體外多酶級聯(lián)反應(yīng)體系高效合成萊鮑迪苷M

劉思穎，王斌，潘力

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東省發(fā)酵與酶工程重點實驗室，廣東廣州 510006）

甜葉菊原產(chǎn)于巴拉圭和巴西，其葉片中可提取出 一類甜度高且熱量低的糖苷類化合物，幾個世紀(jì)以來，一直被南美洲人作為天然甜味劑食用，包括甜菊苷（Stevioside，ST）、萊鮑迪苷A（Rebaudioside A，RA）、萊鮑迪苷D（Rebaudioside D，RD）和萊鮑迪苷（Rebaudioside M，RM）。其中ST和RA含量較為豐富（約占葉片干重的7%和3%），但與RD和RM相比，它們的甜度較低，且隨添加量不斷增加，苦澀味逐漸顯現(xiàn)，故應(yīng)用于食品生產(chǎn)時會影響產(chǎn)品風(fēng)味[1]。RD和RM作為高品質(zhì)甜味劑，甜度為蔗糖的400倍，口感更加純凈，但是含量十分稀少，僅占葉片干重的0.3%[2]。利用傳統(tǒng)物理方法從葉片中提純RD和RM的產(chǎn)量遠遠不能滿足市場需求，且生產(chǎn)量少，工藝繁瑣，成本較高[3,4]。

甜葉菊來源的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1可以在糖基供體UDPG存在的條件下，催化兩種糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)：由ST生成RA[5]，或由RD產(chǎn)生RM[6]，而水稻來源的糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11則可以利用糖基供體UDPG，以RA為底物催化生成RD[7]，糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1和糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11都屬于UDP糖基轉(zhuǎn)移酶。在以上三個糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)中，均需要UDPG作為糖基供體，但UDPG價格昂貴，使甜味劑的生產(chǎn)成本大幅增加。而蔗糖合成酶可利用廉價原料UDP，在蔗糖存在的情況下，將葡萄糖基轉(zhuǎn)移至UDP，生成UDPG和果糖（圖1b），且該過程可逆，可以實現(xiàn)UDP-UDPG的循環(huán)反應(yīng)[8-11]。當(dāng)糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)與SUS1介導(dǎo)的UDP-UDPG循環(huán)反應(yīng)偶聯(lián)時，不需要添加昂貴底物UDPG，各糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)也能正常進行。

由于新型甜味劑RM更加符合人們對食物品質(zhì)的追求，但目前關(guān)于體外一鍋法高效合成RM的論文報道較少。本文將UGT76G1，EUGT11和SUS1分別于大腸桿菌中重組表達，利用其破碎得到的粗酶液建立多酶級聯(lián)反應(yīng)體系，即將三個單級聯(lián)反應(yīng)串聯(lián)，在體外形成通路，由廉價原料ST經(jīng)一鍋法合成RM（圖1a，1b）。并通過提高該通路中限速酶EUGT11酶活，將終產(chǎn)物RM產(chǎn)量提升，該方法避免直接用昂貴的RD作為合成RM的底物，為低成本高效酶法合成RM提供技術(shù)支持。

圖1 體外多酶級聯(lián)反應(yīng)體系示意圖Fig.1 Process of multiple-enzyme cascade reactionsystem in vitro

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 目的基因、菌株及質(zhì)粒

E.coliMatch1T1購自Invirtogen公司；E.coliRosetta（DE3）購自Invirtogen公司；通用載體質(zhì)粒pET22b購自Takara公司；大腸桿菌表達質(zhì)粒pET22b-UGT76G1、pET22b-EUGT11、pET22b-SUS1、pET22b-EUGT11/2 copies of T7、pET22b-EUGT11/3 copies of T7、pET22b-EUGT11/4 copies of T7均由本實驗室構(gòu)建。

1.1.2 酶及試劑

Restriction Enzymes FastDigest?購于賽默飛世爾科技公司；PCR高保真酶Prime STAR HS（premix）購自Takara公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購自廣州捷倍斯生物科技有限公司；酶反應(yīng)產(chǎn)物純化試劑盒購自廣州捷倍斯生物科技有限公司；UDP（尿苷二磷酸）及UDPG（尿苷二磷酸葡萄糖）均購自上海源葉公司；氨芐青霉素Amp及異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）均購自北京普博欣生物科技有限公司；ST、RA、RD及RM底物及標(biāo)準(zhǔn)品均由曲阜海根甜菊制品有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 目的基因序列合成及擴增

