毛白楊次生維管系統(tǒng)再生過程的基因表達*

唐 芳 趙樹堂 王麗娟 宋學勤 盧孟柱,3

(1.中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所 林木遺傳育種國家重點實驗室 國家林業(yè)和草原局林木培育重點實驗室 北京 100091；2.南京林業(yè)大學 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210037； 3.浙江農林大學林業(yè)與生物技術學院 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室 杭州 311300)

植物在生長發(fā)育過程中會受到各種傷害和脅迫，植物體本身的組織或器官會受到損傷，而再生是它們自我修復的重要手段。植物體損傷后會通過去分化或全能細胞獲得再生能力，再生細胞通過組織重構，從而實現(xiàn)對受損組織或器官修復或替代的過程(Birnbaumetal., 2008)，其細胞學基礎是植物細胞的全能性和多能性。其中，組織修復是植物再生的方式之一，比如樹干表皮受傷后會再生新的樹皮或維管，這主要是通過去分化、再分化或轉分化等方式恢復器官或組織。Stobbe等(2002)對椴樹(Tilia)進行了局部剝皮再生試驗，當從樹皮表面去掉一小塊樹皮后，新的周皮和傷口形成層從木質部表面的愈傷組織中再分化形成，新的韌皮部和木質部由傷口形成層分化而成。Li等(1981)對杜仲(Eucommiaulmoides)樹皮進行大面積環(huán)剝后能再生出新的樹皮，成功建立了杜仲剝皮再生系統(tǒng)。隨后在歐洲樺(Betulapubescens)等樹種上也建立了次生維管再生系統(tǒng)(Cuietal., 1995)。然而環(huán)剝后新形成的篩管和傷口形成層是由分化的木質部細胞而不是愈傷組織分化而來(Pangetal., 2008; Zhangetal., 2011)。

本課題組前期成功建立了毛白楊(Populustomentosa)次生維管再生系統(tǒng)(Duetal., 2006)。愈傷形成層在環(huán)剝后第10天開始發(fā)生，第14天左右形成并在第18天開始分化，而到第22天已經分化出完整的木質部和韌皮部。利用2D-PAGE技術和MALDI-TOF肽指紋圖譜分析方法，鑒定出200多個與維管再生相關的蛋白質。之后又采用自制扣除cDNA文庫，篩選得到了227個在維管再生階段差異表達的基因，主要包括編碼與信號轉導、轉錄因子、細胞壁合成、細胞周期、光合作用及代謝相關的基因(Wangetal., 2009)。但受到技術和分析手段的局限，獲得的蛋白質和差異表達基因的數量有限，特別是低豐度的蛋白及表達量低的基因，這限制了對木材形成調控網絡的全面了解及相應關鍵基因的篩選。Zhang等(2011)對毛白楊剝皮后前12天的不同再生組織進行了楊樹基因芯片表達分析，得到再生初期與分化木質部細胞獲得再生能力、韌皮部細胞和形成層細胞形成和分化相關的基因； 但沒有對整個再生過程進行完整的時序分析，且因來自cDNA芯片的基因數量有限，同樣對未包含在芯片中或表達量低及未定義的基因不能進行全面分析，難以了解調控維管再生過程的相關基因。

