細(xì)胞穿膜肽與人表皮生長因子 在大腸桿菌中的重組融合表達(dá)

李風(fēng)，柯博文，孫中偉，韓雙艷

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東省發(fā)酵與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006）

人表皮生長因子（human epidermal growth factor，hEGF）是一種單鏈小分子多肽，含53個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量為6.2 ku，6個(gè)半胱氨酸（Cys）在分了內(nèi)形成3對二硫鍵，等電點(diǎn)為4.6[1]。EGF是由美國Vanderbit大學(xué)醫(yī)學(xué)系Cohen教授[2]在1962年用羧甲基纖維素柱從小鼠頜下腺分離純化神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)的小分子多肽，研究發(fā)現(xiàn)這種活性多肽不僅能對神經(jīng)細(xì)胞有作用，而且與小鼠的眼瞼早開和牙齒提早萌芽也有關(guān)聯(lián)。1975年Cregory等[3]又從人尿液中提取出這種活性物質(zhì)，并命名為人表皮生長因子（hEGF），又因其可抑制胃酸的分泌，又稱抑尿胃素。EGF在人體各種組織和體液中都廣泛存在，包括血液、乳汁、胃液和十二指腸中，調(diào)節(jié)多種生理生命活動(dòng)，能夠加速組織的增殖與分化，促進(jìn)胚胎細(xì)胞的增殖與分化，影響器官的生長發(fā)育[4]；促進(jìn)表皮細(xì)胞生長，對皮膚相關(guān)疾病具有一定的修復(fù)治療價(jià)值等[5]；特別的，EGF對刺激性食物導(dǎo)致的胃腸潰瘍有顯著療效，對促進(jìn)胃腸粘膜的發(fā)育，參與受損粘膜的修復(fù)有著重要的作用[6]。

細(xì)胞穿膜肽（cell-penetrating peptide，CPP）是一類能攜帶大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的短肽，其穿膜能力不依賴經(jīng)典的胞吞作用[7]，已經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的生物大分子有寡聚核苷酸、肽段、蛋白質(zhì)、納米顆粒和脂質(zhì)體等[8]。穿膜肽重要的一個(gè)應(yīng)用是能夠作為載體攜帶多肽和蛋白質(zhì)跨越腸道[9]、肺上皮[10]以及穿越血腦屏障[11]等；Park等[12]證實(shí)了TAT-SOD和9Lys-SOD（超氧化物歧化酶SOD）具有穿透表皮細(xì)胞的能力。Guo等[13]構(gòu)建了重組基因TAT-hEGF-CD47（免疫球蛋白CD47），發(fā)現(xiàn)其能有效促進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞和皮膚上皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)作用與TAT-hEGF-CD47濃度呈正相關(guān)。給藥至皮膚后，TAT-hEGF-CD47由于TAT結(jié)構(gòu)域有效地穿透皮膚表皮層，并在皮膚中停留了很長時(shí)間，因?yàn)镃D47片段通過單核吞噬系統(tǒng)減緩了其清除速度。國內(nèi)對CPP（細(xì)胞穿膜肽）的研究也早已開始，梁英民等[14]將PTD（蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域）與慢性粒細(xì)胞白血病癌蛋白Bcr/Abl在大腸桿菌中融合表達(dá)，將純化出的蛋白加入培養(yǎng)的HL60細(xì)胞和C2C12細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)PTD（蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域）可以介導(dǎo)Bcr/Abl蛋白跨膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。余婷玉等[15]成功創(chuàng)建了一種含有穿膜肽標(biāo)記的熒光素酶（LUC）融合蛋白即TAT-LUC。與LUC相比，TAT-LUC能夠穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，并對ATP和腫瘤細(xì)胞具有更好的靈敏性。

