紫蘇精油微囊粉的生物活性及結(jié)構(gòu)表征

李會珍，王琴琴，張志軍*

（1.中北大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，山西太原 030051）（2.中北大學(xué)晉中產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新研究院，山西晉中 030600）

在室溫下，植物精油呈液態(tài)，容易揮發(fā)，空氣、光照以及溫度都可以對精油產(chǎn)生影響[1-3]，微囊化包埋加工可有效避免空氣等環(huán)境因素對芯材的不良影響，從而使得芯材的色香味以及生物活性被最大限度地保護，進而延長持效期[4]，因此被廣泛使用于精油領(lǐng)域。目前，植物精油微囊化方面國內(nèi)已有一些報道，如大蒜精油、甜橙精油、肉豆蔻精油和玫瑰精油等[5-7]。壁材是目前影響微囊產(chǎn)品性能的主要因素，最典型的微囊材料有殼聚糖、明膠、大豆分離蛋白、改性淀粉和羧甲基纖維素等[8]。近年來辛烯基琥珀酸淀粉酯，因其具有低成本、生物級配性好、生物相容性高、無毒性等特點，被廣泛用于壁材材料[9]。

紫蘇是一年生草本植物，其葉（蘇葉）、梗（蘇梗）、果（蘇子）均可入藥，尤其是在韓國、尼泊爾和泰國等國家，是傳統(tǒng)的食品和醫(yī)藥兩用植物。因紫蘇屬植物的多樣性及產(chǎn)地不同，紫蘇精油活性成分種類復(fù)雜，有紫蘇醛、乙?；秽约罢季徒M分種類最多的萜類化合物等[10]，溫性無毒，不僅具有極強的抗氧化、殺菌消炎和抗癌等功效，而且還有潤肺、化痰、止咳和益氣的作用[11,12]，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健、食品添加劑和化妝品美容等行業(yè)。

本研究以紫蘇葉為研究材料，利用水蒸氣蒸餾法提取精油，采用噴霧干燥法制備微囊粉產(chǎn)品，通過研究不同壁材制備的紫蘇精油微囊粉的抗氧化性、抑菌性，并通過掃描電鏡、傅里葉紅外光譜以及熱重分析等檢測方法對紫蘇精油微囊粉進行表征，為紫蘇精油微囊粉的推廣應(yīng)用及紫蘇資源高效利用提供一定的理論和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫蘇精油，實驗室自制；阿拉伯膠，阿拉丁試劑（上海）有限公司；辛烯基琥珀酸淀粉酯（食品級），西安拉維亞生物科技有限公司；枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、西瓜枯萎菌、番茄早疫菌，中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

高速分散器（XHF-DY），寧波新芝生物科技股份有限公司；實驗型噴霧干燥機（SP-1500），上海易研實驗設(shè)備有限公司；冷凍干燥機（FD-1A-50），北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；紫外可見分光光度計（UV-8000S），上海元析儀器有限公司；紅外光譜儀（RXI），鉑金埃爾默儀器有限公司；熱重分析儀（TGA-1），瑞士梅特勒-托利多集團；掃描電子顯微鏡（SU8010），日本日立科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫蘇精油的制備

篩選優(yōu)質(zhì)紫蘇葉在常溫下陰干至恒重，高速多功能粉碎機粉碎，過80目篩，備用。按料液比1:15加入去離子水，預(yù)浸泡4 h，再采用水蒸氣蒸餾法提取4 h，收集揮發(fā)油收集器中上層液體，即為精油[13]。

1.2.2 紫蘇精油微囊粉的制備

選擇阿拉伯膠、辛烯基琥珀酸淀粉酯兩種材料為壁材，在壁芯比3:1，均質(zhì)時間3 min的情況下，將20%固形物（壁材）80 ℃水浴中糊化10 min，冷卻到室溫后，加入純度為80%的精油，并用高速分散器以9000 r/min攪拌速度均質(zhì)乳化3 min，得到穩(wěn)定乳化液[14-16]。采用噴霧干燥方式制備微囊粉[17,18]。