本文通過對毛白楊環(huán)剝后的樹皮內側和樹干表面樣本，以及涵蓋整個再生過程(從再生第7天到第21天)不同時期獲取的組織進行高通量轉錄組分析，并利用基因共表達分析(Weighted Gene Co-Expression Network Analysis，WGCNA)方法，得到與不同再生時期密切相關的基因模塊，對這些模塊中的差異表達基因進行系統(tǒng)分析，獲得了維管再生過程不同發(fā)育階段的關鍵基因，并分析了再生過程的遺傳調控途徑，為進一步鑒定與維管發(fā)育和木材形成相關的調控因子奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料為4年生毛白楊無性系，取自河北省唐山市。在毛白楊形成層活動旺盛期(6月中旬)，選擇生長良好、干形均勻的30株植株作為研究對象。根據之前的方法(Tangetal., 2016)，將上述30株植株在同一時間進行莖干環(huán)剝，剝皮區(qū)域距地面約0.5 m，統(tǒng)一向上選取1 m作為環(huán)剝長度。選擇3個植株，分別刮取其樹干表面組織和樹皮內側包括形成層區(qū)域及未成熟木質部在內的組織，作為第0天的樹干表面樣本(D0-Stem)和樹皮內側樣本(D0-Bark)。剝皮后的樹干，均用塑料薄膜包裹好，以保持樹干表面的濕度。隨后于環(huán)剝后第7、10、14、18、21天上午(10:00—11:00)，分別選取5個從未取過樣品的不同植株，切下包含再生組織在內的厚約0.5 cm的木塊，并刮取樹干表面的再生組織，立即冷凍保存于液氮中。通過對每個時期5個不同植株再生組織部位的切片觀察，選擇3株發(fā)育期相似的植株，提取其再生組織的總RNA，進行轉錄組測序。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取 使用總RNA純化試劑盒(#TRK-1001，LC sciences)從樣本中提取總RNA。先將凍存的樣品在液氮中研磨成粉末，然后添加600 μL的提取緩沖液和6% Plant RNA Isolation Aid(#Am9690，Ambion)。經震蕩后，在冰中孵育15 min，室溫下以12 000g離心10 min，可提高總RNA的得率。其余的步驟根據試劑盒說明進行。在Agilent 2100上對總RNA的質量和純度進行分析。

1.2.2 轉錄組測序和基因表達分析 毛白楊再生樣本的cDNA文庫構建和高通量測序由百邁客公司(BMK，北京)完成。測序文庫使用Illumina(美國)的NEBNext UltraTM RNA Library Prep Kit。文庫質量檢驗合格后，用Illumina Novaseq 6000進行測序，測序讀數長度為2*150 bp(PE150)。從Raw data中去除包含adapter、poly-N和低質量的序列，最終獲得clean data。利用Hisat2軟件，將上述得到的clean data與‘717’雜交楊(P.tremula×alba)基因組(http:∥128.192.158.63/index.php/databases/spta-717-genome)進行序列比對，其中允許的錯配核苷酸數量設置為“0”或“1”。之后利用String-Tie進行轉錄組裝和新的轉錄預測，通過Asprofile軟件獲得每個樣本的選擇性剪接類型和相應的表達量?；虮磉_水平的量化是通過每百萬個比對上的片段中所含的千個堿基轉錄本的數量(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped，F(xiàn)PKM)進行估算。使用EBseq軟件分別將第0天的樹皮內側樣本(D0-Bark)、再生第7天(D07)、第10天(D10)、第14天(D14)、第18天(D18)和第21天(D21)的再生樣本與第0天的樹干表面樣本(D0-Stem)進行差異表達分析。將FDR<0.05、表達變化倍數≥2作為差異表達的閾值。通過GOseq R軟件進行差異表達基因(DEGs)的GO富集分析，并利用KOBAS軟件對KEGG途徑中差異表達的基因進行富集統(tǒng)計。轉錄組的原始數據提交至NCBI公共數據庫Sequence Read Archive(SRA，PRJNA698081)。

1.2.3 加權共表達網絡分析 加權共表達網絡分析(Weighted Gene Co-expression Network Analysis，WGCNA)利用動態(tài)剪切的方法，把表達模式相似的基因，劃分到不同的模塊。為了研究毛白楊維管再生過程中發(fā)生的分子機制，利用百邁克云平臺(http:∥www.biocloud.net/)對不同再生時期的差異表達數據進行WGCNA分析，采用動態(tài)混合切割算法將表達一致的基因劃分到相同模塊，通過設定kME閾值來合并表達相似的模塊。本文設定的kME閾值大于0.7。通過分析不同模塊的基因表達模式與再生時期的相關熱圖，找到與再生過程密切相關的模塊，并對模塊中的基因進行GO富集與KEGG通路分析，進一步分析與再生過程相關的關鍵基因和通路。

