白僵蠶不同濃度乙醇提取物的體外抗氧化作用研究＊

周心晨，但彩云，崔詩遙，李文樂，劉 雪，李聰慧，時(shí)連根

（浙江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058）

白僵蠶（Bombyx batryticatus）是蠶蛾科家蠶（Bombyx mori）幼蟲感染白僵菌（Beauveria bassiana（Bals.）Vuill）后致死的干燥菌蟲復(fù)合體，也稱僵蟲、天蟲、姜蟲等，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是我國(guó)一味傳統(tǒng)的珍貴中藥材［1～3］，其用藥標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)藥典》2020年版一部［4～15］。白僵蠶有息風(fēng)止痙、祛風(fēng)止痛、化痰散結(jié)等功效，臨床用于治療肝風(fēng)夾痰、驚癇抽搐、小兒急驚風(fēng)、破傷風(fēng)、中風(fēng)口、風(fēng)熱頭痛、目赤咽痛、風(fēng)疹瘙癢、發(fā)頤痄腮等疾病?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，白僵蠶富含黃酮類、白僵菌素、多糖類等多種活性成分，具有抗驚厥、抗凝血、抑菌、抗腫瘤、降糖降脂、抗氧化等作用。白僵蠶的抗氧化作用是當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一，國(guó)內(nèi)外學(xué)者報(bào)道了白僵蠶抗氧化成分提取的多種技術(shù)工藝［16，17］，但對(duì)提取溶劑濃度影響提取物的抗氧化缺乏研究，這阻礙了白僵蠶抗氧化功能的開發(fā)利用。本文用不同濃度乙醇對(duì)白僵蠶進(jìn)行回流提取，通過抗DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基、抗羥基（·OH）自由基和總還原力試驗(yàn)，比較白僵蠶不同濃度乙醇提取物的體外抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 供試白僵蠶粉及主要試劑和儀器

取5齡起蠶，均勻噴灑濃度為1.0×105分生孢子/mL的家蠶病原白僵菌分生孢子液，于25℃、90%濕度條件下飼養(yǎng)48 h后，于常規(guī)條件下飼養(yǎng)，4 d～5 d后蠶陸續(xù)發(fā)病僵死，收集僵死蠶于25℃、90%濕度條件下培養(yǎng)，直至蠶體覆滿白色的白僵菌分生孢子，收集白僵蠶并于35℃烘箱中烘干，中藥粉碎機(jī)粉碎后過100目篩，制成白僵蠶粉，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；METTLER TOLEDO AB104-N天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；恒溫恒濕培養(yǎng)箱（Safe公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療器械五廠）；YQ-1002C型超聲波清洗儀（上海易凈超聲波儀器有限公司）；Free zone 6 plus冷凍干燥器（Labconco公司）；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；UV2450紫外分光光度儀（日本島津公司）。

無水乙醇、抗壞血酸（VC）、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、七水合硫酸亞鐵、雙氧水（H2O2）、水楊酸等化學(xué)試劑均為分析純，購自中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 白僵蠶不同濃度乙醇提取物的制備

采用超聲波輔助乙醇回流提取法。稱取三份等質(zhì)量白僵蠶粉末，按1∶10的料液比（質(zhì)量體積比，g/mL），分別緩慢加入體積分?jǐn)?shù)為65%、80%和95%的乙醇，混勻后，在常溫下用超聲波清洗儀超聲（功率60%、頻率53 kHz）處理30 min，然后于60℃水浴鍋中回流提取2 h；收集提取液，抽濾，濾液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，得到白僵蠶不同濃度乙醇提取濃縮液；將濃縮液入冷凍管并封口，置于-80℃冰箱過夜保存；取出冷凍管，快速置于冷凍干燥機(jī)中于-50℃下真空干燥，得到白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物。

1.3 DPPH自由基清除試驗(yàn)

參考胡碧君報(bào)道的方法［18］。取白僵蠶不同濃度乙醇提取物，分別用雙蒸餾水溶解并配制系列濃度樣品液；取樣品液2 mL，加入等體積的0.04 mg/mL DPPH溶液（用提取時(shí)相對(duì)應(yīng)濃度乙醇配制）（Ai），并設(shè)加入等體積的提取時(shí)相對(duì)應(yīng)濃度乙醇液替換DPPH溶液（Aj），混勻后在室溫下遮光反應(yīng)30 min；取上清液在波長(zhǎng)517 nm下測(cè)定吸光度，試驗(yàn)重復(fù)三次，設(shè)置抗壞血酸為陽性對(duì)照組，雙蒸餾水替換樣品液為空白對(duì)照組（A0）。按下列公式計(jì)算DPPH清除率（SE）：

式中：SE為清除率；Ai為2 mL DPPH+2 mL樣品液的吸光值；Aj為2 mL相對(duì)應(yīng)濃度乙醇+2 mL樣品液的吸光值；A0為2 mL DPPH溶液+2 mL雙蒸餾水的吸光值。

1.4 羥基自由基清除試驗(yàn)