甜葉菊來源的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1，水稻來源的糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11及擬南芥來源的蔗糖合成酶SUS1的基因序列均由南京金斯瑞公司優(yōu)化合成，并分別克隆至載體pUC57，得到pUC57-UGT76G1、pUC57-EUGT11和pUC57-SUS1三個質(zhì)粒。

1.2.2 表達載體構(gòu)建

1.2.2.1UGT76G1、EUGT11和SUS1的單啟動子表達載體構(gòu)建

以質(zhì)粒pUC57-UGT76G1、pUC57-EUGT11和pUC57-SUS1為模板，分別用引物UGT76G1-F和UGT76G1-R、EUGT11-F和EUGT11-R、SUS1-F和SUS1-R（表1），將目的片段擴增，將大小正確的PCR產(chǎn)物并回收備用。用XhoⅠ和NdeⅠ酶切載體pET22b并純化，將純化后的載體分別和目的基因片段連接。將10 μL連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化至E. coliMatch1T1，涂布于含有氨芐霉素的LB平板。挑取陽性轉(zhuǎn)化子擴大培養(yǎng)后提質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗證正確后，送至廣州天一輝遠基因科技有限公司測序，得到測序正確的質(zhì)粒pET22b-UGT76G1、pET22b-EUGT11及pET22b-SUS1，并將對應(yīng)菌株于甘油中低溫保藏。

表1 用于載體構(gòu)建的寡核苷酸序列Table 1 Sequences of oligonucleotides for plasmids construction

圖2 糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11表達載體Fig.2 Plasmids used for expression of UDP-glucosyltransferase EUGT11

1.2.2.2EUGT11多重啟動子表達載體構(gòu)建

以質(zhì)粒pET22b-EUGT11為模板，用pET22b-F和pET22b-R擴增得到含有和目的基因EUGT11的pET22b載體骨架的大片段，命名為pET22b-scaffold-EUGT11，膠回收備用。將2 copies of T7-F和2 copies of T7-R（表1）兩條寡核苷酸鏈在98 ℃條件下變性5 min，自然降至室溫完成退火，形成雙啟動子雙鏈片段，命名為2 copies of T7，回收該片段備用。將另外兩對寡核苷酸鏈3 copies of T7-F和3 copies of T7-R、4 copies of T7-F和4copies of T7-R（表1）也進行如上操作，分別退火形成三重啟動子和四重啟動子雙鏈片段，分別命名為3 copies of T7和4 copies of T7。將雙鏈片段2 copies of T7、3 copies of T7和4 copies of T7分別與pET22b-scaffold-EUGT11連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E. coliMatch1T1。經(jīng)帶有氨芐霉素的抗性平板初步篩選陽性轉(zhuǎn)化子，將鑒定正確的轉(zhuǎn)化子送至廣州天一輝遠基因科技有限公司測序。得到含有雙重、三重、四重啟動子的EUGT11表達質(zhì)粒，分別命名為pET22b-EUGT11/2 copies of T7、pET22b-EUGT11/3 copies of T7和pET22b-EUGT11/4 copies of T7（圖2）。

1.2.3 大腸桿菌誘導(dǎo)表達

將質(zhì)粒pET22b-UGT76G1、pET22b-EUGT11、pET22b-SUS1、pET22b-EUGT11/2 copies of T7、pET22b-EUGT11/3 copies of T7和pET22b-EUGT11/4 copies of T7分別轉(zhuǎn)化至Rosetta（DE3），經(jīng)氨芐霉素抗性LB平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，分別命名為Rosetta-UGT76G1、Rosetta-EUGT11、Rosetta-SUS1、Rosetta-EUGT11/2 copies of T7、Rosetta-EUGT11/3 copies of T7和Rosetta-EUGT11/4 copies of T7。將以上重組大腸桿菌分別于液體LB中培養(yǎng)8 h，以1%接種量轉(zhuǎn)接于100 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基，待菌體生長至OD600=0.7左右，向其中添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至工作濃度為0.5 mmol/L，并在20 ℃，200 r/min條件下低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)20 h后，以4 ℃，8000 r/min離心收集菌體，30 mL超純水洗滌兩次，最后用10 mL 50 mmol/L pH 7.0的磷酸緩沖液重懸菌體，冰浴超聲破碎30 min，離心取上清液得到粗酶液，用于后續(xù)BCA法蛋白濃度測定及酶活測定。