1.2.4 Heatmap聚類方法 本文的Heatmap表達聚類均采用TBtools軟件進行作圖(Chenetal., 2020)。進入軟件后點擊Graphics→Heatmap Illustrator→Heatmap打開聚類分析程序，輸入要聚類的數據，點擊start，完成作圖。在show Control Dialog設置面板中進行參數設置，先將每個基因在不同再生時期的表達值按照log2(FPKM +1)進行對數轉換，再做同一基因的Normalized歸一化處理，之后選擇基因間的表達聚類。設置顏色標尺的范圍在-2.0到2.0之間。

1.2.5 實時熒光定量PCR分析 取2.0 μg起始量的總RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit(#RR037A，TaKaRa)，利用oligo d(T)反轉錄引物，進行反轉第1鏈cDNA的合成。得到的反轉錄cDNA稀釋20倍后進行后續(xù)的定量PCR。定量PCR反應體系為： 10 μL KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(#K4601，KAPA)、2 μL上述稀釋20倍的cDNA、定量上下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL和6.4 μL去離子水，每個樣本進行4個技術重復。在LightCycler?480定量PCR儀(Roche)上進行定量PCR的運行，PCR擴增程序為： 95 ℃ 3 s； 95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 3 s重復45個循環(huán)。定量引物序列見表1，其中PP2A-2為內參基因。

表1 實時定量PCR的引物序列Tab.1 The sequence of primers for real-time quantitative PCR

2 結果與分析

2.1 次生維管系統(tǒng)的再生過程

對維管再生不同時期的再生組織部位進行切片觀察，顯微結構顯示與之前的研究(Duetal., 2006; Wangetal., 2009; Tangetal., 2016)具有類似的變化特征。簡而言之，韌皮部、形成層區(qū)域和相當比例的未成熟木質部隨樹皮一起被剝落，剝皮后的樹干表面殘留幾層未成熟木質部和成熟木質部細胞。到第7天，剝皮后的樹干外側形成大量的愈傷組織，并出現(xiàn)了不連續(xù)的類分生組織細胞。第10天時，愈傷組織與未成熟木質部間有連續(xù)、扁平的分生組織細胞呈不規(guī)則排列。再生第14天，扁平的分生組織細胞層數增加，形成連續(xù)而規(guī)則的細胞層，類似于維管形成層。再生的形成層在第18天形成并開始分化，第21天開始出現(xiàn)新分化的木質部細胞和韌皮部細胞(圖1)。至此，整個維管再生過程完成，并形成了一個能夠正常分化的次生維管系統(tǒng)(Secondary Vascular System，SVS)。

圖1 毛白楊次生維管再生過程的組織切片F(xiàn)ig.1 Cross sections of a portion of trunks during secondary vascular system(SVS) regeneration in Populus tomentosaA： 被剝下的樹皮組織，可見韌皮部、形成層區(qū)域和大部分的未成熟木質部； B： 剝皮后的樹干組織，由外及里可見數層未成熟木質部和成熟木質部； C-G： 剝皮后第7、10、14、18、21天樹干表面的再生組織。A: The phloem, cambium and most of the immature xylem could be seen in the peeled bark tissue; B: The surface of the girdled trunk remained a few layers of immature xylem and mature xylem from outside to inside; C-G: The regenerated tissue on the surface of the trunk on the day 7th, 10th, 14th, 18th and 21st after girdling.

