具有降膽固醇功能的羅伊氏乳桿菌的篩選 及其益生作用

余萍，矯艷平，張春宇，趙迪，宋佳，王婷婷，江楓

（漢臣氏（沈陽）兒童制品有限公司，遼寧沈陽 110000）

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，膳食結(jié)構(gòu)的改變、缺乏運動及不良生活習(xí)慣的影響，血脂異常的人群明顯增加[1]。血脂異常主要包括甘油三酯、低密度脂蛋白、膽固醇其中一種或多種水平升高。血清中過高的膽固醇是引起動脈粥樣硬化、冠心病等心腦血管疾病重要因素之一[2,3]。人體血清膽固醇含量比正常水平每升高1 mmol，人體患冠心病的危險就會增加約35%[4]。因此降低血清膽固醇是人們預(yù)防心血管疾病的有效措施之一。然而，相關(guān)藥物價格高且副作用大，利用天然食物或微生物來降低血清膽固醇成為人們研究的熱潮[5]。

益生菌是一類能夠定植于宿主腸道內(nèi)，并能夠產(chǎn)生對腸道有害微生物具有抑制作用的乳酸、細(xì)菌素及過氧化氫等物質(zhì)而促進(jìn)宿主腸道健康的活性微生物的總稱，目前被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域[6,7]。以乳酸菌為代表的益生菌是人體不可缺乏的有益菌，乳酸菌是一類能夠發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸的革蘭氏染色陽性無芽孢的細(xì)菌，常見的主要有雙歧桿菌屬和乳桿菌屬[8]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，益生乳酸菌不僅具有維持腸道微生態(tài)平衡的作用，有些菌株還具有抗氧化、降膽固醇、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等特殊保健功能[9-11]。獲得具有降膽固醇功能的菌株并能夠用于高膽固醇血癥的微生物制劑、保健食品的開發(fā)，對降低血清膽固醇的治療具有重要意義。

本研究從奶豆腐樣品中分離出5株乳桿菌，從中篩選出一株具有降膽固醇能力強(qiáng)的羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri），并對其耐酸、耐膽鹽及耐胃腸液方面進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步開發(fā)降膽固醇功能方面的產(chǎn)品應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品

篩菌樣品采樣于內(nèi)蒙古呼倫貝爾滿洲里通達(dá)牧場制作的奶豆腐，無菌操作取樣寄送至本實驗室，并于-20 ℃條件保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、牛肉粉3 g/L、酵母粉4 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、檸檬酸2 g/L、乙酸鈉5 g/L、葡萄糖20 g/L、七水合硫酸鎂0.58 g/L、四水合硫酸錳0.25 g/L、吐溫-80 0.6 g/L、番茄汁10 mL/L、瓊脂粉20 g/L，pH調(diào)至6.5；115 ℃，30 min滅菌。

改良MRS培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基中添加碳酸鈣10 g/L、中性紅0.05 g（1%濃度5 mL），調(diào)pH至5.5；115 ℃，30 min滅菌。

高膽固醇培養(yǎng)基（MRS-CHOL）：MRS培養(yǎng)基中添加巰基乙酸鈉2 g/L、牛膽鹽（進(jìn)口）3 g/L、膽固醇0.1 g/L，pH調(diào)至6.5；115 ℃，30 min滅菌。

1.1.3 主要試劑及儀器

主要試劑：膽固醇（C8667 Sigma）、牛膽鹽（TLC Sigma），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；PBS緩沖溶液（20X），生工生物工程（上海）股份有限公司；無水乙醇（分析純），天津市永大化學(xué)試劑有限公司；冰乙酸（分析純AR）、鄰苯二甲醛（化學(xué)純CP）、濃硫酸（分析純AR），中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；硫代乙醇酸鈉（巰基乙酸鈉）（分析純AR），上海麥克林生化科技有限公司；氫氧化鉀（分析純），天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；正己烷（分析純AR），天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

主要儀器：SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHP-500BS電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；XSP-10CA生物顯微鏡，上海佑科儀器儀表有限公司；DZKW-S-8電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；SCIENTZ-DⅡ 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；TGL-16M低溫高速離心機(jī)，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；LAI-3DT厭氧工作站，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離純化

取適量樣品加入到滅菌的緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基中，混勻后放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h；然后取500 μL培養(yǎng)液加入到4.5 mL改良MRS培養(yǎng)基中振蕩混勻，用生理鹽水進(jìn)行從10-2～10-6稀釋度依次十倍梯度稀釋，每個稀釋度分別吸取100 μL加入到改良MRS固體平板培養(yǎng)基上，用涂布棒進(jìn)行涂布，每個稀釋度做兩個平板涂布，然后將平板倒置放入自封袋中，其中一個再裝入?yún)捬醮校糜谌?7 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。