1.2.4 酶活測定

1.2.4.1 酶活測定體系

糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1酶活測定體系：將Rosetta-UGT76G1破碎后得到的粗酶液與反應(yīng)體系混合，總體系為200 μL。其中各組份及終濃度為50 mmol/L pH 7.0磷酸鉀緩沖液、1 mmol/L ST或1 mmol/L RD、2 mmol/L UDPG、3 mmol/L MgCl2，粗酶液中的總蛋白量為2 mg。反應(yīng)30 min后，95 ℃加熱5 min使酶失活，超純水稀釋10倍，0.22 μm濾膜過濾后，經(jīng)HPLC對UDP、UDPG進行定性定量分析。

糖基轉(zhuǎn)移酶EUGT11酶活測定體系：將Rosetta-EUGT11破碎后得到的粗酶液與反應(yīng)體系混合，總體系為200 μL。其中各組份及終濃度為50 mmol/L pH 7.0磷酸鉀緩沖液，1 mmol/L RA、2 mmol/L UDPG、3 mmol/L MgCl2，粗酶液中的總蛋白量為2 mg。反應(yīng)30 min后，95 ℃加熱5 min使酶失活，超純水稀釋10倍，0.22 μm濾膜過濾后，經(jīng)HPLC對UDP、UDPG進行定性定量分析。

蔗糖合成酶SUS1酶活測定體系：將Rosetta-SUS1破碎后得到的粗酶液與反應(yīng)體系混合，總體系為200 μL。其中各組份及終濃度為50 mmol/L pH 7.0磷酸鉀緩沖液、700 mmol/L蔗糖、2 mmol/L UDP、3 mmol/L MgCl2，粗酶液中的總蛋白量為2 mg。反應(yīng)30 min后，95 ℃加熱5 min使酶失活，超純水稀釋10倍，0.22 μm濾膜過濾后，經(jīng)HPLC對UDP、UDPG進行定性定量分析。

1.2.4.2 酶活計算公式

酶活力單位定義為：各酶在相應(yīng)反應(yīng)條件下，每1 min生成1 mmol/L UDPG或UDP所需酶量。

式中：

C——通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出的UDP、UDPG濃度，mmol/L；

N——稀釋倍數(shù)；

V——反應(yīng)體系體積，L；

T——反應(yīng)時間，min；

m——反應(yīng)體系中的蛋白含量，g。

1.2.5 重組酶UGT76G1和EUGT11對糖苷類底物轉(zhuǎn)化率測定

重組酶UGT76G1對底物轉(zhuǎn)化率測定體系：將Rosetta-UGT76G1破碎后得到的粗酶液與反應(yīng)體系混合，總體系為200 μL。其中各組份及終濃度為50 mmol/L pH 7.0磷酸鉀緩沖液、1 mmol/L ST或1 mmol/L RD、2 mmol/L UDPG、3 mmol/L MgCl2，加入粗酶液的量為10 mU。反應(yīng)24 h后，95 ℃加熱5 min使酶失活,超純水稀釋10倍，0.22 μm濾膜過濾后，經(jīng)HPLC對ST、RA或RD、RM進行定性定量分析，并計算ST或RD的轉(zhuǎn)化率。

重組酶EUGT11對底物轉(zhuǎn)化率測定體系：將Rosetta-EUGT11破碎后得到的粗酶液與反應(yīng)體系混合，總體系為200 μL。其中各組份及終濃度為50 mmol/L pH 7.0磷酸鉀緩沖液、1 mmol/L RA、2 mmol/L UDPG、3 mmol/L MgCl2，加入粗酶液的量為10 mU。反應(yīng)24 h后，95 ℃加熱5 min使酶失活，超純水稀釋10倍，0.22 μm濾膜過濾后，經(jīng)HPLC對RA、RD進行定性定量分析，并計算RA的轉(zhuǎn)化率。

1.2.6 體外單級聯(lián)體系和體外多酶級聯(lián)體系產(chǎn)物測定

1.2.6.1 重組酶UGT76G1和SUS1參與的體外單級聯(lián)體系中ST轉(zhuǎn)化率測定

按照1.2.3的方法破碎獲得Rosetta-UGT76G1和Rosetta-SUS1的粗酶液，控制體系中SUS1酶量為10 mU，UGT76G1酶量分別為10 mU、20 mU、30 mU，使得反應(yīng)體系中雙酶酶量比例為1:1、1:2、1:3。其中各組份及終濃度為50 mmol/L pH 7.0磷酸鉀緩沖液、700 mmol/L蔗糖、1 mmol/L ST、2 mmol/L UDP、3 mmol/L MgCl2，補加蒸餾水至200 μL。反應(yīng)24 h后，95 ℃加熱5 min使酶失活，超純水稀釋10倍，0.22 μm濾膜過濾后，經(jīng)HPLC對ST、RA進行定性定量分析，并計算ST轉(zhuǎn)化率。

