入侵性致癭害蟲桉樹枝癭姬小蜂(膜翅目：姬小蜂科)EST-SSR開發(fā)及隱種鑒定*

彭 欣 王瀚棠 郭春暉 楊振德,2 周 靜 王 雪 丁芷柔

(1.廣西大學(xué)林學(xué)院 南寧 530001； 2.廣西森林生態(tài)與保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南寧 530001)

生物入侵是21世紀(jì)最棘手的三大環(huán)境問(wèn)題(生物入侵、全球變化和生境喪失)之一。隨著經(jīng)濟(jì)全球化、國(guó)際旅游業(yè)和現(xiàn)代交通的飛速發(fā)展，入侵生物在各國(guó)之間傳播擴(kuò)散，新疫情不斷突發(fā)，已入侵種頻繁暴發(fā)成災(zāi)，給世界各國(guó)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和生態(tài)災(zāi)難，也給人民健康和社會(huì)穩(wěn)定帶來(lái)了巨大影響，做好生物入侵的跨國(guó)研究與科學(xué)防范十分重要，迫在眉睫。為了更好闡明生物入侵的生態(tài)學(xué)過(guò)程和分子機(jī)制，我國(guó)于2018年11月啟動(dòng)了IAS1000計(jì)劃(1 000種入侵物種基因組計(jì)劃)(錢萬(wàn)強(qiáng)等， 2018)。

桉樹(Eucalyptus)是世界三大速生豐產(chǎn)樹種之一，已有5大洲96個(gè)國(guó)家和地區(qū)種植桉樹，我國(guó)桉樹種植面積居世界第3位。但是，隨著桉樹廣泛種植，其害蟲的種類和數(shù)量迅速增加。Hurley等(2016)研究表明，桉樹人工林害蟲入侵率自20世紀(jì)80年代中期以來(lái)增長(zhǎng)近5倍。桉樹枝癭姬小蜂(Leptocybeinvasa)屬膜翅目(Hymenoptera)小蜂總科(Chalcidoidea)姬小蜂科(Eulophidae)，是30多種桉屬植物的外來(lái)入侵害蟲，主要危害桉樹嫩枝，使新葉的葉脈、葉柄和嫩枝產(chǎn)生典型的腫塊狀蟲癭，嚴(yán)重侵染甚至可導(dǎo)致植株枯死。該蜂于2000年在中東和地中海地區(qū)首次被發(fā)現(xiàn)， 2014年擴(kuò)散到5大洲29個(gè)國(guó)家， 2018年劇增至45個(gè)國(guó)家(Mendeletal.， 2004； Zhengetal.， 2014； Leetal.， 2018)。我國(guó)于2007年在與越南交界的東興市首次發(fā)現(xiàn)桉樹枝癭姬小蜂(吳耀軍等， 2009)，現(xiàn)已蔓延至廣西、海南、廣東、福建、四川、江西、云南、臺(tái)灣8省(區(qū))(Zhengetal.， 2014； 2018a； 張華峰等， 2013)，其中長(zhǎng)江以南的福建、廣東、廣西、海南等地為其最佳適生區(qū)(黃夢(mèng)伊等， 2020)。桉樹枝癭姬小蜂入侵?jǐn)U散的規(guī)模和速度前所未有，已成為全球桉樹的一種重要入侵性林業(yè)害蟲。