1.2.3 紫蘇精油微囊粉抗氧化能力測定

清除DPPH自由基能力測定：準確量取0.3 mL蒸餾水和樣品溶液分別置于10 mL具塞試管中，再分別加入2.7 mL DPPH工作液，混勻，暗反應(yīng)30 min，以無水甲醇作對照，在518 nm處測其吸光度，分別記為A0、As；準確量取0.3 mL樣品溶液和2.7 mL無水甲醇于10 mL具塞試管中，混勻，暗反應(yīng)30 min，以無水甲醇作對照，在518 nm處測其吸光度，記為Ar。按照公式計算自由基的清除率（Y）。

式中：

A0——2.7 mL DPPH溶液與0.3 mL無水甲醇溶液的吸光值之和；

Ar——2.7 mL無水甲醇溶液與0.3 mL待測工作液的吸光值之和；

As——2.7 mL DPPH溶液與0.3 mL待測工作液的吸光值之和。

清除羥基自由基能力測定：取3個10 mL具塞試管記為1、2、3，在每個試管中依次加入1 mL鄰菲羅啉、0.5 mL硫酸亞鐵和1 mL PBS緩沖液，在1號試管中加入7.5 mL蒸餾水，在2號試管中加入7 mL蒸餾水，0.5 mL H2O2溶液，在3號試管中加入1 mL樣品溶液，6 mL蒸餾水和0.5 mL H2O2溶液，混勻，在37 ℃水浴鍋中保溫1 h，以蒸餾水作參比，在536 nm處測定吸光度，分別記為A0、Ar、As。按照公式計算自由基的清除率（Y）。

式中：

As-Ar——加抗氧化劑前后溶液的吸光度差值；

A0-Ar——未加抗氧化劑時溶液的吸光度。

清除ABTS自由基能力測定：準確量取1 mL去離子水和1 mL樣品溶液分別置于10 mL具塞試管中，再分別加入3 mL ABTS工作液于試管中，混勻，暗反應(yīng)6 min，以70%乙醇做參比，在734 nm處測吸光度，分別記為A0、As；準確量取1 mL樣品溶液和3 mL 70%乙醇于10 mL具塞試管中，混勻，暗反應(yīng)6 min，以70%乙醇做參比，在734 nm處測吸光度，記為Ar。按照公式計算自由基的清除率（Y）。

式中：

A0——1.0 mL去離子水與3.0 mL ABTS工作液吸光值之和；

As——1.0 mL樣品溶液與3.0 mL ABTS工作液吸光值之和；

Ar——1.0 mL樣品溶液與3.0 mL 70%乙醇吸光值之和。

1.2.4 微囊粉抑菌活性測定

選用枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌作為供試菌株。通過在培養(yǎng)基表面放置微囊粉所產(chǎn)生的抑菌圈大小來測定其抑菌性。在無菌條件下，將以上供試菌種以2%的接種量接種在牛肉膏蛋白胨（液體）培養(yǎng)基中，在氣浴恒溫振蕩器中以28 ℃，150 r/min的條件活化培養(yǎng)，并用液體培養(yǎng)基稀釋配成菌懸液，使其含菌數(shù)約為106CFU/mL，搖勻。無菌條件下，各取100 μL不同供試菌種菌懸液用涂布器以畫同心圓的方式均勻涂布于牛肉膏蛋白胨（固體）培養(yǎng)基上，制成含菌平板。分別將3 mg、4 mg、5 mg不同的紫蘇精油微囊粉放置在含菌平板上，以未放置微囊粉的含菌平板作空白對照，將含菌平板放于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置恒溫培養(yǎng)，12 h后以十字交叉法測定其抑菌圈直徑。