1.2.6.2 重組酶EUGT11和SUS1參與的體外單級聯(lián)體系中RA轉(zhuǎn)化率測定

按照1.2.3的方法破碎獲得Rosetta-EUGT11和Rosetta-SUS1的粗酶液，控制粗酶液的用量，使反應(yīng)體系中SUS1酶活力為10 mU（換算成總蛋白質(zhì)量為0.16 mg），EUGT11酶活力分別為10 mU、20 mU、30 mU（換算成蛋白質(zhì)量分別為1.96 mg、3.93 mg、5.9 mg），使得反應(yīng)體系中雙酶酶活力比例為1:1、1:2、1:3（換算成蛋白質(zhì)量比為1:12.3、1:24.6、1:36.9）。其中各組份及終濃度為50 mmol/L pH 7.0磷酸鉀緩沖液、700 mmol/L蔗糖、1 mmol/L RA、2 mmol/L UDP、3 mmol/L MgCl2，補加蒸餾水至200 μL。反應(yīng)24 h后，95 ℃加熱5 min使酶失活，超純水稀釋10倍，0.22 μm濾膜過濾后，經(jīng)HPLC對RA、RD進行定性定量分析，并計算各酶量配比下的RA轉(zhuǎn)化率。

破碎Rosetta-EUGT11/3 copies of T7得到的粗酶液也加入到同樣體系反應(yīng)，Rosetta-EUGT11/3 copies of T7的粗酶液的用量為：保證反應(yīng)體系中所含該粗酶液的蛋白質(zhì)量與Rosetta-EUGT11粗酶液酶活力為10 mU、20 mU、30 mU時對應(yīng)的蛋白質(zhì)量一致，即分別為1.96 mg、3.93 mg、5.9 mg，具體為：使反應(yīng)體系中SUS1酶活力為10 mU（換算成總蛋白質(zhì)量為0.16 mg），Rosetta-EUGT11/3 copies of T7酶活力分別為21.3 mU、42.6 mU、63.9 mU，使得反應(yīng)體系中雙酶酶活力比例為1:2.13、1:4.26、1:6.39。反應(yīng)24 h后，95 ℃加熱5 min使酶失活，超純水稀釋10倍，0.22 μm濾膜過濾后，經(jīng)HPLC對RA、RD進行定性定量分析，并計算各酶量配比下的RA轉(zhuǎn)化率。

1.2.6.3 重組酶UGT76G1和SUS1參與的體外單級聯(lián)體系中RD轉(zhuǎn)化率測定

按照1.2.3的方法破碎獲得Rosetta-EUGT11和Rosetta-SUS1的粗酶液，控制體系中SUS1酶量為10 mU，UGT76G1酶量分別為10 mU、20 mU、30 mU，使得反應(yīng)體系中雙酶酶量比例為1:1、1:2、1:3。其中各組份及終濃度為50 mmol/L pH 7.0磷酸鉀緩沖液、700 mmol/L蔗糖、1 mmol/LRD、2 mmol/L UDP、3 mmol/L MgCl2，補加蒸餾水至200 μL。反應(yīng)24 h后，95 ℃加熱5 min使酶失活，超純水稀釋10倍，0.22 μm濾膜過濾后，經(jīng)HPLC對RD、RM進行定性定量分析，并計算RD轉(zhuǎn)化率。

1.2.6.4 重組酶UGT76G1、EUGT11和SUS1參與的體外多酶級聯(lián)體系產(chǎn)物測定

按照1.2.3的方法破碎獲得Rosetta-SUS1，Rosetta-UGT76G1和Rosetta-EUGT11的粗酶液，以酶活力比例為1:2:3加入反應(yīng)體系中，即各酶酶活力分別為10 mU、20 mU、30 mU。其中各組份及終濃度為50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.0）、700 mmol/L蔗糖、10 mmol/L ST、20 mmol/L UDP、3 mmol/L MgCl2，補加蒸餾水至200 μL。反應(yīng)48 h后，95 ℃加熱5 min使酶失活，超純水稀釋10倍，0.22 μm濾膜過濾后，經(jīng)HPLC分析對ST、RA、RD、RM進行定性定量分析。破碎Rosetta-EUGT11/3 copies of T7得到的粗酶液也按照同樣體系反應(yīng)，Rosetta-EUGT11/3 copies of T7的粗酶液的用量為：保證反應(yīng)體系中所含該粗酶液的蛋白質(zhì)量與Rosetta-EUGT11粗酶液酶活力為30 mU對應(yīng)的蛋白質(zhì)量一致，即為5.9 mg。