2.2 不同再生時期材料的基因表達分析

對毛白楊維管再生5個不同時期的再生樣本和第0天獲得的樹干表面樣本、樹皮內側樣本進行轉錄組高通量測序，共獲得14組轉錄組分析數據，其中每個樣本轉錄組數據的clean data均可達到6.25 Gb，Q30堿基百分比在90.27%及以上。各樣本與‘717’楊基因組進行序列比對，比對率從80.63%到83.80%不等?；诒葘Y果，發(fā)掘出882個未定義的基因，其中有517個得到功能注釋。采用FPKM的方法對各樣本中Mapped Reads數目和轉錄本長度進行表達均一化。將第7、10、14、18和21天的再生樣本分別與第0天的樹干表面樣本進行比對，得到的差異表達基因數量分別為10 276、11 923、11 822、10 686和12 913。對這些差異基因進行韋恩分析(圖2)，可以看出，這些差異表達基因之間有近2/3的基因(6 299個)是相同的，不同再生時期樣本之間也有數量不等的差異表達基因，而第7天和第21天再生樣本與樹干相比特有的差異基因數量最多，分別為1 383個和1 133個，說明再生第7天和第21天可能是再生維管發(fā)育的關鍵時期。對這些基因分別進行GO enrichment分析，第7天特有差異基因的生物學功能集中在核小體組裝、DNA復制、有絲分裂和微管運動等； 而第21天特有差異基因主要參與葡聚糖生物合成、信號轉導、跨膜運輸和碳水化合物代謝等生物學過程。

圖2 不同再生時期樣本與樹干樣本相比差異基因的韋恩圖Fig.2 Venn diagram of differentially expressed genes between regenerated samples and trunk samplesD07、D10、D14、D18和D21分別代表剝皮后第7、10、14、18和21天的再生樣本。D07, D10, D14, D18 and D21 represent the regeneration samples on the day 7th, 10th, 14th, 18th and 21st after girdling, respectively.

2.3 利用WGCNA分析維管再生過程的基因表達模塊

將樹皮內側樣本與樹干表面樣本(D0-Stem Vs.D0-Bark)、再生第7天樣本與樹干表面樣本(D0-Stem Vs.D07)、相鄰再生時期(D07 Vs.D10、D10 Vs.D14、D14 Vs.D18、D18 Vs.D21)的樣本進行比較，對得到的差異基因進行合并。把獲得的14 202個差異基因作為候選基因進行WGCNA分析，根據各樣本基因表達的聚類，與再生時間點進行關聯(lián)，最終獲得與維管再生過程相關的10個共表達模塊(表2)。

表2 各個共表達模塊的基因數量Tab.2 The number of genes in each module

圖3 不同模塊與樣本間的相關性Fig.3 Correlation between different modules and samplesD0-Bark和D0-Stem分別代表剝皮當天(第0天)的樹皮內側和樹干表面的樣本； D07、D10、D14、D18和D21分別代表剝皮后第7、10、14、18和21天的再生樣本。下同。每個方格中的數值代表每個模塊與各再生時期樣本之間的相關性數值，括號里的數值是對應的P值。D0-Bark and D0-Stem represent the inner bark and trunk surface samples after girdling(Day 0), respectively, and D07, D10, D14, D18 and D21 represent the regeneration samples on the day 7th, 10th, 14th, 18th and 21st after girdling, respectively.The same below.The value in each square represents the correlation between each module and regeneration samples, and the value in brackets is the corresponding P-value.

圖4 不同模塊基因的共表達聚類分析Fig.4 Cluster analysis of gene co-expression patterns in different modules

圖5 各個模塊基因的Go enrichment和KEGG通路分析Fig.5 Go enrichment and KEGG pathway analysis of genes in each module

根據模塊與樣本間的相關性結果(圖3)，對模塊里的基因進行表達聚類分析(圖4)和Go enrichment、KEGG通路分析(圖5)。Grey60模塊的基因在D07和D0-Bark中特異表達，它們主要涉及DNA復制、有絲分裂、細胞分裂和微管運動等生物學功能。而Midnightblue模塊的基因在D07、D10和D14中表達較高，主要參與氧化還原過程、脂類轉運、幾丁質分解過程、黃酮類化合物生物合成等生物學過程。此外，Green模塊的基因在D07中高表達，主要參與了氧化應激反應、細胞氧化解毒、過氧化氫代謝、氧化還原及對傷害反應等生物學過程。綜上可知，再生第7天是維管再生的關鍵時期，在這個時期特異表達的基因主要與DNA復制、有絲分裂、細胞分裂以及應激反應等生物學過程相關，說明在再生早期脫分化的木質部細胞發(fā)生了細胞增殖和組織類型的改變，與愈傷組織的大量形成相一致。