Mendel等(2004)在采樣過(guò)程中始終未發(fā)現(xiàn)桉樹枝癭姬小蜂雄蟲樣本，世界各地也罕有桉樹枝癭姬小蜂雄蟲出現(xiàn)，所以一般認(rèn)為桉樹枝癭姬小蜂的主要生殖方式是產(chǎn)雌孤雌生殖； 但近幾年在土耳其、印度和中國(guó)相繼有桉樹枝癭姬小蜂雄蟲的報(bào)道(Doanlar， 2005； Guptaetal.， 2009； 陳華燕等， 2009)。Zheng等(2018b)研究發(fā)現(xiàn)，溫度、光周期和冷熱適應(yīng)對(duì)桉樹枝癭姬小蜂后代性別比例和生殖策略均無(wú)顯著影響。楊纖纖(2017)研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)桉樹枝癭姬小蜂雌雄蟲間存在交配行為，可通過(guò)兩性生殖方式產(chǎn)生后代。極具優(yōu)勢(shì)的產(chǎn)雌孤雌生殖方式使得桉樹枝癭姬小蜂能在入侵地快速擴(kuò)張種群，從而保障其在新環(huán)境中成功入侵定殖。此外，桉樹枝癭姬小蜂是一種卵熟型寄生蜂，雌性蜂在羽化時(shí)卵巢中的卵幾乎全部發(fā)育成熟，卵產(chǎn)出后迅速孵化出幼蟲(Zhengetal.， 2018a)。Mendel等(2004)研究得出，桉樹枝癭姬小蜂在溫室中從卵發(fā)育到成蟲的整個(gè)過(guò)程平均需要132.6天。桉樹枝癭姬小蜂一般在國(guó)外1年發(fā)生2～3代，國(guó)內(nèi)1年發(fā)生4～6代，世代重疊(寇冀蒙， 2020)。我國(guó)不同地理環(huán)境下桉樹枝癭姬小蜂每年發(fā)生的代數(shù)存在差異，廣西、廣東每年可發(fā)生4～5代(羅基同等， 2011； 朱方麗等， 2013)， 贛南和福建每年可發(fā)生3～4代(張華峰， 2013； 曾凡玉等， 2015)。桉樹枝癭姬小蜂的這些生物學(xué)習(xí)性是其在我國(guó)迅速入侵?jǐn)U散的重要原因。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat， SSR)又稱微衛(wèi)星(microsatellite)，是一類由1～6個(gè)核苷酸組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，其在所有高等生物的編碼區(qū)和非編碼區(qū)均可發(fā)生(Tautzetal., 1984； Guptaetal.，1996)。SSR因符合孟德爾遺傳模式，具有共顯性、數(shù)量豐富、多態(tài)性高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)易等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于遺傳圖譜繪制、遺傳多樣性分析、動(dòng)植物分類與變異水平分析等研究領(lǐng)域(Madesisetal.， 2013)。基于表達(dá)序列標(biāo)簽開發(fā)的SSR又稱EST-SSR，由于其來(lái)源于基因表達(dá)區(qū)，因此EST-SSR既有基因組SSR(G-SSR)標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，又有直接標(biāo)記功能基因反映相關(guān)基因多樣性的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)相較于G-SSR，EST-SSR具有更高的保守性和在近緣種間的通用性，可節(jié)約開發(fā)成本(孫陶澤等， 2019； Scottetal.， 2000； Bérubéetal.， 2007)。細(xì)胞色素C氧化酶亞基I基因(cytochrome C oxidase subunit I, COI)來(lái)源于線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)，mtDNA具有母系遺傳、相對(duì)保守、無(wú)內(nèi)含子、進(jìn)化速率較快(昆蟲中線粒體基因的進(jìn)化速度大概是核蛋白編碼基因的2～9倍)、較少發(fā)生序列缺失和插入等特點(diǎn)(Linetal.， 2004)，已被廣泛用于昆蟲種類鑒定以及隱種發(fā)現(xiàn)等領(lǐng)域(劉慎思等， 2012)。