1.2.6.5 底物轉(zhuǎn)化率計算公式

式中：

St0——反應(yīng)結(jié)束時底物濃度，mmol/L；

St1——反應(yīng)開始時底物濃度，mmol/L。

1.2.7 HPLC分析條件

HPLC分析RA、ST、RM、RD條件：Agilent 1220 Infinity梯度液相色譜系統(tǒng)，Phenomenex Luna 5μ C18柱，流動相為A（1.5 g/L磷酸二氫鈉緩沖液）:B（乙腈）=68:32，采用等度洗脫，進樣量10 μL，檢測波長210 nm。ST、RA、RD、RM標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)以上條件分析后，得到外標(biāo)法分析所用的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

HPLC分析UDP、UDPG條件：Agilent 1220 Infinity梯度液相色譜系統(tǒng)，Phenomenex Luna 5μ C18 柱，流動相為A（200 mmol/L磷酸鹽緩沖液）：B（1.62 g/L四丁基溴化銨水溶液）=1:1，采用等度洗脫，進樣量10 μL，檢測波長262 nm。UDPG、UDP標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)以上條件分析后，得到外標(biāo)法分析所用的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

每個重組大腸桿菌重復(fù)發(fā)酵三次，每個蛋白濃度測定體系、酶活測定體系以及級聯(lián)反應(yīng)體系均設(shè)置三個平行，數(shù)據(jù)值為平行樣品的平均值，用誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組酶UGT76G1、EUGT11、SUS1的表達研究

2.1.1 重組酶UGT76G1、EUGT11、SUS1表達載體構(gòu)建

為了構(gòu)建重組酶UGT76G1、EUGT11、SUS1表達載體，將目的基因UGT76G1、EUGT11、SUS1分別與線性化的pET22b載體連接，并對表達載體pET22b-UGT76G1、pET22b-EUGT11及pET22b-SUS1進行瓊脂糖凝膠電泳及酶切鑒定。質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)大小為6717 bp、6747 bp、7767 bp的條帶（圖3），與各質(zhì)粒大小一致。用XbaⅠ和NdeⅠ對質(zhì)粒pET22b-UGT76G1雙酶切鑒定，用XbaⅠ和ClaⅠ對質(zhì)粒pET22b-EUGT11雙酶切鑒定，釋放出的片段大小分別為5303 bp和1414 bp、5357 bp和1390 bp，條帶大小正確；用XbaⅠ對質(zhì)粒pET22b-SUS1單酶切鑒定，得到大小為7767 bp的單一條帶，大小正確（圖3）。由 于 質(zhì) 粒pET22b-EUGT11/2 copies of T7、pET22b-EUGT11/3 copies of T7和pET22b-EUGT11/4 copies of T7大小差距不大，只能依靠測序手段鑒定是否有相應(yīng)個數(shù)的啟動子與載體連接，正確連接的載體如圖2。

圖3 質(zhì)粒pET22b-UGT76G1、pET22b-EUGT11、pET22b-SUS1及酶切鑒定電泳圖Fig.3 Electropherogram of pET22b-UGT76G1, pET22b-EUGT11, pET22b-SUS1and their restriction enzymedigestion

2.1.2 重組酶UGT76G1、EUGT11和SUS1表達活性研究

分別對重組菌Rosetta-UGT76G1、Rosetta-EUGT11、Rosetta-SUS1破碎后得到的粗酶液進行酶活測定，以探究重組酶UGT76G1、EUGT11和SUS1在大腸桿菌胞內(nèi)表達情況。糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1，EUGT11催化UDPG轉(zhuǎn)化為UDP，故按照反應(yīng)生成UDP的量計算酶活；SUS1催化UDP轉(zhuǎn)化為UDPG，按照反應(yīng)生成UDPG的量計算酶活。結(jié)果如表2，UGT76G1（ST）、UGT76G1（RD）、EUGT11、SUS1酶活分別為31.35、19.27、5.09、65.34 U/g，宿主Rosetta（DE3）粗酶液基本無活性，表明重組酶UGT76G1、EUGT11和SUS1均已在大腸桿菌胞內(nèi)成功表達。

