乙醇脅迫提高植物乳桿菌p-8的共軛亞油酸(CLA) 轉(zhuǎn)化率和相關(guān)酶轉(zhuǎn)錄水平

秦雅麗，趙國芬*，王丹，張和平，趙微

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010000）（2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010000）（3.山西師范大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，山西臨汾 041004）

共軛亞油酸（Conjugated linoleic acid，CLA）是含有共軛雙鍵的十八碳二烯酸的總稱，是亞油酸的幾何異構(gòu)體，并由亞油酸（Linoleic acid，LA）衍生而來，其中c9,t11-CLA和t10,c12-CLA是最主要的同分異構(gòu)體[1]。CLA具有多種生理功能，例如抗癌，預(yù)防心血管疾病，增強(qiáng)免疫力，抗糖尿病等，對人體健康有積極作用[2,3]，已成為醫(yī)學(xué)、化學(xué)、食品科學(xué)和營養(yǎng)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[4,5]。

天然CLA在很多反芻動物食品中存在，主要是反芻動物腸胃中瘤胃微生物把動物飼料中的亞油酸（Linoleic acid，LA）進(jìn)行異構(gòu)化而來的[6]。因此，反芻動物的肉制食品及其乳制食品是攝入CLA的主要來源[7]。而以乳和肉制品為主的德國居民平均每日的攝入量僅為350 mg[8]，這對于專家建議每日CLA攝入量3500 mg是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，因此向食品中強(qiáng)化CLA含量是一種有效的攝取途徑[9]，而CLA的合成通常使用化學(xué)合成法和生物合成法來制備[10]。

乳酸菌是生物轉(zhuǎn)化生成CLA的最佳微生物。其在LA轉(zhuǎn)化為CLA的過程中涉及脂肪酸水合酶（Fatty acid hydratase，CLA-HY）、羥基脂肪酸脫氫酶（Hydroxy fatty acid dehydrogenase，CLA-DH）、乙酰乙酸脫羧酶（Acetoacetate decarboxylase，CLA-DC）、烯酮還原酶（Enone reductase，CLA-ER）和烯醇化酶（Enolase，Eno），其中CLA-HY與肌球蛋白交叉反應(yīng)抗原（Myosin cross reactive antigen，MCRA）的同源性高，所以前期研究中MCRA就是CLA-HY。楊波[11]發(fā)現(xiàn)多個乳酸菌屬由cla-hy、cla-dh和cla-dc表達(dá)亞油酸異構(gòu)酶的三組分體系，且cla-dh和cla-dc為一個轉(zhuǎn)錄單位，cla-hy為另一個轉(zhuǎn)錄單位，顯然2個轉(zhuǎn)錄單位的調(diào)控機(jī)制是不同的。據(jù)報道，降低氧的濃度，添加膽鹽、有機(jī)溶劑（如吐溫-80）、乳酸鈉和一些輔助因子，增加細(xì)胞膜的通透性和疏水性都可以提高CLA轉(zhuǎn)化率[12,13]，但其調(diào)控的分子機(jī)制尚不明確。

前期研究表明，L. plantarump-8也產(chǎn)CLA，該菌還有提高奶牛的產(chǎn)奶量、肉雞的免疫能力，和緩解成年人壓力、焦慮等功能[14-16]?；贚. plantarump-8在食品、畜牧業(yè)的應(yīng)用以及其產(chǎn)有益生活性CLA的能力[17]，本文以該菌株為材料，擬進(jìn)行不同濃度乙醇脅迫下CLA轉(zhuǎn)化及其合成相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)錄水平差異的研究，為揭示乳酸菌產(chǎn)CLA的分子調(diào)控機(jī)制來提高CLA產(chǎn)量和拓展L. plantarump-8在食品畜牧業(yè)的應(yīng)用空間奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料與試劑

儀器：氣相色譜儀，氣相色譜儀為島津GC-2010；qPCR儀，德國耶拿qTOWER2.2；恒溫?fù)u床，上海?，攲?shí)驗設(shè)備有限公司；單面凈化工作臺（W-CJ-2FD），蘇州凈化公司；超低溫冰箱（707 REVCO），美國Thermo公司；高溫高壓滅菌鍋，日本Hirayama公司；高速冷凍離心機(jī)，德國EPPENDOF公司；分析天平，上海精密儀器儀表有限公司。