選用西瓜枯萎菌、番茄早疫菌作為供試菌株。將以上供試菌種接至PDA培養(yǎng)基上，放于28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)72 h。無菌條件下，用孔徑為7 mm的打孔器在事先用PDA培養(yǎng)基平板培養(yǎng)好的待測真菌菌落邊緣取菌餅，然后將菌餅依次接種在放置有3 mg、4 mg、5 mg紫蘇精油微囊粉的PDA培養(yǎng)平板中央，以未放置微囊粉的平板作為空白對照，放于28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)72 h后，以十字交叉法測定菌落直徑，計算抑制率（Y）。

式中：

Y——抑制率，%；

d0——對照生長直徑，mm；

d1——處理生長直徑，mm。

1.2.5 結(jié)構(gòu)表征

SME掃描電鏡：在SME樣品臺上貼上一層雙面膠，將紫蘇精油微囊粉樣品粉末撒于此雙面膠上，輕輕吹去多余粉末，然后加速電壓為10～15 kV，掃描電子顯微鏡在不同視野時觀察包合物顆粒[19]。

FT-IR紅外光譜：分別取1～2 mg辛烯基琥珀酸淀粉酯粉末、紫蘇精油微囊粉和紫蘇精油與100 mg干燥的KBr粉末一起研磨混勻，倒入專用的壓片器，一邊抽真空，一邊加壓，制成透明的薄圓片。在相同的實驗條件、溫度和濕度，光譜范圍4000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，每份樣品平行測定3次，取平均值[20]。

TGA熱重分析：分別取適量辛烯基琥珀酸淀粉酯粉末、紫蘇精油微囊粉和紫蘇精油于陶瓷坩堝中，實驗氣體為氮氣，氣體流量為20 mL/min，反應(yīng)溫度區(qū)間設(shè)置為25～600 ℃，在10 ℃/min的升溫速率下進行熱重實驗[21,22]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有結(jié)果至少測定三個獨立的樣本以平均值和標準誤差表示，通過SPSS 22.0（Statistical Product and Service Solutions）軟件對數(shù)據(jù)進行多重比較分析，平均值則選用置信度95%的最小顯著性差異（p＜0.05）來比較。Origin Pro 8.0軟件用于數(shù)據(jù)整理和作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇精油微囊粉抗氧化能力測定結(jié)果

由圖1中可知，阿拉伯膠和辛烯基琥珀酸淀粉酯兩種壁材制備的紫蘇精油微囊粉對DPPH自由基、羥基自由基和ABTS自由基均有一定的清除能力，且隨用量的逐步增加，清除率逐步增大，抗氧化能力也逐步增強。在微囊粉用量同為7 mg時，辛烯基琥珀酸淀粉酯制備微囊粉對DPPH自由基、羥基自由基和ABTS自由基均的清除能力分別達到89.19%、84.58%和97.93%，比阿拉伯膠壁材分別高7.03%、9.14%和10.16%，這可能是與同等質(zhì)量下辛烯基琥珀酸淀粉酯為壁材的微囊粉中精油含量相對較高有關(guān)。

圖1 紫蘇精油微囊粉對DPPH、羥基、ABTS自由基的清除率Fig.1 The scavenging rate ofPerilla essential oil microcapsule powder to, hydroxyl group and ABTS radical

2.2 紫蘇精油微囊粉的抑菌結(jié)果

不同用量阿拉伯膠和辛烯基琥珀酸淀粉酯兩種壁材制備紫蘇精油微囊粉對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌三種細菌抑制效果見表1。在微囊粉用量3～5 mg范圍內(nèi)，隨辛烯基琥珀酸淀粉酯制備的微囊粉用量增加，對三種菌的抑菌效果分別呈先減小后增加，一直增加和先增大后減小的趨勢，而阿拉伯膠制備的微囊粉，隨著用量的增加，整體呈增加趨勢。本試驗結(jié)果中，除辛烯基琥珀酸淀粉酯對金黃色葡萄球菌最佳抑菌微囊粉用量為4 mg外，兩種壁材對試驗菌種抑制效果最佳的微囊粉用量均為5 mg，此時抑菌圈直徑達到最大，抑菌效果最佳。