其中，重組酶UGT76G1催化不同糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)時，UDPG轉(zhuǎn)化率差異較大（表2，圖4c、4d），催化ST轉(zhuǎn)化為RA的酶活為催化RD轉(zhuǎn)化為RM酶活的1.63倍，可能是ST的分子構(gòu)型相較于RD更易進入該酶的催化口袋而更快的觸發(fā)糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)[12]，此時該酶對于糖基供體UDPG的葡萄糖基移除速率也更快，表現(xiàn)為該酶催化ST轉(zhuǎn)化為RA時也有更高的UDPG轉(zhuǎn)化率。重組酶EUGT11的酶活最低，反應(yīng)結(jié)束只有少量UDP產(chǎn)生（圖4e），可初步認(rèn)為在體外多酶級聯(lián)催化體系中，EUGT11是該體系的限速酶。重組酶SUS1的UDP轉(zhuǎn)化率最高，反應(yīng)結(jié)束后UDP幾乎完全轉(zhuǎn)化為UDPG（圖4b），較高的酶活使得該酶能在體外多酶級聯(lián)反應(yīng)體系中為糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)提供足量糖基供體UDPG。

表2 重組大腸桿菌粗酶液酶活測定Table 2 Enzyme activity of crude lysates

圖4 UDP、UDPG的HPLC分析Fig.4 HPLC analysis of UDP, UDPG

2.2 重組酶UGT76G1和EUGT11對糖苷類底物轉(zhuǎn)化率研究

表3 重組酶UGT76G1和EUGT11粗酶液對底物的轉(zhuǎn)化率測定Table 3 Conversion rate of different substrates of UGT76G1 and EUGT11 crude lysates

為了確定體外多酶級聯(lián)反應(yīng)體系中的限速酶，比較了在相同酶量下糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76G1對ST和RD轉(zhuǎn)化率以及EUGT11對RA的轉(zhuǎn)化率。結(jié)果如表3，Rosetta-UGT76G1粗酶液對ST的轉(zhuǎn)化率為98.92%，對RD的轉(zhuǎn)化率為57.49%，Rosetta-EUGT11粗酶液對RA的轉(zhuǎn)化率僅為13.25%。由此可知，重組酶UGT76G1幾乎可以將ST完全轉(zhuǎn)化為RA，保證多酶級聯(lián)反應(yīng)體系第一步反應(yīng)的催化效率。重組酶EUGT11對RA的轉(zhuǎn)化率較低，導(dǎo)致RD產(chǎn)量低，不能為RM的合成提供足量的前體，故該步驟應(yīng)為體外多酶級聯(lián)反應(yīng)體系中的限速步驟。

2.3 在不同串聯(lián)個數(shù)啟動子操控下表達的重組酶EUGT11酶活比較

啟動子是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的起始位點，啟動子與RNA聚合酶結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄，該過程直接影響到下游基因的轉(zhuǎn)錄水平。理論上多拷貝的啟動子可以增加DNA分子與聚合酶的作用的機率，即可以通過增加啟動子拷貝數(shù)，提高下游基因的轉(zhuǎn)錄效率，從而增加目的基因表達量而提高酶活力[13]。王俊姝[14]在大腸桿菌中，通過將化學(xué)合成五個重復(fù)trc啟動子核心區(qū)與載體連接，并以綠色熒光蛋白和半乳糖苷酶作為信號分子監(jiān)測啟動子的啟動強度，證明其啟動強度是單拷貝啟動子強度的3.47倍，該結(jié)果為本實驗在提高限速酶酶活方面提供了基本思路。為提升限速酶EUGT11活性，從而提升體外多酶級聯(lián)反應(yīng)體系的整體催化效率，本文將該酶表達質(zhì)粒的T7啟動子核心區(qū)域串聯(lián)，分別構(gòu)建含有一重、二重、三重和四重啟動子的EUGT11表達質(zhì)粒的重組大腸桿菌，并測定酶活，結(jié)果如表4，在相同反應(yīng)條件下，重組酶EUGT11、EUGT11/2 copies of T7、EUGT11/3 copies of T7、EUGT11/4 copies of T7酶活分別為5.09、0.29、10.84、9.21 U/g。相比單啟動子控制下表達的重組酶EUGT11，三重啟動子將酶活提升2.13倍。四重啟動子也使得酶活提升1.81倍，而二重啟動子使得該酶的表達量大幅下降，酶活僅為0.29 U/g。

表4 不同串聯(lián)個數(shù)啟動子操控下表達的EUGT11酶活Table 4 Comparison of enzyme activity of EUGT11 with different number of promoters