天然EGF的來源十分有限，王武康等[16]利用8種分離工藝與2步柱層析，最終從40 L健康男性尿液中，制備出hEGF 2.36 mg。隨著基因工程技術(shù)的興起，已成功在不同的系統(tǒng)中表達(dá)出hEGF，包括大腸桿菌Escherichia coli（E. coli）[17]、豆科植物花生[18]、畢赤酵母Pichia pastoris（P. pastoris）[19]和家蠶[20]，逐漸滿足hEGF的需求量。人表皮生長因子（hEGF）由于其在上皮細(xì)胞的生長和分裂中起著重要作用，在皮膚相關(guān)損傷和疾病中具有良好的應(yīng)用前景；但其透膜效率低，以0.5 μg/g的劑量涂抹在皮膚12 h后累積透皮率僅有0.993%[21]；皮膚中的hEGF可以被單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)快速清除[22]，這些限制了它的應(yīng)用。為了克服hEGF透皮率低，利用大腸桿菌異源表達(dá)易形成包涵體等，綜合考慮人表皮生長因子hEGF表達(dá)形式和表達(dá)量，我們在hEGF的N端引入細(xì)胞穿膜肽Pep-1，再克隆至攜帶GST標(biāo)簽的表達(dá)載體PGEX-4T-1中，嘗試提高表達(dá)量和增加蛋白的可溶性，以圖提高h(yuǎn)EGF的生產(chǎn)效率，并對目的蛋白進(jìn)行了純化，為hEGF的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌BL21（DE3）和E.coli Top10’，由華南理工大學(xué)微生物酶學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。攜帶GST標(biāo)簽的表達(dá)質(zhì)粒PGEX-4T-1，購自Invitrogen公司；質(zhì)粒PUC57-epEGF，攜帶已經(jīng)過大腸桿菌密碼子優(yōu)化后的目的基因epEGF（EK/Pep-1/G4S/hEGF融合片段），該融合基因片段由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.1.2 主要試劑和工具酶

限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ購自TaKaRa公司；KOD DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、PCR Mix和標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)Marker購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；PCR純化試劑盒購Magen（美基）生物有限公司；質(zhì)粒小量制備試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；氨芐青霉素（Amp）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），生工生物工程（上海）有限公司；其余常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基（g/L）：10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g氯化鈉；SOC液體培養(yǎng)基（g/L）：20 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、0.5 g氯化鈉、KCl 0.186 g、MgCl20.39 g；2%葡萄糖；SOB液體培養(yǎng)基（g/L）：20 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、0.5 g氯化鈉、KCl 0.186 g、MgCl20.39 g；2× YT液體培養(yǎng)基（g/L）：16 g胰蛋白胨、10 g酵母提取物、5 g氯化鈉。TB液體培養(yǎng)基（g/L）：20 g胰蛋白胨、24 g酵母提取物、12.54 g K2HPO4、2.31 g KH2PO4、0.4%葡萄糖；LB固體培養(yǎng)基（g/L）：10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g氯化鈉、2 g瓊脂糖，根據(jù)需要添加Ampicillin，終濃度為100 μg/mL。

1.1.4 儀器與設(shè)備

知楚恒溫培養(yǎng)搖床，上海知楚儀表有限公司；PCR儀，德國Eppendorf公司；Eppendorf 5804R型高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)，德國Eppendorf公司；UV-2350型分光光度計(jì)，UNICO公司；AKTA蛋白純化系統(tǒng)，美國通用電氣公司；GST Focurose 4FF、Q Focurose 6HP預(yù)裝柱，武漢匯研生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 穿膜肽Pep-1與人表皮生長因子hEGF融合基因的優(yōu)化及合成

在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得人表皮生長因子hEGF蛋白序列（Sequence ID:2KV4_A）。將文獻(xiàn)報(bào)道的Pep-1蛋白序列（KETWWWETWWTEWSQPKKKRKV）通過柔性肽（GGGGS）連接至hEGF片段的N端，并且在穿膜肽N端添加腸激酶酶切位點(diǎn)（DDDDDK），如圖1所示。將該融合基因氨基酸序列送往合成，經(jīng)大腸桿菌密碼子優(yōu)化而獲得的堿基序列，全基因合成255 bp后克隆至質(zhì)粒pUC57，得到含有穿膜肽與人表皮生長因子融合基因的重組質(zhì)粒pUC57-epEGF。

