棕櫚酸抑制果蠅幼蟲的生長發(fā)育及糖脂代謝

章嘉淇，吳進蘭，吳明江，佟海濱

（溫州大學生命與環(huán)境科學學院,浙江溫州 325035）

代謝綜合征（Metabolic Syndrome，MS）是一組以中心性肥胖為基礎，合并高血壓、血糖以及血脂代謝異常等多種代謝紊亂的臨床綜合征[1]，其被認為是II型糖尿病以及心血管等疾病的主要危險因素[2,3]。由于現(xiàn)代社會生活水平及生活方式的變化，一方面不合理的膳食結構使得民眾高糖高脂食物攝入普遍增加，另一方面民眾出行及生活方式的改變也導致運動量減少，因此肥胖、糖尿病等代謝綜合征患病人群呈現(xiàn)直線上升趨勢，我國人口的患病率已高達33.90%[4]。

胰島素抵抗是代謝綜合征發(fā)生發(fā)展的關鍵病理基礎[5]，與中心性肥胖密切相關。肥胖患者體內大量的游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FAs）會抑制胰島素對骨骼肌和肝臟等靶器官發(fā)揮效應作用，從而導致胰島素抵抗的發(fā)生[6]。同時，高濃度的游離脂肪酸還會導致胰島β細胞凋亡，從而導致胰島素分泌絕對不足[7]。多項研究表明膳食脂肪中不同種類的脂肪酸對胰島素敏感性的影響不同[8]。棕櫚酸（palmitate acid，PA）是人體攝入量最多的脂肪酸之一，其以甘油酯的形式廣泛存在于動植物油脂中[9]。研究發(fā)現(xiàn)PA能夠誘導骨骼肌、心肌和肝臟細胞等發(fā)生胰島素抵抗[10]，被認為是致肝細胞脂毒性的主要分子之一[11]。此外，有研究報道高脂飲食會導致神經元中PA積累，PA的過量積累導致大腦胰島素抵抗和長期增強功能受損，從而導致大腦記憶功能障礙[12]。但PA對代謝綜合征等疾病發(fā)生發(fā)展的影響尚不清楚。

黑腹果蠅因其在代謝調控通路上與哺乳動物有著高度的相似性[13,14]，是研究代謝性疾病較好的模式生物。因此，本研究利用黑腹果蠅作為模式生物，研究PA對果蠅生長發(fā)育和糖脂代謝的影響，并進一步探究PA與代謝綜合征發(fā)生發(fā)展之間的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

野生型黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）w118，購自清華果蠅中心。將果蠅培養(yǎng)于人工氣候箱，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃，相對濕度60%，光照時間12 h。

1.1.2 實驗試劑和儀器

棕櫚酸（PA）、吐溫80：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蔗糖、葡萄糖、酵母、無水氯化鈣：生工生物工程（上海）股份有限公司；總蛋白（TP）、葡萄糖（GLU）、甘油三酯（TG）檢測試劑盒：深圳市庫貝爾生物科技股份有限公司；對羥基苯甲酸甲酯：上海達瑞精細化學品有限公司；RNA提取、反轉錄試劑：北京全市金生物技術有限公司；AL104電子天平：梅特勒-托利多國際有限公司；iMagic-V7全自動生化分析儀：深圳市庫貝爾生物科技股份有限公司；Light Cycler?96熒光定量PCR儀：瑞士羅氏診斷應用科學部；Tissue Lyser II組織破碎儀：德國QIAGEN生物技術有限公司；SOPTOP SZMN顯微鏡：舜宇光學科技（集團）有限公司

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配置

250 mL培養(yǎng)基中含有蔗糖8 g、葡萄糖16 g、玉米粉20 g、酵母8 g、瓊脂1.75 g、氯化鈣0.18 g、丙酸2 mL、對羥基苯甲酸甲酯0.50 g、吐溫-80 2.50 mL、此為本實驗中的普通（CTRL組）培養(yǎng)基配方。高脂培養(yǎng)基（PA組）的配置方法與普通培養(yǎng)基基本一致，但需在普通培養(yǎng)基的基礎上加入2.50%濃度的PA。