參考胡碧君報(bào)道的方法［18］。取白僵蠶不同濃度乙醇提取物，分別用雙蒸餾水溶解并配制系列濃度樣品液；取樣品液1 mL，依次加入6 mmol/L FeSO4溶液1 mL、6 mmol/L H2O2溶液1 mL，混勻后靜置10 min；加入6 mmol/L水楊酸溶液（顯色劑）1 mL（Ai），并設(shè)加入1 mL雙蒸餾水替換水楊酸溶液（Aj），混勻后37℃水浴鍋中反應(yīng)30 min；取上清液在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)定吸光度，試驗(yàn)重復(fù)三次，設(shè)置抗壞血酸為陽性對(duì)照組，雙蒸餾水替換樣品液為空白對(duì)照組（A0）。按下列公式計(jì)算清除率（SE）：

式中：SE為羥基自由基清除率；Ai為樣品液+FeSO4+H2O2+水楊酸的吸光值；Aj為樣品液+Fe?SO4+H2O2+雙蒸餾水的吸光值；A0為雙蒸餾水+Fe?SO4+H2O2+水楊酸的吸光值。

1.5 還原能力測(cè)定

參考范金波等報(bào)道的方法［19］。取白僵蠶不同濃度乙醇提取物，分別用雙蒸餾水溶解并配制系列濃度樣品液；依次向離心管中加入0.75 mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）、樣品液0.75 mL、1%鐵氰化鉀溶液0.75 mL，混勻后于50℃水浴鍋中反應(yīng)20 min；取出離心管，加入10%三氯乙酸溶液0.75 mL，混勻后于室溫下3000 rpm離心10 min；取上清液1.5 mL入試管中，再加入雙蒸餾水1.5 mL和0.1% FeCl3溶液0.1 mL，在波長(zhǎng)700 nm下測(cè)定吸光度，吸光度越高代表樣品還原能力越強(qiáng)，試驗(yàn)重復(fù)三次。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel和SPSSAU v21.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，處理間差異采用LSD（Least Significant Dif?ference）法比較，P＜0.05表示差異達(dá)顯著水平，P＜0.01表示差異達(dá)極顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 白僵蠶不同濃度乙醇提取物對(duì)DPPH自由基清除活性的比較

測(cè)定白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除率，結(jié)果如圖1所示。圖1顯示，白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物在濃度0～0.2 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率均是隨著濃度提高而逐漸增大，并且均表現(xiàn)出較好的正相關(guān)關(guān)系；在低濃度時(shí)，白僵蠶65%、80%、95%乙醇提物對(duì)DPPH自由基的清除率顯著低于VC，但隨著濃度的升高，VC對(duì)DPPH自由基的清除率趨于穩(wěn)定，使白僵蠶65%、80%、95%乙醇提物與VC的清除率差距逐漸縮小。通過SPSSAU v21.0計(jì)算得到，白僵蠶65%乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除率-濃度曲線公式為y=277.994x+48.757，其半抑制濃度IC50為4.471 μg/mL；白僵蠶80%乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除率-濃度曲線公式為y=279.326x+48.906，其半抑制濃度IC50為3.916 μg/mL；白僵蠶95%乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除率-濃度曲線公式為y=157.757x+46.419，其半抑制濃度 IC50為 22.7 μg/mL。結(jié)果表明，白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物對(duì)DPPH自由基均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除作用，其清除活性為白僵蠶80%乙醇提取物＞白僵蠶65%乙醇提取物＞白僵蠶95%乙醇提取物。

圖1 白僵蠶不同濃度乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除活性Fig 1 Scavenging Effect of Extracts from Bombyx Batryticatus by different Concentrations Ethanol to Dpph Radicals

2.2 白僵蠶不同濃度乙醇提取物對(duì)羥基自由基的清除活性比較

檢測(cè)白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物對(duì)羥基自由基（·OH）的清除作用，結(jié)果如圖2所示。圖2顯示，白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物濃度在0～0.2 mg/mL范圍內(nèi)，其對(duì)羥基自由基的清除率均隨濃度增大而升高，濃度與清除率間均表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系；在低濃度時(shí)，白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物對(duì)羥基自由基的清除率與抗壞血酸對(duì)照組的差距均較大，但隨著濃度的增大，其間的差距逐漸縮小。通過SPSSAU v21.0計(jì)算得到，白僵蠶65%乙醇提取物的清除率-濃度曲線公式為y=16.251x+80.475，白僵蠶80%乙醇提取物的清除率-濃度曲線公式為y=13.864x+70.829，白僵蠶95%乙醇提取物的清除率-濃度曲線公式為y=53.197x+40.021，抗壞血酸的清除率-濃度曲線公式為y=14.296x+88.934。以抗壞血酸0.1 mg/mL時(shí)的清除率90.48%為參考量，根據(jù)以上公式計(jì)算可得：1 g白僵蠶65%乙醇提取物清除羥基自由基的能力相當(dāng)于162.43 mg抗壞血酸，1 g白僵蠶80%乙醇提取物清除羥基自由基的能力相當(dāng)于70.55 mg抗壞血酸，1 g白僵蠶95%乙醇提取物清除羥基自由基的能力相當(dāng)于105.43 mg抗壞血酸。結(jié)果表明，白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物對(duì)羥基自由基均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除作用，其中白僵蠶65%乙醇提取物的清除活性最強(qiáng)，白僵蠶95%乙醇提取物清除活性次之，白僵蠶80%乙醇提取物的清除活性最弱。