圖1 融合蛋白EK-Pep1-G4S-HEGF重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建過程Fig.1 Construction of recombinant expression plasmid of fusion protein Ek-Pep1-G4S-hEGF

1.2.2 重組人表皮生長因子表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

在epEGF融合片段上下游分別引入BamH Ⅰ、XhoⅠ限制性酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物，（引物序列：epEGF-F：GGCCGGATCCGATGATGATGATAAAA AAGAAACC；epEGF-R：ATACTCGAGTTAGCGC A GTTCCCAC）。以pUC57-epEGF為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化，用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ對PCR回收產(chǎn)物及質(zhì)粒PGEX-4T-1分別進(jìn)行雙酶切，純化回收后用T4連接酶22 ℃進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli Top10感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR（引 物 序 列：epEGF菌 落PCRF：GCGCCGACATCA TAACGGTT，epEGF菌落PCR下引：CAGACAAGC TGTGACCGTC）。將陽性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，然后進(jìn)行BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切驗(yàn)證，之后重組質(zhì)粒送生工生物工程（上海）有限公司測序。測序結(jié)果顯示得到重組表達(dá)載體PGEX-4T-1-epEGF（縮寫為pGST-epEGF）。將鑒定后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)，在LB氨芐青霉素抗性平板上挑取單菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒雙酶切鑒定，將驗(yàn)證正確的菌種用于后續(xù)發(fā)酵。

1.2.3 目的蛋白的表達(dá)與SDS-PAGE分析

挑取鑒定正確的重組大腸桿菌BL21（DE3）-pGST-epEGF單菌落于10 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃，220 r/min，培養(yǎng)12～16 h。將菌液按照1:100轉(zhuǎn)接至100 mL的LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL氨芐青霉素）中，37 ℃，220 r/min，繼續(xù)培養(yǎng)到OD600為0.6～0.8時(shí)，加入1 mol/L的異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為1 mmol/L，16 ℃，200 r/min條件下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h。

將發(fā)酵液采用6600 r/min室溫離心10 min，收集菌體，用蒸餾水將菌體洗滌兩次后加入破碎緩沖液重懸菌體。在冰浴條件下超聲破碎20 min（破碎條件：6 mm變幅桿，頻率30%，超聲3 s，間隔3 s）。對破碎后的全菌液采用10000 r/min，4 ℃，30 min冷凍離心，分離上清和沉淀，將獲得的全菌液、上清、沉淀樣品分別進(jìn)行SDS-PAGE分析，確定融合蛋白的表達(dá)情況。

1.2.4 目的蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

1.2.4.1 epEGF融合蛋白誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化

挑取鑒定正確的陽性轉(zhuǎn)化子在37 ℃的LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL氨芐）過夜培養(yǎng)，按1:100的比例轉(zhuǎn)接到100 mL LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL氨芐）中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)，分別加入不同濃度IPTG（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L），30 ℃誘導(dǎo)8 h。等量收集菌體，以SDS-PAGE分析不同IPTG濃度下epEGF融合蛋白的表達(dá)量，并確定IPTG最佳誘導(dǎo)濃度。

1.2.4.2 epEGF融合蛋白誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化

將工程菌在37 ℃的條件下培養(yǎng)至OD600為0.4～0.8時(shí)加入0.4 mmol/L的IPTG分別在20、25、30、37 ℃下誘導(dǎo)過夜，收集等量菌體，以SDS-PAGE分析不同溫度下融合蛋白的表達(dá)量，并確定最佳誘導(dǎo)溫度。