Pink模塊的基因在再生過程的表達量均高于第0天樣本，并且隨著時間表達量逐漸增高，到第21天達到最高值，這些基因主要參與的生物學途徑與細胞壁修飾、氨基酸跨膜轉運、果膠分解代謝、DNA的轉錄調控、韌皮部發(fā)育等相關。Brown模塊的基因在整個再生過程中都保持較高的表達水平，它們主要參與了與光合作用相關的生物學過程、次生代謝產物合成及黃酮類化合物的生物合成等。而在再生第10天(Lightgreen模塊)、第14天(Darkgreen模塊)和第18天(Darkred模塊)，特異表達的基因數量并不多，主要參與光合電子運輸、氧化還原過程、細胞增殖，有機磷酸酯、鹽和水等的轉運及一些代謝途徑相關的生物學過程。此外，Red模塊中的基因主要在D0-Bark中高表達，主要參與包括生長素運輸、鈣的信號轉導、木質部和韌皮部形態(tài)建成、細胞骨架組成等的生物學過程。而Blue模塊的基因在D0-Stem中特異表達，主要富集到植物次生細胞壁形成、木質素合成及細胞壁生物形成等生物學途徑。說明到再生后期形成層細胞雖然還沒有分化出與成熟木質部和韌皮部具有相似生物學功能的組織，但已經完成了結構重構并行使轉運等功能，新形成韌皮部和木質部所需的信號轉導、轉錄調控及細胞壁成分合成等基因開始大量表達。

2.4 調控分生組織再生的表達模塊分析

根據不同模塊基因的表達聚類和生物學過程分析結果，選擇Grey60模塊進行基因共表達網絡分析。對kME值靠前的150個基因構建了共表達網絡圖，篩選出6個主要的HUB基因，包括AUR3、TOP2-2、IQD1-2、NET3C、UBC20和MYB3R4，涉及到細胞周期、復制和重組、細胞骨架、信號轉導等生物學方面(圖6)。除此之外，Grey60模塊還含有大量與表觀遺傳相關的基因，比如參與DNA甲基化的DNA甲基轉移酶(MET1)和染色質甲基化酶(CMT3)、組蛋白甲基化酶ATXR1、ATXR6、ASHR3和WDR5A(Fengetal., 2011)以及組蛋白脫甲基酶JMJ25和JMJ30和染色質重塑因子CHR1的同源基因(丁健等， 2015)，都在再生第7天特異地高表達(圖7A)。說明表觀遺傳調控可能參與了SVS早期再生的啟動。在SVS再生過程的轉錄組數據中，幾乎所有差異表達的周期蛋白基因CYCAs、CYCBs和CYCDs的同源基因都來自Grey60模塊，在再生第7天高表達(圖7B)。周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin dependent kinase，CDK)能和周期蛋白cyclin協(xié)同作用，也是細胞周期調控中的重要因子(賀窯青等， 2010)。Grey60模塊有4個CDK基因在再生第7天高表達。綜上說明，未成熟木質部可能在再生早期通過激活細胞周期相關調控基因的表達，啟動細胞周期來促進DNA復制、核小體組裝以及細胞的分化和增殖等過程，完成新的分生組織重塑，啟動SVS的再分化過程。

圖6 Grey60模塊的基因共表達網絡Fig.6 The gene co-expression network of Grey60 module

圖7 Grey60模塊中表觀遺傳調控和細胞周期相關基因的表達模式Fig.7 The expression patterns of genes related to epigenetic regulation and cell cycle in Grey60 moduleA： 表觀遺傳調控； B： 細胞周期蛋白。A: Epigenetic regulation; B: Cyclin.