2.4 體外各單級聯(lián)反應(yīng)最佳酶量配比探究

為便于確定體外多酶級聯(lián)反應(yīng)體系的酶量配比，先對各單級聯(lián)反應(yīng)的最佳酶量配比進行探究。本文控制重組酶SUS1與重組酶UGT76G1的單酶級聯(lián)反應(yīng)中的酶活力配比為1:1、1:2、1:3。由于多重啟動子中，三重啟動子對重組酶EUGT11酶活提升效果最佳，故選擇重組菌Rosetta-EUGT11/3 copies of T7破碎液進行以RA為底物的單酶級聯(lián)反應(yīng)最佳酶量配比探究，并以重組菌Rosetta-EUGT11破碎液做為對照，本文控制重組酶SUS1與重組酶EUGT11或重組酶EUGT11/3 copies of T7的單酶級聯(lián)反應(yīng)中蛋白質(zhì)量配比為1:2.3、1:24.6、1:36.9。比較三種酶活力或蛋白質(zhì)量配比下各糖基轉(zhuǎn)移酶對底物的轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化率最高時的酶活力或蛋白質(zhì)量配比為該單級聯(lián)反應(yīng)的最佳酶活力或蛋白質(zhì)量配比，結(jié)果如圖5。

重組酶EUGT11和EUGT11/3 copies of T7催化RA轉(zhuǎn)化為RD的單級聯(lián)反應(yīng)情況如圖5a和5b，SUS1與EUGT11的酶活力配比為1:1、1:2、1:3時，RA的轉(zhuǎn)化率分別為19.07%、29.10%、36.56%；SUS1與EUGT11/3 copies of T7的酶活力配比為1:2.13、1:4.26、1:6.39時，RA的轉(zhuǎn)化率分別為25.68%、63.60%、79.75%。由此可知，單啟動子控制下的EUGT11和三重啟動子控制下的EUGT11在酶量配比為1:3和1:6.39時（即蛋白質(zhì)量配比均為1:36.9時）出現(xiàn)RA最高轉(zhuǎn)化率，且后者最高轉(zhuǎn)化率為前者的2.18倍。

重組酶UGT76G1催化ST轉(zhuǎn)化為RA的單級聯(lián)反應(yīng)結(jié)果如圖5c，SUS1與UGT76G1的酶量配比為1:1、1:2、1:3時，ST轉(zhuǎn)化率分別為89.17%、95.28%、87.89%。當(dāng)酶量配比為1:2時，ST轉(zhuǎn)化率最高，再增加糖基轉(zhuǎn)移酶的量至酶量配比為1:3時，產(chǎn)物RA轉(zhuǎn)化率略有降低。

圖5 單級聯(lián)反應(yīng)中SUS1和UDP糖基轉(zhuǎn)移酶不同酶量配對應(yīng)的底物轉(zhuǎn)化率Fig.5 Substrate conversion rate with different ratios of SUS1 and UDP-glucosyltransferase in cascade reaction

重組酶UGT76G1催化RD轉(zhuǎn)化為RM的單級聯(lián)反應(yīng)結(jié)果如圖5d，SUS1與UGT76G1的酶量配比為1:1、1:2、1:3時，RD轉(zhuǎn)化率分別為89.57%、99.26%、35.92%。當(dāng)酶量配比為1:2時RD轉(zhuǎn)化率最高，再增加UGT76G1至酶量配比為1:3時RD轉(zhuǎn)化率大幅降低?？赡苡捎诿噶颗浔葹?:2時，該級聯(lián)反應(yīng)中SUS1的糖基供體UDPG供應(yīng)速度與UGT76G1轉(zhuǎn)糖基速度達到最優(yōu)平衡，若再增加糖基轉(zhuǎn)移酶的量，使UDPG消耗量加大，在SUS1酶量不變的情況下，UDPG的產(chǎn)生速度跟不上消耗速度，可能會在一定程度上破壞偶聯(lián)反應(yīng)的平衡，使RD的轉(zhuǎn)化率降低。

將每個單酶級聯(lián)反應(yīng)體系的最佳酶活力配比綜合，則體外多酶級聯(lián)反應(yīng)體系最佳酶活力配比應(yīng)為SUS1:UGT76G1:EUGT11/3 copies of T7=1:2:6.39，換算成蛋白質(zhì)量比例為SUS1:UGT76G1:EUGT11/3 copies of T7=1:4:36.9。

2.5 三重啟動子操控下表達的EUGT11對體外多酶級聯(lián)反應(yīng)體系中RM產(chǎn)量探究

圖6 體外多酶級聯(lián)反應(yīng)體系HPLC產(chǎn)物分析Fig.6 HPLC analysis of production in different multiple-enzyme cascade reaction in vitro

表5 不同體外多酶級聯(lián)反應(yīng)體系RA、RD、RM濃度比較Table 5 Comparison of concentration of RA, RD and RM in different multiple-enzyme cascade reaction in vitro