1.2.4.3 epEGF融合蛋白誘導(dǎo)培養(yǎng)基的優(yōu)化

挑取鑒定正確的陽性轉(zhuǎn)化子在37 ℃的LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL氨芐）過夜培養(yǎng)，按1:100的比例分別轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基、SOC液體培養(yǎng)基、SOB液體培養(yǎng)基、2×YT液體培養(yǎng)基、TB液體培養(yǎng)基，均含有100 μg/mL氨芐青霉素，在IPTG濃度為0.4 mmol/L，誘導(dǎo)溫度為20 ℃的條件下，誘導(dǎo)過夜。分別收集等量菌體，以SDS-PAGE分析不同培養(yǎng)基下重組融合蛋白的表達(dá)量，并確定最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.2.4.4 epEGF融合蛋白誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化

將工程菌在37 ℃的條件下培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)加入0.4 mmol/L的IPTG設(shè)置誘導(dǎo)溫度為20 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)，分別在2、4、6、8、10、12 h時(shí)間點(diǎn)收集等量菌體，通過SDS-PAGE方法鑒定不同時(shí)間段epEGF融合蛋白的表達(dá)量，從而確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

1.2.5 目的蛋白的分離純化與SDS-PAGE電泳分析

利用GST親和層析法[23]，對已用0.45 μm濾膜過濾的菌體破碎上清進(jìn)行純化。pH 8.0緩沖液（10 mmol/L GSH，50 mmol/L Tris-HCl）并收集洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

收集到的GST純化樣品經(jīng)超濾管濃縮后，置換其中的GSH，再用0.22 μm濾膜過濾后按照上述方法上樣至陰離子交換柱（Q Focurose 6HP 5 mL），按照Q柱純化方法進(jìn)行融合蛋白的第二步純化。收集Q離子柱洗脫液，收集洗脫液后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.6 蛋白濃度計(jì)算方法

應(yīng)用軟件Image J分析蛋白電泳條帶，Image J方法是利用灰度值來近似估算蛋白的純度，條帶的深淺和面積綜合代表蛋白的量；利用Bradford[24]方法測定優(yōu)化誘導(dǎo)工藝和純化后蛋白濃度；目的蛋白的相對含量利用如下公式計(jì)算。

對濃度的計(jì)算公式如下：

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析與處理利用軟件Graphpad prism 8.0。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組人表皮生長因子表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

以帶有目的片段epEGF的PUC57質(zhì)粒為模板，通過PCR擴(kuò)增得到帶有酶切位點(diǎn)的基因片段。PCR擴(kuò)增結(jié)果如下圖2a所示。從圖中可以看出PCR產(chǎn)物條帶單一且明亮，特異性得到目的PCR產(chǎn)物。目的片段的長度在250 bp左右，與預(yù)期結(jié)果相符。

按照材料方法1.2.2描述，對PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒PGEX-4T-1分別用BamH 1和Xho 1進(jìn)行雙酶切，體外連接構(gòu)建重組表達(dá)載體pGST-epEGF，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，利用氨芐抗性平板進(jìn)行抗性篩選，利用菌落PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。菌落PCR鑒定結(jié)果如圖2b所示。從圖中可以看出，編號1～10的菌株的菌落PCR產(chǎn)物片段在1000 bp左右，與理論值相符，初步判斷重組質(zhì)粒pGST-epEGF對應(yīng)的轉(zhuǎn)化子已構(gòu)建成功。

菌落PCR鑒定正確的轉(zhuǎn)化子，將其接種到LBA液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，保存甘油菌并提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖2c所示。從圖中可以看出，酶切2條帶大小約為5000 bp和250 bp，符合理論結(jié)果，可以基本判定重組表達(dá)質(zhì)粒成功構(gòu)建。

圖2 重組人表皮生長因子表達(dá)載體的鑒定； Fig.2 Identification of recombinant human epidermal growth factor expression vector

將1～5號菌株的質(zhì)粒，送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行基因測序，測序結(jié)果與目的基因比對完全正確，可以得出結(jié)論重組表達(dá)質(zhì)粒已成功構(gòu)建。