2.5 調控韌皮部分化的表達模塊分析

Pink模塊中kME值靠前的150個基因主要集中在細胞分裂、韌皮部發(fā)育、碳水化合物代謝、信號轉導、次生代謝等生物學功能，并根據相關性篩選出7個可能的HUB基因，包括SAMDC、CLE44、PP2A1、ASIL2、MYR2、OTU和Potri.013G032900(圖8)。在SVS再生過程中，與韌皮部分化相關的APL、NAC45/86和DOF等標記基因的表達被重新激活，從再生第10天開始表達量逐漸增加。此外，BREVISRADIX(BRX)、BARELYANYMERISTEM3(BAM3)和CLE45能通過直接或間接的作用，調控原生韌皮部細胞從增殖到分化的過渡(Depuydtetal., 2013)，它們也與APL具有相似的表達趨勢。而其他韌皮部的標記基因，比如：BARKSTORAGEPROTEINA(BSPA)、PHLOEMPROTEIN2-LIKE(PP2)和SUCROSESYNTHASE(SUS)等基因的表達在再生過程中呈上升趨勢(圖9)。說明從SVS再生第10天開始由木質部細胞脫分化形成的韌皮部組織逐漸趨于成熟。CLE41和CLE44產生于韌皮部細胞，能促進維管形成層細胞的增殖并抑制其分化為木質部細胞(Fukudaetal., 2007)，而CLE41和CLE44的同源基因從再生第10天開始表達量增高，說明CLE41和CLE44可能是伴隨著韌皮部的形成而產生表達。此外，CLAVATA1(CLV1)能參與調節(jié)頂端分生區(qū)干細胞增殖和分化間的平衡(Guoetal., 2010)。CLV1的同源基因也從再生第10天開始表現(xiàn)出較高的表達量，說明它可能參與調控形成層細胞的增殖和分化。綜上可以推測，再生形成層的增殖和分化伴隨韌皮部的形成而產生。Pink模塊中除了調控形成層和韌皮部發(fā)育相關的基因，還有大量與碳水化合物代謝、信號轉導以及激素信號相關的基因，它們在調節(jié)植物組織或器官再生中也起到了非常重要的作用。因此，Pink模塊是調控SVS再生過程的重要模塊。

圖8 Pink模塊的基因共表達網絡Fig.8 The gene co-expression network of Pink module

圖9 Pink模塊中與韌皮部和形成層發(fā)育相關基因的表達模式Fig.9 The expression patterns of genes related to phloem and cambium development in Pink module

2.6 再生形成層分化木質部的調控

為研究再生過程中木質部細胞的特性變化，對木質部標記基因及次生壁生物合成的相關MYB和MAC轉錄因子進行了表達聚類分析(圖10)。其中，與次生壁合成相關的纖維素合酶CesA4、CesA7和CesA8的5個同源基因，主要在D0-Stem中高表達，再生早期的表達量減少，到再生后期表達略有升高。此外，正調控次生壁合成的MYB和MAC轉錄因子如MYB46、MYB83、MYB26、NST1和SND2也是在D0-Stem中特異表達，再生后期的表達量較早期有所增高。相反，次生壁合成相關負調控因子MYB4、MYB7、XND1和VNI2在D0-Stem和D0-Bark中表達量極低或沒有表達，但在SVS再生過程維持較高表達量。綜上可知，木質部標記基因以及次生壁正向調控因子主要在成熟的木質部細胞中特異地高表達，而到SVS再生后期這些基因的表達才有所增高，說明再生木質部形成于再生后期； 而負調控因子在再生早期和中期高表達，也表明木質部的分化在再生早期受到了抑制。

圖10 毛白楊次生維管再生過程中木質部標記基因和次生壁合成相關基因的表達模式Fig.10 The expression patterns of xylem marker genes and secondary cell wall synthesis related genes during SVS regeneration in Populus tomentosa