隱種是昆蟲系統(tǒng)分類和種群遺傳研究共同關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題，隱種鑒定不僅對(duì)于入侵生物學(xué)的理論研究具有重要意義，而且對(duì)入侵種的防控也具有重要指導(dǎo)價(jià)值，有助于生物防治中采用正確的生物型，一些地區(qū)害蟲生物防治方法失效可能是該害蟲中存在隱種所致(Maponderaetal.， 2012； Schr?deretal.， 2020； Dittrich-Schr?deretal.， 2020)。如全球入侵性害蟲煙粉虱(Bemisiatabaci)在我國(guó)有19個(gè)隱種，包含17個(gè)本地種和2個(gè)外來(lái)種(MED和MEAM1)(Huetal.， 2018)。因此，開展害蟲防治前應(yīng)對(duì)不同隱種進(jìn)行鑒定區(qū)分。線粒體COI 標(biāo)記表明，桉樹枝癭姬小蜂具有3種不同的線粒體單倍群，即隱種A、B、C，其中隱種A 主要分布于歐洲、中東、南美和非洲大部分地區(qū)，隱種B與隱種A共同分布于老撾、南非、泰國(guó)和越南等地，而隱種C 僅在澳大利亞本土范圍出現(xiàn)(Dittrich-Schr?deretal.， 2018)。雖然桉樹枝癭姬小蜂入侵我國(guó)已有14年歷史，文獻(xiàn)報(bào)道江西贛州的桉樹枝癭姬小蜂屬于隱種B(Dittrich-Schr?deretal.， 2018； Nugnesetal.， 2015)，但關(guān)于中國(guó)種群的桉樹枝癭姬小蜂是否存在其他類型隱種尚不清楚。

鑒于此，本研究基于桉樹枝癭姬小蜂3個(gè)地理種群轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)篩選EST-SSR位點(diǎn)，以8個(gè)地理種群的桉樹枝癭姬小蜂雌性成蟲樣本用于EST-SSR的開發(fā)，并對(duì)14個(gè)地理種群的桉樹枝癭姬小蜂進(jìn)行隱種鑒定，以期為桉樹枝癭姬小蜂種群遺傳學(xué)研究開發(fā)可靠的EST-SSR標(biāo)記，為該害蟲在生物防治中采用正確的生物型提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

桉樹枝癭姬小蜂樣本采集時(shí)間為2016―2020年，14個(gè)地理種群樣本采樣信息見表1。樣本采集后立即放入無(wú)水乙醇中固定，于-80 ℃冰箱中保存。由于采集到的桉樹枝癭姬小蜂雄性成蟲樣本有限，且使用單倍體雄蟲開發(fā)SSR引物無(wú)法體現(xiàn)共顯性分子標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)(區(qū)分二倍體雜合子)，不能很好展現(xiàn)SSR引物的多態(tài)性，故本研究?jī)H選用桉樹枝癭姬小蜂雌性成蟲進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)分析。

選取8個(gè)樣本量充足的地理種群，每個(gè)地理種群有3個(gè)桉樹枝癭姬小蜂雌性成蟲樣本DNA用于后續(xù)EST-SSR的開發(fā)，對(duì)采集到的全部14個(gè)地理種群320個(gè)桉樹枝癭姬小蜂雌性成蟲樣本進(jìn)行隱種鑒定。用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的桉樹枝癭姬小蜂雌性成蟲樣本分別采自廣西梧州、廣西南寧1、四川攀枝花，分為3組，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)樣本量0.5 g。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序委托北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行，測(cè)序平臺(tái)為Illumina HiSeqTM2000。

1.2 DNA提取

采用動(dòng)物組織DNA提取試劑盒(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)，參照說(shuō)明書提取單頭桉樹枝癭姬小蜂雌性成蟲總基因組DNA，使用NanoDrop以260 nm/280 nm和260 nm/230 nm比值測(cè)定DNA的質(zhì)量和濃度，檢測(cè)合格的DNA分裝3管，于-20 ℃冰箱中保存。

表1 桉樹枝癭姬小蜂14個(gè)地理種群采樣信息Tab.1 Sampling information of 14 geographic populations of L. invasa