菌株：本實(shí)驗中所用L. plantarump-8由本實(shí)驗室保存。

試劑：亞油酸、十七烷酸、DEPC購置于美國Sigma-Aldrich公司；DNA Marker購置于天根生化科技(北京)有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉、甲醇、乙醇、正己烷、冰乙酸、異丙醇、丙三醇、葡萄糖、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、吐溫80、硫酸鎂、硫酸錳購置于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；吐溫20、Tris購置于美國AMRESCO公司；細(xì)菌RNA提取試劑盒購置于瑞士omega公司；一步式反轉(zhuǎn)錄試劑盒購置于TaKara公司。

1.2 方法

1.2.1 LA對L. plantarump-8生長的影響

將亞油酸加入MRS培養(yǎng)基中，至最終濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL，等量無菌蒸餾水作為對照。將植物乳桿菌p-8按照1%的接種量加入，緩慢混勻后37 ℃靜置厭氧培養(yǎng)。檢測6、12、18、24 h的活菌數(shù)量，通過活菌計數(shù)法來確定選取LA濃度。

1.2.2 引物設(shè)計

在NCBI上查閱L. plantarump-8五種CLA合成相關(guān)酶以及16S rRNA的基因序列，利用Primer 5.0設(shè)計了6對特異性引物，交付華大基因公司合成。

6對引物序列分別是：

16S rRNA-F：GATAACACCTGGAAACAGATG C，16S rRNA-R：GACCATCCAAAAGTGATAGCC；

cla-hy-F：CAACGATGGGTGATTACAACA，cla-hy-R：CCCTAAGTTATAGAACCGCTCAG；

cla-dh-F：ACTGAAGCGACCGCCTAT，cla-dh-R：GGTTTCCCGTTGGTAATG；

cla-dc-F：GACAACAGTGCGACAGCC，cla-dc-R：TGGTTCGTCCCATCTTCA；

cla-er-F：GGCAAAGGCTAAGTTCAA，cla-er-R：CATAATGCGACTGGGTGT；

cla-eno-F：GCAAAGGGTATCAAGATG，cla-eno- R：TAAGTCAGCAATGGTCGT。

1.2.3L. plantarump-8培養(yǎng)

挑取L. plantarump-8單菌落在MRS液體中連續(xù)培養(yǎng)兩代后，按1%的接種量（活菌數(shù)為1.43×109CFU/mL）接種至21個50 mL MRS液體培養(yǎng)基中，每個瓶添加濃度為0.05 mg/mL的LA，然后分別以0、0.50%、1%、1.50%、2%、2.50%和3%的添加量添加乙醇，每種濃度3瓶，37 ℃靜置培養(yǎng)至對數(shù)期，無菌操作取出發(fā)酵液5 mL，提取RNA，分析不同乙醇脅迫下cla-hy、cla-dh、cla-dc、cla-er和cla-eno的mRNA水平差異。將剩余菌液繼續(xù)培養(yǎng)3 d后測定脂肪酸，分析不同乙醇脅迫下CLA轉(zhuǎn)化率差異。

1.2.4 CLA的檢測

將經(jīng)LA誘導(dǎo)和乙醇脅迫培養(yǎng)3 d的L. plantarump-85000 r/min離心10 min，分別收集菌體和發(fā)酵上清液。用KPB緩沖液懸浮并清洗菌體，超聲破碎（條件為：功率400 W；間歇4 s，破碎2 s，共30 min），對破碎液和離心之后的發(fā)酵上清液和菌體進(jìn)行脂肪酸抽提，具體的步驟如下：

（1）發(fā)酵液脂肪酸抽提：取4 mL發(fā)酵液于潔凈的試管中，取已添加十七碳烷酸的異丙醇2 mL，充分混勻1 min后加入4 mL的正已烷，再次混勻1 min，5000×g離心10 min。吸取上層的透明正已烷層，轉(zhuǎn)移到干凈試管中，然后用氮?dú)鈱⑵浯蹈伞?/p>

（2）菌體脂肪酸抽提：菌體離心后使用菌體洗滌液進(jìn)行洗滌，向10 mL菌液離心后的菌體加入2 mL的菌體洗滌液，充分混勻1 min，5000 ×g離心10 min。重復(fù)洗滌兩次后將菌體懸于洗滌液中，再按照發(fā)酵液的抽提方法進(jìn)行抽提。

以十七烷酸做內(nèi)標(biāo)，使用鹽酸-甲醇法對抽提后的脂肪酸進(jìn)行甲酯化處理，準(zhǔn)確吸取1 μL甲酯化樣品進(jìn)樣[11]。定量方法為內(nèi)標(biāo)法，進(jìn)行轉(zhuǎn)化率的計算，計算方法如下：