2.7 次生維管系統(tǒng)再生過程相關調控基因的實時定量PCR驗證

為驗證SVS再生過程轉錄組數據的重復性和可靠性，對Grey60和Pink模塊的主要HUB基因以及2個模塊重要的基因和調控因子進行了實時定量PCR檢測。Grey60模塊的基因在轉錄組測序和定量PCR檢測中都在D0-Bark和D07高表達，但D18定量PCR檢測的結果略高于轉錄組數據。Pink模塊的基因在D0-Bark和D0-Stem中的表達量極低甚至沒有表達，但在整個再生過程的表達呈上升趨勢； 部分基因D14定量PCR檢測的結果略高于轉錄組數據(圖11)。從整體結果可以看出，轉錄組測序和定量PCR檢測的表達趨勢結果基本保持一致，說明本文涉及的轉錄組數據穩(wěn)定可靠。

圖11 Grey60和Pink模塊HUB基因和關鍵調控基因的定量PCR驗證Fig.11 Validation of HUB genes and key regulatory genes in Grey60 and Pink modules by qRT-PCR柱狀代表定量PCR的檢測結果，坐標軸位于左側； 折線代表轉錄組測序結果，坐標軸位于右側； 橫坐標為次生維管系統(tǒng)再生過程中各時期的樣本。The column represents the results of qRT-PCR, with the coordinate axis on the left; the line represents the results of RNA sequencing, with the coordinate axis on the right; the abscissa is the samples during SVS regeneration.

3 討論

植物體在受到傷害后會釋放誘導信號，體細胞感受到信號會重新編程并啟動新的發(fā)育程序，通過細胞脫分化、增殖獲得新的細胞類型，來修復受損組織或從傷口部位發(fā)育出新的器官(Ikeuchietal., 2019)。楊樹樹皮環(huán)剝后的維管系統(tǒng)再生，就是通過樹干殘留的木質部細胞進行脫分化、轉分化后重建新的維管組織結構(Zhangetal., 2011)。本文利用毛白楊次生維管再生系統(tǒng)，分析了木質部細胞脫分化、轉分化為韌皮部和形成層，新的形成層細胞再分化過程的基因表達模式，并利用WGCNA分析了與再生不同時期密切相關的模塊。其中，Grey60模塊的基因在D0-Bark和D07中都具有較高的表達量，而D0-Bark的組織包括韌皮部、形成層區(qū)域和部分未成熟木質部，推測次生維管系統(tǒng)(SVS)到再生第7天分生組織的活性得到恢復。在D0-Bark和D07樣本中高表達的基因參與了表觀遺傳調控、細胞周期、有絲分裂、細胞分裂及應激反應等生物學過程也支持這一推論。而Pink模塊的基因在第0天成熟維管組織的樣本中表達量極低甚至沒有表達，但在再生過程中表達呈上升趨勢，說明Pink模塊中的基因可能是分生組織再生所必需的，這些基因主要涉及韌皮部發(fā)育、細胞壁修飾、DNA的轉錄調控和跨膜轉運等，暗示在木質部細胞獲得分化能力后，韌皮部的再生和分化被激活，而再生形成層的增殖和分化伴隨韌皮部的形成而產生。此外，木質部標記基因以及次生壁合成的正調控因子在SVS再生早期的表達量極低，再生后期表達略有升高； 而負調控因子在整個再生過程特別是再生早期的表達量高于第0天，說明木質部的形成在再生早期受到抑制，到再生后期脫分化的形成層才開始進行分化。