1.3 SSR位點(diǎn)鑒定

利用軟件MISA(https:∥webblast.ipk-gatersleben.de/misa/)搜索unigenes的微衛(wèi)星標(biāo)記，按照以下標(biāo)準(zhǔn)從unigenes中查找 EST-SSR位點(diǎn)： 單核苷酸重復(fù)≥10次，二核苷酸重復(fù)≥6次，三核苷酸重復(fù)≥5次，四核苷酸重復(fù)≥5次，五核苷酸重復(fù)≥5次，六核苷酸重復(fù)≥5次。如果2個(gè)SSR序列的距離短于100 bp，會(huì)被合并當(dāng)作一個(gè)EST-SSR標(biāo)記。

1.4 EST-SSR引物設(shè)計(jì)與篩選

以上述篩選的EST-SSR位點(diǎn)為基礎(chǔ)，利用Primer Premier 3(Untergasseretal.， 2012)軟件在EST-SSR序列兩側(cè)進(jìn)行引物批量設(shè)計(jì)，引物長(zhǎng)度設(shè)為18～26 bp，最適長(zhǎng)度為23 bp，擴(kuò)增目的片段為重復(fù)序列前1個(gè)到后5個(gè)堿基片段，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在100～400 bp之間。從中選取400個(gè)EST-SSR位點(diǎn)進(jìn)行初篩，所需引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。從廣西防城港2、四川攀枝花、廣西南寧1種群中各取1個(gè)樣本DNA用于初篩，每對(duì)引物用上述3個(gè)樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并應(yīng)用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，篩選出條帶單一、清晰可見，與目的片段大小一致的引物。PCR反應(yīng)體系為25.0 μL，包含2×T5 Super PCR Mix 12.5 μL(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)，正反向引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，加9.5 μL ddH2O補(bǔ)足體系； PCR反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性10 s，適宜溫度退火10 s，72 ℃延伸10 s，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸2 min。為了盡可能表現(xiàn)出位點(diǎn)的多態(tài)性，從廣西防城港2、廣西南寧1、廣西南寧2、廣西梧州、四川德陽(yáng)、四川攀枝花、福建三明、江西贛州8個(gè)種群中各選取3個(gè)樣本(共24個(gè)樣本)DNA對(duì)有效擴(kuò)增的引物進(jìn)行二次篩選，并用8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)多態(tài)性。PCR反應(yīng)體系與程序同上。

1.5 桉樹枝癭姬小蜂G-SSR多態(tài)性引物驗(yàn)證

結(jié)合Dittrich-Schr?der等(2018)開發(fā)的14對(duì)多態(tài)性G-SSR引物(LiSS1—LiSS14)，對(duì)我國(guó)8個(gè)地理種群24個(gè)樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系和程序同上，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)。

1.6 隱種鑒定

利用線粒體COI基因序列引物L(fēng)iLCO1490(5′-ATTTGATCTGGAATTTTAGG-3′)HCO2198(5′-TAAA CTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)(Folmeretal.， 1994； Dittrich-Schr?deretal.， 2018)對(duì)14個(gè)地理種群320個(gè)桉樹枝癭姬小蜂雌性成蟲樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為50.0 μL，包含2×T5 Super PCR Mix 25.0 μL(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)，正反向引物各2.0 μL，DNA模板2.0 μL，加19.0 μL ddH2O補(bǔ)足體系； PCR反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性40 s，49 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠、純化后送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行雙端測(cè)序。

以Dittrich-Schr?der等(2018)鑒定出的桉樹枝癭姬小蜂隱種A、B、C的COI基因序列(GenBank登錄號(hào)分別為MH093212、MH093120和MH093002)為參考，利用PhyloSuite v1.1.15軟件(Zhangetal.， 2020)對(duì)14個(gè)地理種群320個(gè)桉樹枝癭姬小蜂樣本COI基因序列進(jìn)行MAFFT比對(duì)并用Gblocks程序提取保守序列； 比對(duì)完成的序列利用MEGAX v7.0軟件(Kumaretal.， 2016)以Kimura 2-parameter模型建立 Neighbor-Joining(NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 桉樹枝癭姬小蜂轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序與組裝