1.2.2 果蠅幼蟲生長狀態(tài)和體重測定

從將果蠅受精卵接種到CTRL組和PA組培養(yǎng)基中開始計時，待果蠅生長到72 h開始對果蠅幼蟲進行體重稱量以及拍照記錄生長情況，之后每隔24 h重復實驗，直到大部分幼蟲結蛹。

1.2.3 蛹面積與蛹體積測定

將毛刷蘸取少量水后刷在蛹上，小心將其取下擺放在載玻片上，在顯微鏡下觀察拍攝，使用Image J軟件測量蛹面積。使用Image J軟件測量蛹的長和寬，根據(jù)公式（1）計算得到各組蛹體積。

式中：

V——蛹體積；

L——蛹的長度；

W——蛹的寬度。

1.2.4 蛹化率與羽化率測定

成蟲蛹化率根據(jù)式（2）計算得到

成蟲羽化率根據(jù)式（3）計算得到。

1.2.5 成蟲重量、爬行能力以及翅膀面積的測定

成蟲重量：將羽化不超過8 h的成年果蠅轉移到新培養(yǎng)基中放置24 h，用CO2麻醉后將雌雄果蠅分開放入培養(yǎng)管，采用分析天平稱重后根據(jù)式（4）計算得到成蟲平均體重。

爬行測試：先將果蠅放入長度20 cm透明空管內在室溫環(huán)境下適應5 min，輕敲透明管，使所有果蠅掉落于管底，對8 s內爬過10 cm標記線的果蠅數(shù)量進行記錄，操作每組重復3次，每次重復間隔1 min作為休息時間。對通過標記線的果蠅根據(jù)式（5）計算。

翅膀面積：隨機收集不同培養(yǎng)基的雌雄果蠅成蟲各10只，分離翅膀，在顯微鏡下拍照，使用Image J軟件計算各組果蠅翅膀D區(qū)的相對面積。

1.2.6 三酰甘油和海藻糖含量測定

取三齡幼蟲，加入0.05% Tween-20的磷酸鹽緩沖液，加入2粒3 mm不銹鋼珠，于高通量研磨儀中研磨4 min。研磨完成后勻漿于12000轉離心5 min，取上清，再于12000 r/min下離心5 min，取上清液120 μL于70 ℃加熱5 min，于生化分析儀中測定TG、TP。

取三齡幼蟲，用針扎破幼蟲腹部后離心，離心結束后取1 μL血淋巴，加入50 μL PBS和1 μL海藻糖酶，在37 ℃下孵育3 h，之后用生化分析儀測定GLU。

1.2.7 果蠅幼蟲胰島素樣肽測定

表1 qRT-PCR引物設計Table 1 Designed primer sets forqRT-PCR

收集CTRL組和PA組三齡幼蟲樣品，每組3個生物樣品重復,每個樣品7只幼蟲，Trizol試劑參照常規(guī)步驟提取mRNA，反轉錄得cDNA。以RP49作為內參基因，熒光實時定量PCR測量胰島素樣肽Dilp2、Dilp3、Dilp5等基因的表達情況。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 8.4進行統(tǒng)計學分析，組間差異采用t檢驗分析（*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001）。本研究中的試驗結果至少重復3次獨立實驗。

2 結果與討論

2.1 PA影響果蠅幼蟲的生長發(fā)育

為了探究PA對果蠅幼蟲生長發(fā)育的影響，本實驗記錄了自72 h起，每隔24 h果蠅幼蟲的形態(tài)變化情況。如圖1所示，在72 h～120 h時，PA組和CTRL組果蠅幼蟲形態(tài)無明顯差異。至144 h時，CTRL組果蠅幼蟲已出現(xiàn)白蛹，即結蛹早期的形態(tài)，而PA組大部分還處于三齡幼蟲后期階段，生長發(fā)育稍滯后于CTRL組。在168 h時CTRL組幼蟲大部分已成棕褐色蛹，而PA組大多還處于蛹的早期，蛹顏色較淡，直到192 h時PA組大部分幼蟲才發(fā)育成棕褐色的蛹。上述結果表明，PA處理會導致果蠅幼蟲生長發(fā)育滯后。

