基丁酸、苯甲酸、甘油酸、壬酸、癸酸、檸檬酸、蘇糖酸、十二酸、2,4,5-三羥基戊酸、十四烷酸、丙氨酸、L-亮氨酸、脯氨酸和L-苯丙氨酸、巖藻糖、尿素、3-羥基吡啶、甘油。

圖5 投影重要性示意圖Fig.5 Schematic diagram of the importance of projection

2.7 差異化合物熱圖分析

對鑒定出的20種差異化合物物質進行熱圖可視化處理，可知其變化規(guī)律，結果如圖6所示。圖6顏色表示物質含量的變化情況，藍色表示含量較低，紅色表示含量較高，橫軸表示不同年份基酒的分組情況。

根據變量重要性所篩選的20種差異化合物包括12種有機酸、4種氨基酸、1種糖和3種其他化合物。其中有機酸包括乳酸、乙醇酸、DL-β-羥基丁酸、苯甲酸、甘油酸、壬酸、癸酸、檸檬酸、蘇糖酸、十二酸、2,4,5-三羥基戊酸、十四烷酸。有機酸對于白酒的風味具有重要作用，新酒經過老熟之后有機酸含量上升，可以提高酒體的醇厚感，同時這也可能是白酒經過貯存后總酸含量上升的原因，與王科岐[28]對于鳳香型白酒在貯存期物質變化研究結果一致。氨基酸包括丙氨酸、L-亮氨酸、脯氨酸和L-苯丙氨酸，其中丙氨酸、脯氨酸含量遠遠高于其他兩種氨基酸，L-苯丙氨酸含量最低，酒體在貯存過程中氨基酸含量增高，其可能源于酒海中蛋清中蛋白質分解產生的氨基酸向酒體中的遷移，或源于微生物代謝和酒中微生物細胞的自溶。巖藻糖是六碳糖的一種，在白酒中含量較低，貯存過程中含量略有上升，Montero[29]等人在蘋果白蘭地中也發(fā)現巖藻糖的存在，并且蘋果白蘭地在橡木桶陳釀過程中其含量也有所增高。白酒中尿素主要來源于釀酒原料如高粱、小麥等[30]，在貯存第三年含量明顯升高，這可能與貯酒容器酒海有關，酒海內壁材料蜂蠟、豬血中含有蛋白質，蛋白質分解可以產生一定量的尿素。3-羥基吡啶是一種含氮化合物，在酒中含量較少，對于酒體的影響不明顯。甘油是酵母菌酒精發(fā)酵的主要副產物之一，主要形成于發(fā)酵初期[31]。就差異化合物的含量而言，不同年份基酒中甘油含量較高，是僅次于乳酸第二高的化合物，白酒在貯存過程中甘油含量呈現上升趨勢，這可能與酒海在制作過程中添加的菜籽油有關，菜籽油中含有脂肪可以分解形成甘油和脂肪酸，導致含量上升。甘油對白酒的香氣特性沒有直接影響，但白酒中適當的甘油可以提高酒的粘度，使得口感更加醇厚[32]。

圖6 不同年份基酒中差異化合物熱圖Fig.6 Heat map of difference compounds in different years-stored base liquor

3 結論

3.1 衍生化方法、GC-MS檢測技術與代謝組學分析方法相結合能夠對不同年份鳳香型基酒中差異化合物進行研究，并發(fā)現鳳香型白酒在酒海貯存過程中風味物質發(fā)生了明顯變化，貯存時間越長，化合物種類和含量越多。

3.2 聚類分析、PCA分析和PLS-DA分析發(fā)現新酒與貯存2年基酒在物質種類和含量上相近，貯存3年和5年基酒相近，貯存7年和9年基酒相近，年份酒所在的類與新酒所在類之間的距離與年份酒的酒齡呈現正相關。

3.3 根據變量重要性從鳳香型年份基酒中可篩選出20種差異化合物，主要包括有機酸、氨基酸、糖類等，這些物質在貯存過程中含量均呈現明顯上升，這可能與酒海內壁特殊涂層材料如豬血、蛋清、菜籽油中的蛋白質、脂肪類物質分解、溶出有關。

3.4 酒體中適量的有機酸、氨基酸、甘油可以有助于酒體風味的形成，增加醇厚感。通過對不同年份基酒中差異化合物研究，可以幫助人們更好的認識年份酒風味物質的形成過程，同時也為研究鳳香型白酒老熟機理提供一定的借鑒意義。