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)濾后獲得277 048 525條clean reads，包含82.86 G個(gè)核苷酸，Q20為97.45%，Q30為93.62%，GC含量為43.30%，表明測(cè)序結(jié)果良好，可信度高。組裝后共得到44 878個(gè)unigene，平均長(zhǎng)度為1 082.76 bp，N50為1 976 bp。隨著序列長(zhǎng)度增加，unigene數(shù)量逐漸減少(表2)。

2.2 桉樹枝癭姬小蜂轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)分布特點(diǎn)

對(duì)桉樹枝癭姬小蜂轉(zhuǎn)錄組的44 878條unigenes序列(總長(zhǎng)約 48 592 kb)進(jìn)行搜索，檢測(cè)到14 190個(gè)EST-SSR位點(diǎn)，平均每3.42 kb出現(xiàn)1個(gè)SSR位點(diǎn)。不同重復(fù)類型的EST-SSR在總EST-SSR中所占比例情況(表3)為： 單苷酸重復(fù)所占比例最高(9 881個(gè)，69.63%)，其次為二核苷酸重復(fù)(2 295個(gè)，16.17%)和三核苷酸重復(fù)(1 917個(gè)，13.51%)，四、五、六核苷酸重復(fù)共97個(gè)，占0.69%。轉(zhuǎn)錄組EST-SSR重復(fù)次數(shù)在4～24次之間，單核苷酸重復(fù)次數(shù)在10～24次之間，二核苷酸重復(fù)次數(shù)在6～12次之間，三核苷酸重復(fù)次數(shù)在5～8次之間，四核苷酸重復(fù)次數(shù)在5～10次之間，五核苷酸重復(fù)次數(shù)在5～11次之間，六核苷酸重復(fù)次數(shù)在5～8次之間。在單核苷酸重復(fù)類型(表4)中，A/T類型具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，占98.03%； 在二核苷酸重復(fù)類型中，GA/TC最多，其次為AG/CT，分別占26.27%和23.14%； 在三核苷酸重復(fù)類型中，TGC/GCA類型最多，占13.67%，其次為CAG/CTG(12.52%)、AGC/GCT(10.02%)。

表2 桉樹枝癭姬小蜂轉(zhuǎn)錄組組裝質(zhì)量Tab.2 Transcriptome assembly quality of L. invasa

表3 桉樹枝癭姬小蜂不同類型EST-SSRs重復(fù)次數(shù)統(tǒng)計(jì)Tab.3 Repeated number statistics of EST-SSRs of different types in L. invasa

2.3 EST-SSR位點(diǎn)篩選及G-SSR引物多態(tài)性

從EST-SSR庫(kù)中選取400個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，包含二核苷酸重復(fù)160個(gè)、三核苷酸重復(fù)220個(gè)、四核苷酸重復(fù)20個(gè)，經(jīng)初篩共得到205對(duì)條帶單一、清晰可見，與目的片段大小一致的引物，擴(kuò)增效率為51.25%。利用8個(gè)地理種群24個(gè)樣本進(jìn)行二次篩選共得到10個(gè)多態(tài)性良好的EST-SSR位點(diǎn)，位點(diǎn)詳情及引物序列見表5，c127471引物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖見圖1。國(guó)外14對(duì)G-SSR引物均能有效擴(kuò)增得到目的片段，其中僅有LiSS2、LiSS5、LiSS13存在多態(tài)性，這3對(duì)多態(tài)性G-SSR引物用于后續(xù)種群遺傳學(xué)研究。

表4 桉樹枝癭姬小蜂EST-SSRs重復(fù)基元類型統(tǒng)計(jì)Tab.4 Statistics on repeat motifs type of EST-SSRs in L. invasa

表5 桉樹枝癭姬小蜂10對(duì)多態(tài)性EST-SSRs與國(guó)外3對(duì)多態(tài)性G-SSRs引物信息①Tab.5 Information of 10 polymorphic EST-SSRs and 3 polymorphic G-SSRs primers of L. invasa