圖1 PA對果蠅幼蟲生長狀態(tài)和速度的影響Fig.1 Effects of PA on the growth state and speed of drosophila larvae

由圖2d可見，在72 h～120 h時PA組和CTRL組幼蟲體重無明顯差異。蛹重如圖2a所示，CTRL組果蠅平均蛹重為1.26 mg，而PA組果蠅平均蛹重為1.09 mg，明顯低于CTRL組（p＜0.05）。CTRL組蛹面積為2.23 mm2，蛹體積為1.26 mm3，而PA組的蛹面積和蛹體積都有所下降，分別為2.05 mm2和1.13 mm3（圖2b、2c）。

果蠅的生長發(fā)育經歷卵、幼蟲、蛹、成蟲4個階段，羽化率和蛹化率是衡量果蠅發(fā)育是否正常的重要指標。如圖2e、2f所示，CTRL組和PA組果蠅蛹化率在144 h時差異最大，分別為37.50%和22.50%。最終蛹化率CTRL組為65%，PA組為61.25%。CTRL組和PA組羽化率在240 h時相差最大，分別為51.70%和24.40%。最終羽化率CTRL組為93.27%，PA組為83.24%。由此可知，PA組蛹化率和羽化率均低于CTRL組，部分幼蟲蛹化后未能羽化，表明PA影響果蠅三齡幼蟲后期生長發(fā)育，降低蛹化率和羽化率，部分幼蟲出現(xiàn)蛹期死亡情況。

圖2 PA對果蠅幼蟲生長發(fā)育的影響Fig.2 Effects of PA on the growth and development of drosophila larvae

2.2 PA影響果蠅成蟲個體大小和爬行能力

為了進一步探究PA攝入對果蠅發(fā)育的影響，本研究分別檢測了雌雄果蠅成蟲的體重以及翅膀D區(qū)面積的大小。如圖3a，PA組雌蠅體重為0.78 mg，雄蠅為0.58 mg，而CTRL組雌蠅和雄蠅體重分別為0.91 mg和0.68 mg，PA組雌蠅和雄蠅的體重均顯著低于CTRL組（p＜0.01，p＜0.05）。PA組雌性果蠅D區(qū)翅膀面積相比于CTRL組顯著減少（圖3c，p＜0.001），而雄性果蠅無差異（圖3d）。上述結果表明PA對雌性果蠅的翅膀發(fā)育影響較大，而對雄性果蠅翅膀未見顯著影響。

為了探究PA降低的果蠅體重是否伴隨著運動活性的改變，本實驗測量了成蟲的爬行能力。如圖3b所示，PA組果蠅的活躍度低于CTRL組，雌蠅和雄蠅的爬行能力分別降低了41.35%和22.78%。白野等[15]通過在果蠅培養(yǎng)基中添加30%的豬油，發(fā)現(xiàn)果蠅羽化率與對照組比較降低了42%，雌雄成蟲體重與對照組相比分別顯著增加了35.40%和17.40%（p＜0.05）。雄果蠅的爬行能力顯著下降，與對照組相比下降了23.30%（p＜0.01），這與本研究中果蠅羽化率降低和運動能力減弱的結果一致，而本研究發(fā)現(xiàn)PA處理導致成蟲體重減小。

圖3 PA對果蠅成蟲生長發(fā)育的影響Fig.3 Effects of PA on the growth and development of adult drosophila