式中：

As——內(nèi)標(biāo)物的峰面積；

Ar——對照品的峰面積；

ms——加入內(nèi)標(biāo)物的量；

mr——加入對照品的量；

Ai——待測物的峰面積。

色譜操作條件：色譜柱為CP-WAX 52CB。載氣流量2 mL/min，分流比15:1分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度為240 ℃。采用程序升溫：120 ℃保溫3 min，然后以每分鐘升5 ℃至190 ℃，再每分鐘升1 ℃至210 ℃，保溫3 min，總時間為56 min。

1.2.5 產(chǎn)CLA相關(guān)酶轉(zhuǎn)錄水平分析

按照omega公司的細(xì)菌RNA提取試劑盒提取培養(yǎng)至對數(shù)期各菌的RNA。用1.20%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測后，用TaKara公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行qPCR，qPCR反應(yīng)體系20 μL，包括SYBR Premix Ex Taq13 μL，引物1（10 μmol/L）和引物2（10 μmol/L）各1 μL，模板cDNA 1 μL，dd H2O 7 μL。95 ℃變性30 s后進(jìn)行30個循環(huán)，每個循環(huán)95 ℃變性5 s、55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min。然后72 ℃再延伸10 min。每個條件重復(fù)三次，記錄每個樣品Ct值。

RT-qPCR數(shù)據(jù)分析：以不添加乙醇的菌為對照，其他添加不同乙醇濃度的菌為實(shí)驗組，各組的16S rRNA為內(nèi)參基因，根據(jù)RT-qPCR所得Ct值，按照2-ΔΔCt法分析對數(shù)期不同乙醇濃度下5個基因相較于不添加乙醇的相對表達(dá)量。

以添加一定濃度乙醇下對數(shù)期的cla-hy基因為例：

式中：

ΔCt0——無乙醇；

ΔCt1——添加一定濃度乙醇。

最后按2-ΔΔCt公式進(jìn)行計算，即得到對數(shù)期的添加一定濃度乙醇的cla-hy基因相比不添加乙醇的cla-hy基因的相對表達(dá)水平。

1.2.6 不同乙醇濃度下CLA相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平和CLA轉(zhuǎn)化率之間的相關(guān)性

分析不同乙醇濃度下，CLA相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平和CLA轉(zhuǎn)化率之間的相關(guān)性。

1.2.7 CLA合成相關(guān)相關(guān)酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹

通過MEGA 7.0繪制不同來源的CLA-HY、CLA-DH、CLA-DC、CLA-ER和Eno的系統(tǒng)發(fā)育樹，來進(jìn)一步分析L. plantarump-8與哪一種乳酸菌的CLA生成的相關(guān)酶系更接近。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗平行三次，采用Excel 2010和SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”（X±SD）表示，各組間的比較采用單因素方差分析，采用LSD法分析差異顯著性，p＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果

2.1.1 LA對L. plantarump-8生長的影響

圖1 不同LA濃度時植物乳桿菌p-8不同生長期的菌落數(shù)Fig.1 Colony number ofLactobacillus plantarum p-8 at different growth stages under different LA concentrations

采用活菌計數(shù)法對培養(yǎng)不同時期的植物乳桿菌p-8進(jìn)行菌落計數(shù)，所得實(shí)驗數(shù)據(jù)結(jié)果如圖1所示。

植物乳桿菌p-8在LA濃度為0 mg/mL～0.04 mg/mL時，隨著LA濃度的升高，活菌數(shù)量波動較小，活菌數(shù)量基本未受到抑制，而LA濃度大于0.05 mg/mL時，活菌數(shù)量收到抑制，因此LA濃度選取為0.05 mg/mL。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品的色譜圖

各標(biāo)樣和待測樣品GC圖譜如圖2所示，檢測到標(biāo)準(zhǔn)樣品c9,t11-CLA、t10,c12-CLA、t9,t11-CLA、LA、十七碳烷酸分別在27 min、28 min、29 min、23 min和20 min左右出峰，待測樣品中CLA的轉(zhuǎn)化率并不高。

圖2 各標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatograms of various standard fatty acids and conversion products

2.1.3 不同乙醇濃度脅迫下L. plantarump-8的CLA轉(zhuǎn)化率差異性

圖3 不同濃度乙醇脅迫下發(fā)酵液中三種CLA的轉(zhuǎn)化率Fig.3 Three CLA conversion rates in fermentation broth with different concentration ethanol stress