圖1 桉樹枝癭姬小蜂c127471引物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.1 Denatured polyacrylamide gel electrophoresis image of L. invasa c127471 primerM： DNA分子量標(biāo)記DNA molecular weight marker； GXNN1： 廣西南寧1 Nanning 1, Guangxi； JXGZ： 江西贛州 Ganzhou, Jiangxi； FJSM： 福建三明 Sanming, Fujian； SCPZH： 四川攀枝花 Panzhihua, Sichuan； SCDY： 四川德陽(yáng) Deyang, Sichuan； GXWZ： 廣西梧州 Wuzhou, Guangxi； GXNN2： 廣西南寧2 Nanning 2, Guangxi； GXFCG2： 廣西防城港2 Fangchenggang 2, Guangxi.

2.4 中國(guó)種群桉樹枝癭姬小蜂隱種鑒定

經(jīng)序列比對(duì),最終得到320條605 bp的COI基因序列(GeneBank登錄號(hào)為MZ378835—MZ379154)； 聚類結(jié)果顯示，隱種A有104個(gè)樣本，隱種B有216個(gè)樣本，暫未發(fā)現(xiàn)隱種C樣本(圖2)。江西贛州、廣西防城港1、廣西防城港2、廣西南寧1、廣西南寧2、四川攀枝花、廣西梧州種群同時(shí)存在隱種A、B，四川德陽(yáng)、福建三明、海南儋州、云南昆明、廣西來(lái)賓、廣西玉林、廣西欽州種群僅存在隱種B； 不同種群隱種A、B所占比例存在明顯差異，江西贛州、廣西防城港1、廣西梧州種群以隱種A樣本為主，其他種群以隱種B樣本為主(表6)。

2.5 全球桉樹枝癭姬小蜂隱種統(tǒng)計(jì)

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載全球5大洲18個(gè)國(guó)家共511條桉樹枝癭姬小蜂COI基因序列數(shù)據(jù)，對(duì)全球各國(guó)家和大洲進(jìn)行隱種統(tǒng)計(jì)(表7)，可以看出老撾、泰國(guó)、越南和南非均存在不同程度的隱種A、B混合現(xiàn)象，澳大利亞存在隱種B、C，美洲和歐洲僅存在隱種A。

圖2 基于桉樹枝癭姬小蜂COI基因序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 NJ phylogenetic tree constructed based on L. invasa COI gene sequence樣本序號(hào)后面的大寫字母A、B代表各樣本所屬的隱種類型； 樣本MH093212、MH093120和MH093002分別為隱種A、B、C的參考序列。The capital letters A, B after the samples No.represent the cryptic species type of each samples; Samples MH093212, MH093120 and MH093002 are the reference sequences of cryptic species A, B and C, respectively.

表6 桉樹枝癭姬小蜂隱種鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)Tab.6 Statistical of L. invasa cryptic species identification result

3 討論

隨著經(jīng)濟(jì)全球化、國(guó)際旅游業(yè)和現(xiàn)代交通飛速發(fā)展，外來(lái)物種入侵日益嚴(yán)重。生物入侵不僅會(huì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性造成嚴(yán)重破壞，而且會(huì)對(duì)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境的穩(wěn)定產(chǎn)生負(fù)面影響。SSR是種群遺傳學(xué)研究中常用的分子標(biāo)記之一，但是SSR用于非模式生物必須先進(jìn)行多態(tài)性引物開發(fā)， 尤其是傳統(tǒng)G-SSR發(fā)掘方法在微小的昆蟲中應(yīng)用較為困難(魏丹丹等， 2014)，這極大限制了對(duì)非模式昆蟲的研究。隨著二代測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)EST-SSR克服了微衛(wèi)星位點(diǎn)獲取困難、成本高等弊端，從而促進(jìn)了對(duì)非模式昆蟲微衛(wèi)星的研究進(jìn)展。

