正交試驗優(yōu)選當歸藥材中阿魏酸提取工藝

陳良勝

（河南省信陽市新縣人民醫(yī)院，河南 信陽 465550）

當歸為傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，臨床常與川芎、白芍、地黃等配伍，常用于活血化瘀。藥理學研究表明，當歸能模擬小劑量阿司匹林的作用，調節(jié)血脂［1］。其有效成分主要為阿魏酸，屬酚酸，為桂皮酸的衍生物，一般用其反式體。阿魏酸見光易分解，其水溶液穩(wěn)定性較差，形成鈉鹽后穩(wěn)定性較好，易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑，難溶于石油醚［2］。阿魏酸的抗氧化性很強，具有抗菌消炎、抑制肝功能損傷等作用。從植物中提取分離天然阿魏酸的方法有堿水解法、酶解法、組織培養(yǎng)法等。目前仍以堿水解法為主，雖有成本低、產量高等優(yōu)點，但其產生的廢渣、廢液所帶來的環(huán)境問題不容忽視［3］。近年來，超臨界CO2萃取法、連續(xù)回流提取法、高壓法、超聲波等方法多有應用，但操作煩瑣，價格昂貴。閃式提取法在操作方法、能耗、時程、提取效率及應用范圍方面均優(yōu)于傳統方法［4－5］。本研究中基于正交試驗對當歸藥材中阿魏酸的閃式提取法進行了優(yōu)化?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

JHBE－50T型閃式提取器（上海釩幟精密設備有限公司）；LG16－W型離心機（北京離心機有限公司）；755B型紫外－可見分光光度計（四川中浪科技有限公司）；QKCF型超純水器（南京權坤生物科技有限公司）；Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；BT 124 S型電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；FS－750T型超聲儀（上海生析超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

當歸飲片，我院中藥房用當歸藥材（采自海拔超過1000 m的山上，經新縣人民醫(yī)院執(zhí)業(yè)藥師殷雙興鑒定為正品）自制；阿魏酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為20180423，含量為99%）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結果

2.1 阿魏酸含量測定

2.1.1 色譜條件［6］

色譜柱：TSK－GEL DDS－C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇－水－磷酸（30∶70∶0.3，V／V／V）；流速：1.0 mL／min；檢測波長：315 nm；柱溫：40℃；進樣量：10μL。

2.1.2 溶液制備

取阿魏酸對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并稀釋成質量濃度為10μg／mL的對照品溶液。取藥材樣品適量，研磨成細粉，取約0.5 g，精密稱定，置有塞250 mL磨口錐形瓶內，加入90%甲醇和鹽酸（100∶1，V／V）混合溶液10 mL，稱定質量，超聲（功率750 W，頻率20 kHz）處理0.5 h，再次稱定質量，用上述混合溶液補足減失的質量，經0.2μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 方法學考察

系統適用性試驗：精密吸取2.1.2項下對照品溶液、供試品溶液各適量，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置有吸收峰。理論板數按阿魏酸峰計應不低于3000，分離度大于1.5，基線分離良好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.ferulic acid A.Reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密量取對照品溶液1，5，10，15，20，25μL，稀釋2倍，制成系列對照品溶液。按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y＝4573764 X－3878.590，r＝0.9999（n＝6）。結果表明，阿魏酸進樣量在0.0070～0.1500μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取2.1.2項下對照品溶液，按2.1.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，測定峰面積。結果的RSD為0.39%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.1.2項下供試品溶液適量，室溫下分別于0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h時按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD為1.20%（n＝6），表明供試品溶液室溫下放置3.0 h內穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：取藥材樣品粉末適量，精密稱定，共8份，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果的RSD為1.10%（n＝8），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品，共6份，加入一定量的阿魏酸對照品溶液，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n＝6）Tab.1 Results of the recovery tests（n＝6）

2.2 閃式提取法正交試驗［7］

以乙醇體積分數（因素A）、料液比（因素B）和提取時間（因素C）為三因素，以阿魏酸含量為評價指標進行L9（34）正交試驗。詳見表2至表4。由表3和表4可見，因素A、因素C對提取結果有顯著影響，影響強度為A＞C＞B，最佳工藝為A2B2C2，即以12倍量70%乙醇，閃式提取1.5 min。

表2 因素水平表Tab.2 The factor levels

表3 正交試驗設計與結果Tab.3 Design and results of the orthogonal test

表4 方差分析結果Tab.4 Results of ANOVA

2.3 驗證試驗

取當歸藥材粉末100 g，按最優(yōu)工藝進行閃式提取，平行操作3次。結果阿魏酸含量分別為0.2927，0.2930，0.2918 mg／g，平均0.2925 mg／g，與正交設計中的方案6的提取得率接近，RSD為0.21%，表明該工藝穩(wěn)定可行，具有可操作性和重復性。

2.4 乙醇回流提取法［8］

我國藥廠多采用乙醇加熱回流提取法提取當歸藥材中的阿魏酸，現將該法與本研究中優(yōu)選出的閃式提取法的提取效果進行比較。乙醇加熱回流提取工藝中乙醇體積分數及料液比不變，提取次數為3次，提取時間為2.5 h。取3批當歸藥材樣品進行試驗，結果閃式提取法和加熱回流提取法所得阿魏酸含量分別為0.3324 mg／g和0.2773 mg／g?？梢?，在各種因素相同的情況下，閃式法提取時間是傳統乙醇回流提取法的1／100，且前法所得阿魏酸含量較高。既節(jié)省了時間，又降低了能耗。

3 討論

國內對阿魏酸的提取現多采用傳統工藝，具有操作不易、能耗大、費時長、有效成分破壞較多等缺點，導致提取效率低下［9］。本研究中優(yōu)選閃式提取法的最優(yōu)提取參數，通過查閱資料及前期的預試驗，選用乙醇體積分數、料液比和提取時間為三因素，結合L9（34）正交試驗設計對阿魏酸的提取方案進行優(yōu)化，得最優(yōu)工藝為乙醇體積分數為70%，料液比為1∶12，閃式提取1.5 min。與傳統提取方法相比，閃式提取法所需乙醇體積分數較低，操作簡便，提取時間短，提取率高。且該型號電機功率為1800 W，完成1次提取只需1.5 min，與回流提取方法相比，單位能耗明顯降低［10］?？梢?，閃式提取法簡單易操作，可為阿魏酸的開發(fā)及研究提供參考［11－15］。