為了研究EUGT11的表達效率對體外多酶級聯(lián)反應(yīng)體系終產(chǎn)物RM產(chǎn)量的影響，將單啟動子操控下表達的EUGT11參與的反應(yīng)體系SUS1:UGT76G1:EUGT11=1:2:3（對照組）與三重啟動子操控下表達的EUGT11參與的反應(yīng)體系SUS1:UGT76G1:EUGT11/3 copies of T7=1:2:6.39（實驗組）在相同條件下反應(yīng)48 h后，用HPLC對反應(yīng)后各體系中的ST、RA、RD、RM進行定量分析，結(jié)果如圖6和表5所示。反應(yīng)進行48 h后，在體系SUS1:UGT76G1:EUGT11=1:2:3中，10 mmol/L ST轉(zhuǎn)化為7.85 mmol/L RA，2.29 mmol/L RD和1.61 mmol/L RM；在體系SUS1:UGT76G1:EUGT11/3 copies of T7=1:2:6.39中，10 mmol/L ST轉(zhuǎn)化為3.14 mmol/L RA，5.76 mmol/L RD和3.79 mmol/L RM（表5）。在兩個體系中，ST均完全轉(zhuǎn)化為RA，而在三重啟動子控制下的EUGT11參與的體系中，由于RA轉(zhuǎn)化率提升，使得RD和RM產(chǎn)量均高于單重啟動子控制下的EUGT11參與的反應(yīng)體系（圖6）。相比單重啟動子控制下的EUGT11參與的反應(yīng)體系，三重啟動子控制下的EUGT11使得反應(yīng)結(jié)束時RD產(chǎn)量提升2.52倍，RM產(chǎn)量也隨之提升2.35倍。

3 討論

UGT76G1和EUGT11是目前甜菊醇糖苷類物質(zhì)酶法生產(chǎn)中較常使用的糖基轉(zhuǎn)移酶，但多數(shù)生產(chǎn)方法僅利用單個酶與蔗糖合成酶偶聯(lián)產(chǎn)生單一種類的糖苷，且產(chǎn)物大多為RA或RD。朱清娟[15]利用重組畢赤酵母制備的粗酶液，在體外偶聯(lián)UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶與蔗糖合成酶，將10 mmol/L ST轉(zhuǎn)化合成8.20 mmol/L RA。楊玉鳳[16]利用重組大腸桿菌全細(xì)胞催化1 mmol/L RA轉(zhuǎn)化為0.1 mmol/L RD。而本文利用大腸桿菌表達的重組酶UGT76G1、EUGT11和SUS1搭建體外反應(yīng)通路，使廉價底物ST先經(jīng)UGT76G1催化為RA，再經(jīng)EUGT11催化產(chǎn)生RD，最后經(jīng)UGT76G1轉(zhuǎn)化為RM，該體外反應(yīng)通路旨在利用較簡單的生產(chǎn)方法得到更高品質(zhì)的甜味劑RM。

4 結(jié)論

3.1 本文通過比較重組酶UGT76G1對ST和RD的轉(zhuǎn)化率以及EUGT11對RA的轉(zhuǎn)化率，得知EUGT11對底物RA的轉(zhuǎn)化率最低，僅13.25%，而該酶參與的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)正是產(chǎn)生RM的前體RD的關(guān)鍵一步，因此，提升該酶酶活是提升終產(chǎn)物RM產(chǎn)量的關(guān)鍵。為提升該限速酶酶活，構(gòu)建了三重啟動子操控下表達的重組酶EUGT11，相比單啟動子操控下表達的重組酶EUGT11，三重啟動子使其酶活提升2.13倍。當(dāng)三重啟動子操控下表達的重組酶EUGT11參與整個體外多酶級聯(lián)反應(yīng)體系時，RD產(chǎn)量提升2.52倍，RM產(chǎn)量也隨之提升2.35倍，該反應(yīng)體系將10 mmol/L ST轉(zhuǎn)化為3.79 mmol/L RM。

3.2 本文提供的RM合成方法與直接催化RD生產(chǎn)RM的方法相比，底物廉價，催化效率較高，為此后RM生物合成的工業(yè)應(yīng)用提供新思路。但該一鍋法催化所得產(chǎn)物成分較復(fù)雜，含有多種糖苷類物質(zhì)，RM不易從眾多性質(zhì)相似的成分中分離。為得到純度更高的RM，可以繼續(xù)挖掘更優(yōu)質(zhì)的糖基轉(zhuǎn)移酶基因，或用異源表達量大且本底表達量低的宿主進行糖基轉(zhuǎn)移酶和蔗糖合成酶的異源表達，旨在獲得純度更高的RM。