2.2 目的蛋白的表達(dá)與SDS-PAGE分析

按照“1.2.3”對重組人表皮生長因子工程菌進(jìn)行發(fā)酵，取重組菌BL21（DE3）-pGST-epEGF未誘導(dǎo)與誘導(dǎo)的發(fā)酵液離心后的菌體，加入蛋白上樣緩沖液，煮沸后直接SDS-PAGE鑒定，結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯鲈?6 ku處出現(xiàn)明顯條帶，而未誘導(dǎo)菌株無明顯此條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，即初步說明重組菌株表達(dá)了重組epEGF。

圖3 重組工程菌SDS-PAGE鑒定Fig.3 SDS-PAGE Identification of recombinant engineered bacteria

2.3 融合蛋白發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 IPTG濃度優(yōu)化

圖4 融合蛋白表達(dá)條件中誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化Fig.4 Optimization of inducer concentration in fusion protein expression condition

如圖4所示，以不加IPTG誘導(dǎo)的菌株作對照，分別在0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L，不同濃度的IPTG誘導(dǎo)下對重組菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，分析不同濃度下SDS-PAGE電泳圖，利用1.2.6蛋白濃度計(jì)算方法，計(jì)算目的蛋白表達(dá)的相對含量；結(jié)果表明，在其他條件一樣的情況下，當(dāng)IPTG的濃度為0.4 mmol/L時(shí)，目的蛋白占總蛋白的含量最高，約為0.13 mg/mL。在誘導(dǎo)劑濃度偏高或偏低時(shí)，蛋白表達(dá)量均有所降低，因而認(rèn)為融合蛋白epEGF最適誘導(dǎo)劑濃度為0.4 mmol/L。

2.3.2 溫度優(yōu)化

圖5 融合蛋白表達(dá)條件中誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化Fig.5 Optimization of induction temperature in fusion protein expression condition

在發(fā)酵過程中分別設(shè)定不同的誘導(dǎo)溫度（37、30、25、20 ℃），研究溫度對工程菌表達(dá)目的融合蛋白的影響。結(jié)果如圖5所示，溫度對工程菌表達(dá)目的蛋白有影響。當(dāng)誘導(dǎo)溫度設(shè)置為20 ℃時(shí)，蛋白表達(dá)量明顯高于其他對照組，此時(shí)蛋白含量為0.12 mg/mL。即工程菌最優(yōu)表達(dá)溫度為20 ℃。

2.3.3 培養(yǎng)基優(yōu)化

選擇了5種常用的細(xì)菌培養(yǎng)基，LB（Luria-Bertani）、SOB（Super Optimal Broth）、SOC（Super Optimal broth with Catabolite repression）、TB（Terrific Broth）、2×YT（2×YT medium）來探究培養(yǎng)基對蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果如圖6所示。使用TB與SOC后，蛋白表達(dá)量較其他培養(yǎng)基有所提高，其中TB對蛋白含量的提高最為明顯。可能原因是這兩種培養(yǎng)基含有葡萄糖，提供更多的碳源，有利于蛋白質(zhì)的合成，即工程菌BL21（DE3）-pGST-epEGF最適發(fā)酵培養(yǎng)基為TB培養(yǎng)基。

圖6 融合蛋白表達(dá)條件中培養(yǎng)基的優(yōu)化Fig.6 Optimization of medium under the expression conditions of fusion protein

2.3.4 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化

在誘導(dǎo)過程中0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h，分別取等量菌體，直接取適量菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖7所示。在誘導(dǎo)2 h時(shí)已經(jīng)有目的蛋白的表達(dá)，2 h～8 h內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，目的蛋白表達(dá)量也在逐步增加，超過8 h后，隨著時(shí)間的增加，目的蛋白表達(dá)量逐漸減少，故確定8 h是工程菌最適誘導(dǎo)時(shí)間。發(fā)酵液目的蛋白最終濃度為0.12 mg/mL。

圖7 融合蛋白表達(dá)條件中誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化Fig.7 Optimization of induction time in fusion protein expression condition