挑取具有目的菌株典型特征（觀察形態(tài)、大小、色澤、及其透明度等）、菌落較大、活性較強(qiáng)的單菌落，于改良MRS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線純化培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，如此反復(fù)2～3次，直到劃線平皿中菌落特征一致；將純化菌株進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀察及過氧化氫實驗，將革蘭氏染色陽性及過氧化氫酶陰性的菌株定為疑似乳酸菌，將純化后菌株接種于MRS斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 降膽固醇功能性測定

1.2.2.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

制備1 mg/mL膽固醇溶液：稱取0.1 g膽固醇，用無水乙醇定容至100 mL，用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾除菌后4 ℃儲藏備用。

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：分別吸取50、100、150、200、250、300 μL 1 mg/mL膽固醇溶液于10 mL干凈的容量瓶中，用無水乙醇定容，配成5、10、15、20、25、30 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

吸取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液4 mL于50 mL離心管中，用60 ℃下氮氣吹干儀通氮氣流吹干溶劑，加入4 mL鄰苯二甲醛溶液，震蕩，靜置10 min后，加入2 mL濃硫酸，混勻，顯色10 min，用不加膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的鄰苯二甲醛和濃硫酸為空白調(diào)零，測定550 nm處的吸光值。以膽固醇濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，ΔOD550為縱坐標(biāo)，繪制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Cholesterol standard curve

1.2.2.2 試驗菌株的制備

將1.2.1中分離純化的菌株劃線分離出單菌落，挑取單菌落接種于5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)20 h后，再次轉(zhuǎn)接至100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)17 h，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 降膽固醇能力的測定

采用鄰苯二甲醛比色法[12,13]來測定菌株的降膽固醇能力。取1.2.2.2培養(yǎng)后的菌液按10 g/L接種量接種于50 mL高膽固醇培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，然后以8000 r/min的轉(zhuǎn)速4 ℃離心10 min，收集上清液，通過鄰苯二甲醛法測定上清液中膽固醇含量。以未接種菌株培養(yǎng)液的高膽固醇培養(yǎng)基做對照。按下面公式（1）計算降膽固醇率。重復(fù)實驗3次求平均值。

式中：

C0——未接種培養(yǎng)液離心上清液中膽固醇實測濃度，μg/mL；

C——接種后發(fā)酵液離心上清液中膽固醇實測濃度，μg/mL。

1.2.3 降膽固醇功能菌株的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)特征鑒定

將菌株HCS02-001接種至MRS瓊脂培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌株形態(tài)。并挑取單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在生物顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.2.3.2 生理生化及16S rDNA鑒定

菌種生理生化特征鑒定及16S rDNA鑒定委托中國科學(xué)院微生物研究所完成。

1.2.4 耐酸性試驗

將活化三次的菌液按照10%的接種量分別接種于空白對照、pH 2.0和pH 3.0的MRS培養(yǎng)基中。37 ℃靜置培養(yǎng)，于17 h取樣，用滅菌的生理鹽水進(jìn)行系列10倍稀釋，分別取適宜稀釋度的菌液1000 μL進(jìn)行活菌計數(shù)操作，每個稀釋度2次重復(fù)，37 ℃靜置培養(yǎng)36～48 h后計數(shù)。耐酸試驗菌株存活率計算方法按公式（2）計算。

式中：

N1——不同pH條件培養(yǎng)后取樣計數(shù)測得的活菌數(shù)；

N0——空白對照試驗測得的活菌數(shù)。

1.2.5 耐膽鹽試驗

將活化三次的菌液按照10%的接種量分別接種于不同膽鹽濃度0.3%、0.5%的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)，于17 h取樣，用滅菌的生理鹽水進(jìn)行系列10倍稀釋，分別取適宜稀釋度的菌液1000 μL進(jìn)行活菌計數(shù)操作，每個稀釋度2次重復(fù)，37 ℃靜置培養(yǎng)36～48 h后計數(shù)。耐膽鹽試驗菌株存活率計算方法見公式（3）。

式中：

N2——不同膽鹽濃度條件培養(yǎng)后取樣計數(shù)測得的活菌數(shù)；

N0——空白對照試驗測得的活菌數(shù)。

1.2.6 模擬胃液試驗

配制人工胃液：取稀鹽酸16.4 mL，加蒸餾水800 mL；加入胃蛋白酶10 g（1%，m/V），搖勻后用蒸餾水稀釋至1000 mL，調(diào)節(jié)pH值至2.0，0.22 μm有機(jī)濾膜過濾除菌。