桉樹枝癭姬小蜂轉(zhuǎn)錄組44 878個(gè)unigenes中共發(fā)掘出14 190個(gè)EST-SSR位點(diǎn)，EST-SSR出現(xiàn)頻率為31.62%(EST-SSR個(gè)數(shù)與unigenes個(gè)數(shù)之比)，這與梨網(wǎng)蝽(Stephanitisnashi)(40.37%)(謝瑾燕等， 2019)、中華蜜蜂(Apisceranacerana)(30.87%)(熊翠玲等， 2017)等的EST-SSR出現(xiàn)頻率相當(dāng)； 但與橘小實(shí)蠅(Bactroceradorsalis)(4.23%)(魏丹丹等， 2014)、齒緣刺獵蝽(Sclominaerinacea)(5.67%)(黎東海等， 2019)、東方黏蟲(Mythimnaseparata)(11.51%)(李微等， 2017)、窄足真蚋[Simulium(Eusimulium)angustipes](68.33%)(郭歡等， 2018)等昆蟲差異較大。造成這種差異的主要原因可能是物種不同，也可能與EST-SSR篩選標(biāo)準(zhǔn)以及RNA質(zhì)量有一定關(guān)系。

SSR長(zhǎng)度是影響其多態(tài)性的重要因素，當(dāng)SSR長(zhǎng)度≥20 bp時(shí)多態(tài)性較高，SSR長(zhǎng)度在12～20 bp之間時(shí)多態(tài)性中等，而SSR長(zhǎng)度在12 bp以下時(shí)多態(tài)性較低(Temnykhetal.， 2001)。轉(zhuǎn)錄組是生物體某個(gè)細(xì)胞或組織在特定時(shí)間內(nèi)的表達(dá)情況，EST-SSR核心序列重復(fù)次數(shù)往往不高，同時(shí)具有較高的保守性，因此EST-SSR多態(tài)性通常比G-SSR低(魏丹丹等， 2014； 郭歡等， 2018)。桉樹枝癭姬小蜂的EST-SSR長(zhǎng)度集中在10～15 bp之間，占76.76%，僅有4.49%的EST-SSR長(zhǎng)度≥20 bp，且多為單核苷酸重復(fù)類型，因此桉樹枝癭姬小蜂可能具有較低的遺傳多態(tài)性。

表7 全球桉樹枝癭姬小蜂隱種比例統(tǒng)計(jì)Tab.7 Statistics on the proportion of cryptic species of L. invasa in the world

為了得到質(zhì)量較高且多態(tài)性良好的引物，引物篩選時(shí)本研究?jī)?yōu)先選擇核心重復(fù)序列較長(zhǎng)的EST-SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，共選取400對(duì)EST-SSR引物進(jìn)行開發(fā)； 其中一半引物擴(kuò)增失敗，分析其原因可能是引物序列中的內(nèi)含子阻止了引物退火，或者在引物側(cè)翼區(qū)域存在一個(gè)較大的內(nèi)含子干擾PCR擴(kuò)增(Sahaetal.， 2004)； 有205對(duì)擴(kuò)增得到預(yù)期大小條帶，占合成引物的51.25%，引物擴(kuò)增效率低于意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica)(91.67%)(郭睿等， 2018)、星天牛(Anoplophorachinensis)(88.33%)(韓小紅等， 2019)、沙蔥螢葉甲(Galerucadaurica)(100%)(張鵬飛等， 2016)，但高于齒緣刺獵蝽(29.63%)(黎東海等， 2019)、意大利蝗(Calliptamusitalicus)(25.00%)(桑迪等， 2020)。