2.3 PA導致果蠅糖脂代謝紊亂

海藻糖是果蠅血淋巴中循環(huán)糖的主要成分，其含量可反映果蠅整體血糖水平[16]。昆蟲脂類代謝進程與哺乳動物類似，如果長期攝入過量脂肪酸，就會導致代謝紊亂，脂肪積累過多時則會對器官產生脂毒性[17]。如圖4a、4b所示，PA組三齡幼蟲血淋巴中海藻糖和TG含量均顯著高于CTRL組（p＜0.05）。

與哺乳動物利用胰島素調控血糖類似，果蠅通過體內類似胰島素的物質-果蠅胰島素樣肽（Drosophila insulin-like peptides，DILPs）來調控糖穩(wěn)態(tài)。在果蠅8種DILPs中，DILP2、DILP3、DILP5與哺乳動物胰島素最為相似，尤其是DILP2，其與人類的胰島素功能極為接近[18]。在脂代謝方面，DILPs可以促進脂肪的合成，使血淋巴中游離脂肪酸減少，而DILPs缺乏可造成脂代謝紊亂，脂肪貯存減少，分解加強，血脂升高[19]。如圖4c所示，與CTRL組相比，PA組幼蟲體內Dilp2、Dilp3、Dilp5基因的表達均呈現(xiàn)顯著性下調（p＜0.01），而DILPs分泌不足會導致果蠅體內糖脂代謝紊亂，這與研究中TG和海藻糖含量顯著性升高一致。過量攝入PA會導致脂肪酸大量積累，也會對果蠅器官產生脂毒性，損傷胰島素生成細胞[20]。Heinrichsen等[21]通過添加20%的椰子油培育出“肥胖”果蠅，發(fā)現(xiàn)其體內TG和血糖水平顯著升高，這與本研究中TG和海藻糖含量升高結果相似。Birse等[22]發(fā)現(xiàn)飼喂含30%椰子油的高脂飼料可以復制果蠅成蟲糖尿病模型，果蠅體內TG和血糖含量升高，產生胰島素抵抗，其可能機制是由于TOR信號通路抑制了三酰甘油脂酶（bmm）的產生，同時促進了脂肪酸合成酶的表達。

圖4 PA對果蠅糖脂代謝的影響Fig.4 Effects of PA on glucose and lipid metabolism in Drosophila

3 結論

本研究采用含2.50%濃度的PA培養(yǎng)基喂食果蠅，研究PA對果蠅幼蟲體重、蛹化率與羽化率、蛹重、蛹面積、蛹體積、成蟲體重、成蟲爬行能力、成蟲翅膀面積大小以及三齡幼蟲體內海藻糖、甘油三酯、胰島素樣肽Dilp2、Dilp3、Dilp5含量的影響。結果表明：相比于CTRL組，PA導致果蠅的蛹化率及羽化率分別降低了3.75%和10.03%，蛹面積和蛹體積有所下降。PA組雌性成蟲體重與CTRL組相比減小了0.13 mg，雄性成蟲體重減少了0.10 mg。PA組雌蠅的運動活性降低了41.35%，雄蠅降低了22.78%。PA組雌性果蠅翅膀面積明顯減小，而雄性果蠅無明顯差異。PA組幼蟲海藻糖和甘油三酯含量明顯升高，而Dilp2、Dilp3、Dilp5的表達量顯著下降。以上結果表明PA抑制果蠅的生長發(fā)育，擾亂了幼蟲的糖脂代謝平衡。同時，本實驗中PA處理組的果蠅在幼蟲時期生長發(fā)育異常，三齡幼蟲體內海藻糖和甘油三酯含量偏高，這與兒童及青少年由于不健康的飲食結構攝入大量高脂食物導致機體血糖升高、脂質失調，引發(fā)肥胖、胰島素抵抗并最終導致2型糖尿病等慢性代謝疾病的發(fā)病機制相似。因此，研究PA導致果蠅幼蟲生長發(fā)育異常和糖脂代謝紊亂的機制，可以為高脂飲食導致的兒童肥胖等代謝綜合征提供科學依據(jù)。