選用西瓜枯萎菌、番茄早疫菌作為供試菌株，通過測定菌絲長度、抑菌率鑒定不同壁材制備紫蘇精油微囊粉對真菌的抑制效果，結(jié)果見表2。由表2可知，以阿拉伯膠為壁材時，在4 mg最佳微囊粉用量下，對番茄早疫病和西瓜枯萎病抑菌率均較高，分別為31.58%和25.00%。微囊粉用量4 mg條件下，兩種壁材處理對番茄早疫病抑制效果相同，微囊粉用量為3 mg時，辛烯基琥珀酸淀粉酯壁材處理菌落直徑小1 mm，抑菌率達到38.89%，高于阿拉伯膠壁材。兩種壁材處理對西瓜枯萎病最佳抑制微囊粉用量均為4 mg，在此用量下，辛烯基琥珀酸淀粉酯壁材處理比阿拉伯膠處理菌落直徑小11 mm，抑菌率達到90.48%，顯著優(yōu)于阿拉伯膠處理。

圖2 不同微囊粉對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig.2 Antibacterial effects of different powders onB. subtilis,E. coli andS. aureus

表1 不同用量微囊粉對各供試細菌菌種的抑菌圈直徑（mm）Table 1 Diameters of inhibition zone (mm) of different dosages of microcapsule powder on each tested bacterial strain

表2 不同用量的微囊粉對各供試真菌菌種的抑制率Table 2 Inhibition rates of different dosages of microcapsule powder on each tested fungus species

圖3 不同微囊粉對番茄早疫菌、西瓜枯萎菌的抑菌效果Fig.3 The bacteriostatic effects of different microcapsule powders on tomato early-pestilence and watermelonFusarium oxysporum

2.3 結(jié)構(gòu)表征結(jié)果

2.3.1 SEM掃描電鏡

圖4 紫蘇精油微囊粉掃描電鏡圖Fig.4 Scanning electron micrograph ofPerillaessential oil microcapsule powder

通過掃描電子顯微鏡（SEM）對辛烯基琥珀酸淀粉酯壁材制備紫蘇精油微囊粉進行表征。由圖4掃描電子顯微鏡（SEM）圖可知，紫蘇精油微囊粉顆粒呈球形，囊壁表面完整，沒有裂縫，僅有較淺的凹陷，這可能是微囊粉在霧化后冷卻過程中收縮形成的，或是噴粉干燥后紫蘇精油的揮發(fā)導(dǎo)致。國內(nèi)外研究也表明，微囊粉顆粒呈球形，可增加表面積與體積比，從而更利于紫蘇精油的釋放，本研究結(jié)果與Maryam[23]及陳敏杰[24]植物油包埋結(jié)果一致。

2.3.2 FT-IR紅外光譜

辛烯基琥珀酸淀粉酯，紫蘇精油，紫蘇精油微囊粉3個樣品的紅外光譜分析結(jié)果（FT-IR）見圖5。辛烯基琥珀酸淀粉酯的FT-IR光譜在3427 cm-1（O-H伸縮振動），2926 cm-1（C-H伸縮振動），1647 cm-1（C=C伸縮振動），1420 cm-1（C-H彎曲振動）和1019 cm-1（C-O伸縮振動）顯示出特征峰。純紫蘇精油光譜顯示出特征峰3419 cm-1（O-H伸縮振動），2962 cm-1（C-H伸縮振動），2740 cm-1（C-H伸縮振動），1678 cm-1（C=C伸縮振動），1448 cm-1（C-H彎曲振動），1382 cm-1（C-H彎曲振動），1123 cm-1（C-O伸縮振動）和747 cm-1（C-H彎曲振動）。精油所有的特征峰都出現(xiàn)在紫蘇精油微囊粉光譜中，表明紫蘇精油被成功包被于辛烯基琥珀酸淀粉酯壁材中。其特征峰位置略有偏移，可能是由于紫蘇精油的各種官能團與辛烯基琥珀酸淀粉酯的相互作用，但紫蘇精油微囊粉沒有形成新的特征吸收峰，表明沒有生成新的化學(xué)鍵或基團，微囊粉加工僅為物理包被過程。本研究結(jié)果與徐單單對檸檬精油[25]，程建華等[26]對廣藿香精油微膠囊的表征結(jié)果一致。