圖2 白僵蠶不同濃度乙醇提取物對(duì)羥基自由基的清除活性Fig 2 Scavenging Effect of Extracts from Bombyx Batryticatus by different Concentrations Ethanol to Hydroxyl Radicals

2.3 白僵蠶不同濃度乙醇提取物的還原能力比較

檢測(cè)白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物的總還原力，結(jié)果白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物濃度在0～0.6 mg/mL范圍時(shí)，其吸光值均隨濃度增大而穩(wěn)步上升，并且濃度與吸光值間均表現(xiàn)出顯著的正相關(guān)系（相關(guān)系數(shù)R2均大于0.995）。通過SPSSAU v21.0計(jì)算得到，白僵蠶65%乙醇提取物的OD值-濃度曲線公式為y=0.491x，白僵蠶80%乙醇提取物的OD值-濃度曲線公式為y=0.496x-0.002，白僵蠶95%乙醇提取物的OD值-濃度曲線公式為y=0.231x+0.001，抗壞血酸對(duì)照組的線性回歸公式為：y=6.638x+0.111（R2=0.973）。以抗壞血酸的吸光值1.0為參考量，根據(jù)以上公式計(jì)算可得：1 g白僵蠶65%乙醇提取物的總還原力（OD值）相當(dāng)于65.76 mg抗壞血酸，1 g白僵蠶80%乙醇提取物的總還原力（OD值）相當(dāng)于66.29 mg抗壞血酸，1 g白僵蠶95%乙醇提取物的總還原力（OD值）相當(dāng)于30.97 mg抗壞血酸。結(jié)果表明，白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物均具有較強(qiáng)的還原能力，其總還原力為白僵蠶80%乙醇提取物＞白僵蠶65%乙醇提取物＞白僵蠶95%乙醇提取物。

3 討論

DPPH含有3個(gè)共振苯環(huán)，是一種較為穩(wěn)定且難以清除的自由基，它的單電子在517 nm處有較強(qiáng)吸收峰。DPPH自由基的乙醇溶液呈紫色，與抗氧化劑反應(yīng)后，其單電子將接受一個(gè)電子或者與氫原子配對(duì)而形成穩(wěn)定的DPPH-H化合物，使乙醇溶液從原本的紫色轉(zhuǎn)化為黃色［20］。DPPH憑借這一高靈敏特性，常被用于定量檢測(cè)樣品的抗氧化性。羥基自由基（·OH）是最強(qiáng)大的活性氧化物之一，本身攜帶未配對(duì)電子，可通過無選擇性地?fù)寠Z其他分子的電子來產(chǎn)生一系列的自由基反應(yīng)，能夠清除羥基自由基，是抗氧化劑抗氧化力強(qiáng)的有效證明。因此，羥基自由基也常被用于抗氧化試驗(yàn)［21］。高價(jià)鐵離子是為大家所熟知的氧化劑，二價(jià)鐵離子在空氣中暴露一段時(shí)間就會(huì)轉(zhuǎn)化為三價(jià)鐵離子，由此采用鐵氰化鉀法可測(cè)定抗氧化劑的總還原能力［19］。

圖3 白僵蠶不同濃度乙醇提取物的還原能力Fig 3 Reduction Ability of Extracts from Bombyx Batryticatus by different Concentrations ethanol

本試驗(yàn)通過提取制備白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物，并分別檢測(cè)其對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除活性以及還原能力，來評(píng)價(jià)白僵蠶不同濃度乙醇提取物的體外抗氧化作用。研究結(jié)果顯示，白僵蠶65%、80%、95%乙醇提取物均具有較好的DPPH自由基清除活性、羥基自由基清除活性和還原能力，其清除率、吸光度與提取物濃度均呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系，表現(xiàn)出良好的體外抗氧化作用。在65%、80%、95%三個(gè)乙醇提取濃度中，白僵蠶80%乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)，其IC50值為3.916 μg/mL；白僵蠶80%乙醇提取物的還原能力也最強(qiáng)，其AEAC值為66.29 mgVC/g；白僵蠶65%乙醇提取物對(duì)羥基自由基的清除能力最強(qiáng)，其AEAC值為162.43 mgVC/g。綜合來看，白僵蠶80%乙醇提取物的體外抗氧化作用更好。

蔣學(xué)采用CCD響應(yīng)面方法，初步確認(rèn)了80%乙醇是提取白僵蠶中黃酮類和多糖類化合物的最佳提取溶劑濃度［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，白僵蠶80%乙醇提取物具有更優(yōu)的體外抗氧化活性，與蔣學(xué)研究結(jié)果相一致。本研究結(jié)果為建立白僵蠶抗氧化成分提取的最佳技術(shù)工藝提供理論依據(jù)，也促進(jìn)了白僵蠶抗氧化相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)。