本文從Grey60模塊篩選出的6個關鍵HUB基因與細胞周期、DNA復制、有絲分裂、微管運動等生物學功能相關。其中，Aurora3(AUR3)是Aurora蛋白激酶家族的成員之一，可以通過不同底物的磷酸化來監(jiān)測染色體分離，對有絲分裂的正常進行發(fā)揮至關重要的作用(Demidovetal., 2014)。TOP2-2是DNA拓撲異構酶，它能夠催化DNA鏈的斷裂和結合，從而調控DNA的拓撲狀態(tài)，在基因復制、轉錄、重組、修復和染色體重塑過程中參與DNA超螺旋結構模板的調節(jié)(秦尚堯等， 2016)。UBC20作為泛素結合酶，是細胞內蛋白質選擇性降解途徑中的關鍵酶，對靶蛋白的泛素化起重要作用，在植物DNA修復、光周期、維管分化和脅迫響應等方面起到重要作用(王金利等， 2010)。而NETWORKED (NET3C)是植物特有的微絲結合蛋白，它能與微管結合蛋白(IQD)和微管馬達蛋白(KLCR)形成復合體，與微絲-微管互作，并與內質網-質膜-細胞壁連續(xù)體結合，形成了一個橫跨細胞內外的細胞骨架調控中樞，對細胞骨架與內質網結構的維持、細胞形態(tài)的建立都起到了至關重要的作用(Zangetal., 2021)。這些HUB基因的功能表明，再生初期組織在發(fā)育程序上有一個重大轉折，從而分化出新的韌皮部細胞和新的分生組織，是再生維管組織的起始基礎。Pink模塊中篩選出的HUB基因與形成層和韌皮部的發(fā)育、信號轉導等方面相關。S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(SAMDC)與植物體多胺生物合成相關，影響木質部細胞的分化。它的底物SAM也是乙烯的合成前體，乙烯與植物的成熟衰老進程也密切相關(張佳景等, 2008)。而CLE44和CLE41能促進維管形成層細胞的增殖并抑制其分化為木質部細胞。韌皮部蛋白2(PP2A)編碼韌皮部凝集素，在高等植物的形態(tài)維持、光同化物運輸和傷口保護中起著重要作用(Dinantetal., 2003; Leeetal., 2014)。Trihelix transcription factorASIL2可以通過上游microRNA的作用抑制胚胎發(fā)育早期的成熟化進程(Willmannetal., 2011)。因此，該模塊HUB基因調控了形成層再生及其分化木質部、韌皮部細胞等過程。

此外，植物激素在SVS重建中也起到重要的調控作用。生長素極性運輸會形成明顯的生長素梯度(Rolland-Laganetal., 2005)，而與生長素極性運輸相關的PAT基因主要來自Red模塊，即基因主要在D0-Bark中高表達，在SVS再生早、中期的表達量降低，但到再生后期表達又升高。PAT基因在SVS再生過程的表達變化有助于生長素梯度的重新定位，這可以為再生韌皮部和形成層的結構分化提供定位信號。其他激素，比如細胞分裂素是形成層發(fā)育的重要調控因子，其信號轉導機制在植物初生生長中發(fā)揮重要作用，它可以通過促進維管形成層細胞的增殖來促進植物的次生生長(韓惠賓等, 2015)； 而赤霉素(GA)能促進細胞分裂和伸長、下胚軸和莖稈伸長等(高秀華等, 2018)； 油菜素內酯能夠促進細胞伸長和分裂，并促進維管的分化(鄭潔等, 2014)。這些植物激素信號轉導通路上的重要受體和調控因子主要集中在Brown和Pink模塊，在SVS再生過程中都保持較高的表達量，說明它們可能對韌皮部和形成層的再形成和分化起到重要的調控作用。

4 結論

利用毛白楊次生維管再生系統(tǒng)，分析了木質部細胞的脫分化、轉分化為韌皮部和形成層，以及新的形成層細胞再分化維管組織的基因表達模式。在再生早期，脫分化的木質部細胞通過表觀遺傳和細胞周期調控重新獲得了細胞分生能力； 之后，韌皮部的細胞分化程序被啟動，再生形成層開始細胞增殖和分化； 到再生后期，通過相關基因調控，形成層再分化新的木質部和韌皮部。通過對次生維管組織再生過程中基因的表達分析和調控模塊的鑒定，不但進一步驗證了次生維管再生的遺傳調控基礎，也為研究形成層活動和木質部分化提供了大量候選基因，從而為揭示木材形成的分子機制提供了基礎。