圖5 紅外光譜分析Fig.5 Infrared spectrum analysis

2.3.3 TGA熱重分析

圖6 熱重分析Fig.6 Thermogravimetric analysis

辛烯基琥珀酸淀粉酯，紫蘇精油，紫蘇精油微囊粉3個樣品的熱重分析結(jié)果見圖6。隨著溫度的升高，樣品質(zhì)量逐漸減少，紫蘇精油的TG曲線可分為2個階段：第一階段從25～300 ℃，樣品失重劇烈，主要由低沸點精油組分的揮發(fā)所致，第二階段為300～600 ℃，失重率達到12.05%，精油組分進一步發(fā)生分解。辛烯基琥珀酸淀粉酯的TG曲線分為3個階段，第一階段出現(xiàn)在25～240 ℃，質(zhì)量減少7.41%，當(dāng)溫度繼續(xù)升高達到第二階段240～302 ℃時，損失了39.77%，到600 ℃時，失重率達到19.90%。紫蘇精油微囊粉的TG曲線分為3個階段，總失重率為86.11%，第一階段從25～236 ℃，失重比較緩和；第二階段為236～306 ℃，損失了54.39%，第三階段是從306～600 ℃，失重率達到13.89%。

由上述可知，紫蘇精油微囊粉的失重率介于精油和辛烯基琥珀酸淀粉酯之間。對比紫蘇精油微囊粉和辛烯基琥珀酸淀粉酯的曲線可知，兩者形狀大致相同，樣品的起始降解溫度和終止降解溫度相近，但是由于紫蘇精油的加入，微囊粉的失重過程比辛烯基琥珀酸淀粉酯較快，因此說明辛烯基琥珀酸淀粉酯對紫蘇精油只有包埋作用，并沒有造成兩種材料理化性質(zhì)的改變。與彭瑩蕓等報道的葡萄柚精油納米微膠囊[27]，Yang等[28]報道的香草油微囊粉結(jié)果一致，表明微囊化包埋技術(shù)能有效延緩精油揮發(fā)速度，提高精油的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

食品變質(zhì)是食品加工和儲存過程中的重要問題，天然防腐劑近年來逐漸走進國內(nèi)外大眾的視線。植物精油因其自身獨特的優(yōu)點，強大的抗氧化性和抑菌性而逐步受到青睞。其中，紫蘇精油在抗氧化性和抑菌性方面表現(xiàn)優(yōu)異，但其對光敏感、易揮發(fā)、易分解和易被氧化等特點限制了在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用，而微囊化技術(shù)可以有效解決這一難題。本研究結(jié)果表明，采用辛烯基琥珀酸淀粉酯壁材制備紫蘇精油微囊粉，抗氧化性強，對細菌、真菌抑菌性好，SEM、FTIR和TG對紫蘇精油微囊粉結(jié)構(gòu)表征結(jié)果證明，紫蘇精油微囊粉加工僅為物理包被，形態(tài)呈圓球形，表面有較淺的凹陷，可有效延緩紫蘇精油的揮發(fā)，提高穩(wěn)定性。本研究制備紫蘇精油微囊粉作為天然防腐劑和抗菌劑可應(yīng)用于食品和制藥領(lǐng)域，開發(fā)前景廣闊。