將活化三次的菌液振蕩搖勻，取10 mL菌懸液進(jìn)行5 ℃條件下離心（5000 ×g，10 min，5 ℃），獲得菌泥，用PBS緩沖液沖洗2次，獲得的菌泥重懸于10 mL人工胃液中，37 ℃條件下消化3 h，分別于0 h，3 h取樣測活菌數(shù)。模擬胃液試驗菌株存活率計算方法見公式（4）。

式中：

N3——模擬胃液中作用3 h后取樣計數(shù)測得的活菌數(shù)；

N’ ——0 h取樣測得的活菌數(shù)。

1.2.7 模擬腸液試驗

配制人工腸液：用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液將PBS緩沖液pH調(diào)節(jié)至8.0后滅菌，再加入1.0 g/L的胰蛋白酶使其溶解，0.22 μm有機(jī)濾膜過濾除菌。

將活化三次的菌液震蕩搖勻，取10 mL菌懸液進(jìn)行5 ℃條件下離心（5000×g，10 min，5 ℃），獲得菌泥，用PBS緩沖液沖洗2次，獲得的菌泥重懸于10 mL人工腸液中，37 ℃條件下培養(yǎng)，并于0 h、2 h、4 h取樣測活菌數(shù)。模擬腸液試驗菌株存活率計算方法見公式（5）。

式中：

N4——人工腸液中作用不同時間點取樣計數(shù)測得的活菌數(shù)；

N”——0 h取樣測得的活菌數(shù)。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

每個試驗重復(fù)3次平行測定，數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，當(dāng)p＜0.05時，差異被認(rèn)為是有意義的，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株降膽固醇能力篩選結(jié)果

將從樣品中分離純化后的菌株分別按照降膽固醇功能測定方法測定后，篩選出5株具有降膽固醇能力的菌株，結(jié)果見表1。5株菌均為革蘭氏染色陽性、球狀或桿狀，過氧化氫酶陰性，初步判斷為乳酸菌。通過鄰苯二甲醛比色法測定膽固醇含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株HCS02-001的膽固醇降解率最高，達(dá)到50.6%，其余4株菌的膽固醇降解率在10%～30%之間。近些年關(guān)于降膽固醇的益生菌的研究中，發(fā)現(xiàn)多種不同水平的膽固醇降解能力的菌株，包括嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌和羅伊氏乳桿菌等多個菌種[14-19]。如王今雨等人從傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離出一株膽固醇降解率32.87%的植物乳桿菌[20]，唐雅茹等人從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選出了一株膽固醇降解率55.71%的植物乳桿菌[21]，李堯等人從傳統(tǒng)自然發(fā)酵食品中篩選分離出30株具有降膽固醇功能的乳酸菌菌株，降解率最高為37.15%[22]等，關(guān)于降膽固醇功能菌株的現(xiàn)有研究中，菌株HCS02-001的膽固醇降解能力處于較高水平，具有較高的開發(fā)價值，故選擇菌株HCS02-001進(jìn)行菌種鑒定及益生作用研究。

2.2 降膽固醇功能菌株的鑒定結(jié)果

2.2.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

圖2 菌株HCS02-001的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of strain HCS02-001

圖3 菌株HCS02-001的菌體形態(tài)（16×100）Fig.3 Morphology of strain HCS02-001

將菌株HCS02-001接種至MRS瓊脂培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)48 h后觀察菌株形態(tài)，結(jié)果見圖2。單菌落直徑約1～3 mm，圓形，顏色呈白色，菌落表面光滑，水潤，不凸起。挑取單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色并在生物顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，結(jié)果如圖3所示，革蘭氏染色陽性，短桿狀，長寬比大約為4:1，單個或成對出現(xiàn)。

表1 菌株篩選結(jié)果Table 1 Results of strain screening

2.2.2 生理生化及16S rDNA鑒定結(jié)果

菌株HCS02-001生理生化鑒定結(jié)果見表2。根據(jù)菌種的細(xì)胞形態(tài)、生理生化特征、16S rDNA基因序列等實驗數(shù)據(jù)綜合分析，參考《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》[23]、以及International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology有關(guān)研究論文，并通過在美國生物工程信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）查閱國際相關(guān)的基因庫，將本文的羅伊氏乳桿菌CGMCC No. 19746的16S rDNA序列與GenBank提交菌株序列相似性比較（見表3），鑒定菌種HCS02-001為羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）。16S rRNA基因序列測定結(jié)果見圖4所示。

表2 菌株HCS02-001生理生化實驗結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical test results of strain HCS02-001

圖4 16S rRNA基因序列測定結(jié)果Fig.4 Results of 16S rRNA gene sequencing

表3 菌株HCS02-001的16S rDNA序列同源性分析Table 3 16S rDNA sequence homology analysis of strain HCS02-001