7個不同濃度乙醇脅迫下L. plantarump-8發(fā)酵液中不同CLA異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化率結(jié)果如圖3。三種CLA異構(gòu)體轉(zhuǎn)化率都是在添加0.50%乙醇時最高，其中轉(zhuǎn)化t9,t11-CLA異構(gòu)體最高，為2.49%。是不添加乙醇的2.37倍。添加不同濃度乙醇的發(fā)酵液中t10,c12-CLA轉(zhuǎn)化率都是最低的。這與趙微等[18]報道的菌體催化發(fā)酵液中CLA是c9,t11-CLA最高（轉(zhuǎn)化率2%）t9,t11-CLA（轉(zhuǎn)化率0.90%）最低不一致，原因有待于進(jìn)一步研究。

圖4 乙醇脅迫下菌體中三種CLA的轉(zhuǎn)化率Fig.4 Three CLA conversion rates in bacteria under different concentrations ethanol stress

7個添加不同乙醇濃度的菌體中不同CLA異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化率如圖4，總體來看，菌體中產(chǎn)生的CLA非常少，但規(guī)律與發(fā)酵液的基本一致。添加0.50%乙醇菌體中c9,t11-CLA轉(zhuǎn)化率最高，僅為0.05%，但比不添加乙醇的高5倍。當(dāng)乙醇濃度高于0.50%時，隨著乙醇濃度增加，各種不同CLA異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化率逐漸減少。比較同種處理發(fā)酵液和菌體中CLA各異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化率，可以看出由LA轉(zhuǎn)化生成的CLA主要分布在發(fā)酵液中。Kishino等[18]發(fā)現(xiàn)催化LA轉(zhuǎn)化為CLA的亞油酸異構(gòu)酶系的三個酶中CLA-HY在細(xì)胞膜上，CLA-DH和CLA-DC都分布在細(xì)胞液中，說明CLA是在胞液內(nèi)產(chǎn)生后再被運(yùn)轉(zhuǎn)到胞外的。

2.1.4 不同乙醇濃度脅迫下L. plantarump-8的RNA提取結(jié)果

圖5 不同濃度乙醇脅迫下植物乳桿菌p-8 RNA電泳檢測Fig.5 The RNA agarose gel electrophoresis ofL. plantarum p-8 under different ethanol concentrations stress

L. plantarump-8在添加乙醇濃度分別為0、0.50、1.50和3%四個濃度脅迫下培養(yǎng)到對數(shù)期，提取RNA經(jīng)電泳檢測的結(jié)果如圖5，四個樣品均出現(xiàn)清晰的三條帶，符合RT-qPCR的要求。

2.1.5L. plantarump-8在四種乙醇濃度脅迫下CLA合成相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平差異性

乙醇脅迫影響了CLA的轉(zhuǎn)化率，為了探明其原因，根據(jù)四種乙醇濃度脅迫下16S rRNA內(nèi)參基因及cla-hy、cla-dh、cla-dc、cla-er和cla-enoRT-qPCR的擴(kuò)增曲線，分別得到它們的Ct值，結(jié)果如表1。根據(jù)Ct值計算各基因的mRNA相對表達(dá)量并進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)四種乙醇濃度脅迫下，cla-hy、cla-dh、cla-dc、cla-er和cla-eno的mRNA相對表達(dá)情況如圖6，在0.05 mg/mL LA誘導(dǎo)下cla-hy、cla-dh和cla-dc的mRNA相對表達(dá)量分別為2.54、0.89和0.77，乙醇濃度在0.50%時，cla-hy的mRNA相對表達(dá)量最大為2.54。這與楊波[11]報道的植物乳桿菌ZS2058為代表的高產(chǎn)CLA乳酸菌對數(shù)期（10 h）與CLA合成相關(guān)的幾個酶基因表達(dá)都在7以上，相對較高；Lactobacillus plantarumST-III等低產(chǎn)CLA菌株對數(shù)期（10 h）cla-hy表達(dá)量在4以上，而cla-dh和cla-dc相對表達(dá)量不足2，說明亞油酸異構(gòu)酶系的幾個酶基因表達(dá)水平高，CLA生成量就高。乙醇濃度在1.50%和3%時，基因表達(dá)量均下降。LA對細(xì)菌有毒性，是一種毒力因子，通過轉(zhuǎn)變LA為CLA可解除毒性。本文這種CLA低轉(zhuǎn)化率可能與L. plantarump-8細(xì)胞膜的脂肪酸組成有關(guān)，可能飽和脂肪酸偏高，細(xì)胞膜的通透性差，LA不易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，對細(xì)胞毒害相對較低，也就不會大量誘導(dǎo)cla-hy的表達(dá)催化LA轉(zhuǎn)化為CLA來解毒。

圖6 四種乙醇濃度脅迫下相關(guān)酶基因的表達(dá)水平Fig.6 Expression level of related enzyme genes under three ethanol concentration stress