2.4 融合蛋白的初步純化

2.4.1 融合蛋白GST Focurose 4FF親和層析

按照材料與方法1.2.5中描述GST親和層析柱操作方案對破碎液上清進(jìn)行第一步純化，結(jié)果如圖8所示。上清經(jīng)GST一步純化，得到目的蛋白純度為66.82%（圖8a融合蛋白表達(dá)各個(gè)步驟SDS-PAGE電泳圖，圖8b為純化階段的色譜圖穿透峰和洗脫峰如圖上箭頭所注）；收集洗脫液進(jìn)行超濾濃縮，置換其中的還原型谷胱甘肽，濃縮后的樣品用于融合蛋白的第二步純化。

2.4.2 融合蛋白陰離子交換層析

超濾濃縮后的樣品經(jīng)Q Focurose 6HP陰離子柱純化后，結(jié)果如圖9所示。從圖中可以看出目的蛋白在0.4 mol/L NaCl濃度條件下被洗脫下來，利用Image J進(jìn)行灰度掃描，顯示純化后的目的蛋白純度達(dá)到92.57%。

圖8 融合蛋白GST親和層析柱純化結(jié)果Fig.8 Purification results of fusion protein GST by affinity chromatography column

圖9 融合蛋白陰離子交換層析柱純化結(jié)果Fig.9 Purification results of fusion protein on anion exchange chromatography column

2.5 討論

本研究構(gòu)建重組大腸桿菌BL21（DE3）/PGEX-4T1-epEGF，成功表達(dá)可溶性的含有細(xì)胞穿膜肽的人表皮生長因子，通過發(fā)酵條件優(yōu)化，目的融合蛋白的量可達(dá)0.13 mg/mL。相對黃秉仁等[25]在酵母中表達(dá)的含量4 mg/L提高了32.5倍，且表達(dá)周期相比酵母系統(tǒng)大大縮短。同樣在大腸桿菌中，甘人寶等[26]合成pAE-8表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌中的表達(dá)量為1.5 mg/L。趙忠良等[27]也將EGF與GST標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)，但是其EGF的表達(dá)量只占細(xì)菌總蛋白的18%，本研究構(gòu)建的融合蛋白通過特殊表達(dá)載體，創(chuàng)新性的添加人工合成細(xì)胞穿膜肽Pep-1融合表達(dá)，利用tac啟動(dòng)子表達(dá)水平提高到21.58%。傳統(tǒng)分離純化人表皮生長因子需經(jīng)過8種分離工藝與2步柱層析[16]，本研究中重組蛋白經(jīng)過2步柱層析，純度達(dá)到92.57%，簡化了純化工藝，大大節(jié)約了成本，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供了可能。

3 結(jié)論

人表皮生長因子（hEGF）在皮膚損傷修復(fù)中具有顯著作用，獲取高產(chǎn)EGF的重組基因工程菌成為熱門的研究方向。本研究構(gòu)建了含有穿膜肽的人表皮生長因子，即重組Pep-1-hEGF（epEGF），并在大腸桿菌中成功表達(dá)了融合蛋白GST-epEGF。論文也研究了發(fā)酵條件對融合蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)最適發(fā)酵條件為：IPTG濃度為0.4 mmol/L、溫度為20 ℃、最適發(fā)酵培養(yǎng)基為TB液體培養(yǎng)基、誘導(dǎo)時(shí)間為8 h。通過添加GST促溶標(biāo)簽與發(fā)酵條件優(yōu)化，明顯提高目的蛋白的可溶性表達(dá)，目的蛋白表達(dá)量占總蛋白的21.58%，可達(dá)0.13 mg/mL。通過GST親和層析與陰離子交換層析兩步純化后目的蛋白的純度達(dá)到92.57%。本研究成功實(shí)現(xiàn)了人表皮生長因子在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)，并對其進(jìn)行了初一步純化，后續(xù)嘗試采用腸激酶處理，去除GST標(biāo)簽，以便獲得更理想的無免疫副反應(yīng)的人表皮生長因子蛋白。