2.3 耐酸性試驗結(jié)果

益生菌經(jīng)口服進(jìn)入人體內(nèi)須經(jīng)過胃才到達(dá)腸道發(fā)揮益生作用，因此必須具有耐受強(qiáng)酸環(huán)境的能力。空腹時人體正常胃液pH為2.0以下，進(jìn)食后pH能達(dá)到3.0左右[24-26]。因此本試驗選定pH 3.5、pH 3.0、pH 2.5、pH 2.0、pH 1.5進(jìn)行檢驗菌株HCS02-001的耐酸性能力。由表4可知，菌株HCS02-001生長狀況良好，活菌數(shù)隨著pH降低雖有所下降，但pH 2.0和pH 1.5時菌株存活率仍可達(dá)到85.52%和58.58%，該菌株具有很好的耐受酸環(huán)境的能力，能夠耐受胃環(huán)境進(jìn)入腸道。

表4 羅伊氏乳桿菌HCS02-001耐酸性試驗結(jié)果Table 4 Acid resistance test results ofLactobacillus reuteri HCS02-001

2.4 耐膽鹽試驗結(jié)果

人體腸道膽鹽濃度通常維持在0.03%～0.30%范圍左右，益生菌的耐膽鹽能力是保證其在腸道存活的先決條件[27,28]。本試驗選用0.30%、0.50%、1.00%、1.50%的膽鹽濃度考察菌株的耐膽鹽能力，結(jié)果見表5。菌株HCS02-001在四個膽鹽濃度條件下培養(yǎng)17 h菌株存活率均在90%以上，說明該菌株具有較強(qiáng)的耐膽鹽能力，能夠在腸道內(nèi)存活發(fā)揮作用。

表5 羅伊氏乳桿菌HCS02-001耐膽鹽試驗結(jié)果Table 5 Bile salt resistance test ofLactobacillus reuteri HCS02-001

2.5 模擬胃液試驗結(jié)果

益生菌進(jìn)入人體內(nèi)經(jīng)過胃環(huán)境時，胃蛋白酶原能在胃液的酸性環(huán)境下被激活而殺死進(jìn)入胃內(nèi)的菌體，因此，益生菌不僅需要具有耐酸的能力，還需要能夠耐受胃蛋白酶的作用才能存活[24]。本試驗將菌株HCS02-001置于人工胃液中作用3 h，結(jié)果見表6，經(jīng)過人工胃液作用后存活率達(dá)到96.74%，說明其具有較強(qiáng)的耐受胃液的能力，可以較高的活性通過胃環(huán)境進(jìn)入腸道。

表6 羅伊氏乳桿菌HCS02-001模擬胃液試驗結(jié)果Table 6 Results of simulated gastric juice test for Lactobacillus reuteri HCS02-001

2.6 模擬腸液試驗結(jié)果

益生菌進(jìn)入腸道后必須具有能夠耐受腸液的能力才能保持較高的存活性發(fā)揮其益生作用，本試驗中羅伊氏乳桿菌HCS02-001菌泥在人工腸液中37 ℃條件下培養(yǎng)4 h后，結(jié)果如表7所示，菌株存活率為98.41%，該菌株對腸液具有很強(qiáng)的耐受能力。

表7 羅伊氏乳桿菌HCS02-001模擬腸液試驗結(jié)果Table 7 Results of simulated intestinal fluid test ofLactobacillus reuteri HCS02-001

3 結(jié)論

本試驗從內(nèi)蒙古呼倫貝爾滿洲里通達(dá)牧場制作的奶豆腐樣品中分離篩選出5株具有膽固醇降解能力的乳酸菌，其中菌株HCS02-001的降解能力最強(qiáng)，降解率達(dá)50.60%，其余4株菌的膽固醇降解率均在10%～30%之間。菌株HCS02-001降膽固醇能力在現(xiàn)有研究中處于較高水平，因此對菌株HCS02-001進(jìn)行鑒定和益生功能的測定。通過對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化鑒定和16S rDNA鑒定確定菌株HCS02-001為羅伊氏乳桿菌。在酸耐受試驗及模擬胃液試驗結(jié)果中可以看出，菌株HCS02-001的耐胃酸環(huán)境能力較強(qiáng)，能夠以較高的存活性通過胃環(huán)境進(jìn)入腸道。膽鹽耐受及模擬腸液試驗表明，菌株HCS02-001具有很強(qiáng)的耐受膽鹽及腸液的能力，能夠在腸道中以較高的活性發(fā)揮作用。羅伊氏乳桿菌HCS02-001膽固醇降解能力較強(qiáng)，且具有良好的耐逆環(huán)境能力，具有較高的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用價值。