表1 L. plantarump-8在四種乙醇濃度脅迫下CLA合成相關(guān)酶基因及16S rRNA RT-qPCR的Ct值Table 1 Ct value of RT-qPCR for related enzyme gene to CLA synthesis and 16S rRNA inL. plantarump-8 under four ethanol concentration stress

表2 不同乙醇濃度下CLA相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平和CLA轉(zhuǎn)化率之間的相關(guān)性Table 2 The difference between the transcription level of CLA-related genes and the conversion rate of CLA under different ethanol concentrations

在相同濃度乙醇脅迫下cla-dh和cla-dc的mRNA相對表達(dá)量都基本接近，與從genebank上L. plantarump-8的基因組序列中查到的cla-dh和cla-dc為一個轉(zhuǎn)錄單位的信息相吻合。而cla-hy在相同乙醇濃度脅迫下要高出cla-dh和cla-dc的mRNA相對表達(dá)量1.53倍，說明cla-hy首先對乙醇作出反映的，如同首先對LA做出反映一樣。cla-dh和cla-dc必須在有較高濃度的cla-hy催化產(chǎn)物10-羥基十八碳烯脂肪酸作用下才可以被誘導(dǎo)大量表達(dá)。

2.1.6 不同乙醇濃度下CLA相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平和CLA轉(zhuǎn)化率之間的相關(guān)性

將不同乙醇濃度下CLA相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平和CLA轉(zhuǎn)化率之間的相關(guān)性進(jìn)行比較，如表2，在0.50%乙醇濃度下：除了cla-er與CLA轉(zhuǎn)化率不顯著相關(guān)外其余基因都呈顯著相關(guān)；在1.50%乙醇濃度下：只有cla-dh與CLA轉(zhuǎn)化率呈顯著相關(guān)，其余基因均呈不顯著相關(guān)；在3%乙醇濃度下：多有基因與CLA轉(zhuǎn)化率均呈顯著相關(guān)。

2.1.7 亞油酸異構(gòu)酶系相關(guān)酶蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

進(jìn)化樹可反映出各物種的進(jìn)化與親緣關(guān)系。分布在進(jìn)化樹同一分支，親緣關(guān)系較近。利用MEGA軟件構(gòu)建了L. plantarump-8菌株以及其他菌株的五個CLA合成相關(guān)酶的進(jìn)化樹如圖7～11，比較發(fā)現(xiàn)L. plantarump-8與ST-III親緣關(guān)系最接近，所以，L. plantarump-8也應(yīng)為低產(chǎn)CLA菌株，而本文與CLA合成相關(guān)酶的表達(dá)水平CLA轉(zhuǎn)化率也較低，規(guī)律與楊波報道的Lactobacillus plantarumST-III相吻合，其中c9,t11-CLA的轉(zhuǎn)化率為0.34，t10,t12-CLA的轉(zhuǎn)化率為0.92，t9,t11-CLA的轉(zhuǎn)化率為0.35；cla-hy相對表達(dá)量為4.50，cla-dh相對表達(dá)量為1，cla-dc相對表達(dá)量為1.40，cla-er相對表達(dá)量為1.40[11]，也與前期杜美婷報道的結(jié)果一致[19]。

圖7 不同物種CLA-HY的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 Phylogenetic tree of CLA-HY from different species

圖8 不同物種CLA-DH的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.8 Phylogenetic tree of CLA-DH from different species

圖9 不同物種CLA-DC的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.9 Phylogenetic tree of CLA-DC from different species

圖10 不同物種CLA-ER的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.10 Phylogenetic tree of CLA-ER from different species

圖11 不同物種Eno的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.11 Phylogenetic tree of Eno from different species

3 結(jié)論

同一條件下發(fā)酵液中CLA各異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化率遠(yuǎn)比菌體中CLA各異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化率高，說明CLA是在胞液內(nèi)產(chǎn)生后再被運(yùn)轉(zhuǎn)到胞外的。cla-hy的mRNA相對表達(dá)在四種乙醇濃度下都最高的，是其他四個基因的1.50倍之多，乙醇濃度在0.50%時，相對表達(dá)量最大為2.54。低濃度的乙醇脅迫可以提高CLA合成相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平，原因是低濃度的乙醇只增加與細(xì)胞膜的親和力，不使細(xì)胞死亡，容易使得細(xì)胞膜的透性增加，導(dǎo)致LA容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而LAI是誘導(dǎo)酶，進(jìn)入胞內(nèi)的LA濃度高，誘導(dǎo)CLA合成相關(guān)酶基因的表達(dá)增加。CLA合成相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)錄水平是造成CLA轉(zhuǎn)化率差異的主要原因。