SSR多態(tài)性并非完全取決于SSR引物自身的多態(tài)性，與物種自身遺傳多樣性高低也有著密切聯(lián)系。Dittrich-Schr?der等(2018)利用14對(duì)桉樹枝癭姬小蜂G-SSR引物(LiSS1—LiSS14)研究發(fā)現(xiàn)，澳大利亞原始種的遺傳多樣性顯著高于其他入侵地區(qū)，且僅有部分G-SSR引物在入侵地區(qū)桉樹枝癭姬小蜂樣品中存在多態(tài)性。國(guó)外14對(duì)G-SSR引物中僅有3對(duì)引物在我國(guó)桉樹枝癭姬小蜂樣本具有多態(tài)性，說(shuō)明國(guó)外G-SSR引物僅有少數(shù)可用于我國(guó)桉樹枝癭姬小蜂種群遺傳學(xué)研究，因此在進(jìn)行種群遺傳學(xué)研究前，需要開發(fā)更多的多態(tài)性SSR引物進(jìn)行聯(lián)合分析才能得出準(zhǔn)確的結(jié)論。

據(jù)報(bào)道，我國(guó)江西贛州的桉樹枝癭姬小蜂均屬于隱種B(Nugnesetal.， 2015)，但筆者于2016年采樣時(shí)發(fā)現(xiàn)江西贛州種群中93.75%的桉樹枝癭姬小蜂為隱種A。出現(xiàn)這種情況一方面是由于以往研究采集的樣本量較少，有漏采隱種A的可能；另一方面可能是因?yàn)椴蓸狱c(diǎn)不同造成的。本研究廣西防城港2個(gè)采樣點(diǎn)相隔僅40 km，但是其隱種比例卻完全相反，廣西防城港1種群桉樹枝癭姬小蜂樣本的93.75%為隱種A，而廣西防城港2種群桉樹枝癭姬小蜂樣本的96.88%為隱種B，這說(shuō)明我國(guó)桉樹枝癭姬小蜂的隱種分布可能并非自然傳播形成，而是人為活動(dòng)的結(jié)果，且不同隱種的桉樹枝癭姬小蜂可能存在完全不同的入侵?jǐn)U散路線，從而使得不同種群桉樹枝癭姬小蜂的隱種比例分布不均?？傮w來(lái)說(shuō)，我國(guó)桉樹枝癭姬小蜂隱種B在數(shù)量上更占優(yōu)勢(shì)，隱種B可能比隱種A更先入侵我國(guó)。由于我國(guó)桉樹枝癭姬小蜂隱種類型與東南亞各國(guó)相近，故推測(cè)我國(guó)桉樹枝癭姬小蜂可能起源于東南亞。

隨著桉樹枝癭姬小蜂在世界范圍入侵?jǐn)U散程度加劇，其隱種混合將成為未來(lái)的大趨勢(shì)。部分亞洲和非洲國(guó)家桉樹枝癭姬小蜂隱種大量混合，勢(shì)必使得當(dāng)?shù)胤N群成為桉樹枝癭姬小蜂在世界范圍傳播擴(kuò)散的橋頭堡種群，隱種混合可能導(dǎo)致滲透雜交而產(chǎn)生更適應(yīng)環(huán)境的新基因型(Dittrich-Schr?deretal.， 2018)。我國(guó)大面積單一品種的桉樹種植區(qū)為桉樹枝癭姬小蜂快速適應(yīng)新環(huán)境提供了良好條件，江西贛州、四川攀枝花、廣西梧州、廣西防城港1、廣西南寧1等種群均出現(xiàn)隱種混合現(xiàn)象，這些地理種群將有可能成為桉樹枝癭姬小蜂在我國(guó)持續(xù)傳播擴(kuò)散的橋頭堡種群，隨著各地隱種混合加劇，桉樹枝癭姬小蜂的入侵性有可能進(jìn)一步增強(qiáng)。

4 結(jié)論

本研究篩選出10對(duì)適合我國(guó)桉樹枝癭姬小蜂種群遺傳學(xué)研究的EST-SSR引物。我國(guó)存在A、B 2種類型的桉樹枝癭姬小蜂隱種，其中隱種A首次在我國(guó)發(fā)現(xiàn)，桉樹枝癭姬小蜂隱種鑒定可為該害蟲在生物防治中采用正確的生物型提供依據(jù)。