動物血液采集及血清分離技術(shù)

李紅艷，張濤濤，張 艷，韓竹平，胡芝金，蔣宗仁

(1. 貴州省綏陽縣動物疫病預(yù)防控制中心，貴州 綏陽 563300； 2. 貴州省綏陽縣畜牧漁業(yè)站，貴州 綏陽 563300)

在基層獸醫(yī)實驗室檢測工作中，常常需要對動物進(jìn)行采血及血清分離，如果血液采集方法不當(dāng)、樣品編號遺忘或錯誤、樣品保存不符合要求、分離血清方法不規(guī)范等，會造成血液或血清樣品編號不明、分離不出血清、溶血、凝膠、腐敗變質(zhì)、檢測量不足等問題，從而導(dǎo)致重復(fù)抽血，影響動物正常生產(chǎn)生活，同時也會引起養(yǎng)殖戶的反感，造成防疫工作障礙和不必要的人力、物力、財力浪費(fèi)，增加工作量，影響工作進(jìn)度，降低工作效率。為了改善和解決這一問題，筆者將多年來長期從事動物血液采集及血清樣品分離技術(shù)的一些經(jīng)驗和有效做法介紹如下，供同行參考。

1 動物血液采集技術(shù)

1.1 采血管選擇根據(jù)不同的檢測項目選用合適的采集管。如：采集全血選用含有抗凝劑的一次性真空采血管(EDTA-紫色蓋)用于檢測非洲豬瘟病毒等；制備血清選用不含任何添加劑的一次性真空采血管(紅色蓋)或一次性采血器，用于檢測小反芻獸疫病毒抗體等。

1.2 時間及動物選擇選擇早晨未飼喂(空腹)或者停食6 h后(保證飲水充足)，體脂不能過多的動物。

1.3 消毒保定好動物，對采血部位用剪毛剪剪毛(家畜)或拔毛(家禽)后用2%～5%碘伏棉球由里向外做點(diǎn)狀螺旋式消毒，停頓片刻后，再用75%酒精棉球由里向外做點(diǎn)狀螺旋式脫碘。

1.4 采血方法

1.4.1 真空采血管采集酒精脫碘停頓片刻(酒精揮發(fā)后)，將采血針頭從采血部位穿刺進(jìn)入血管，見回血后，用采血針的橡膠帽端穿刺連接并稍微傾斜真空采血管，負(fù)壓使血液沿管壁自動抽血，待血量達(dá)到所需標(biāo)示后，用無菌干棉簽同時按壓皮膚針眼和血管壁針眼，迅速先拔出采血部位針頭，套上護(hù)針帽，再拔出采血管端針頭投入利器盒集中消毒無害化處理。無菌干棉簽繼續(xù)壓迫3 min以上，防止皮下淤血。如需多管積集血樣，可將連接真空采血管的橡膠帽端針頭拔出再刺入另一采血管即可。

1.4.2 采血器采集酒精脫碘停頓片刻后從采血部位進(jìn)針，見回血后慢拉采血器活塞開始積集血液，采血量達(dá)到所需標(biāo)示后，用無菌干棉簽同時按壓皮膚針眼和血管壁針眼，同時繼續(xù)慢拉采血器活塞防止筒內(nèi)血樣因壓力差溢出，拔出針頭，用無菌干棉球繼續(xù)壓迫3 min以上，防止皮下淤血。另一人給采血器套上護(hù)針帽，將活塞外拉預(yù)留血清析出空間，去除推桿投入廢物盒集中消毒無害化處理[1]。

1.5 信息記錄(1)抗凝血采集完后，立即緩緩轉(zhuǎn)動采集管，讓血液和抗凝劑充分混勻，然后在采血管上用油性記號筆按規(guī)定標(biāo)明樣品編號，放入裝有試管架的冷藏箱(4 ℃)中。(2)制備血清血采集完后，立即在采血管上用油性記號筆按規(guī)定標(biāo)明樣品編號，然后放入裝有試管架的保溫箱中(25～37 ℃)。 (3)按相關(guān)要求用簽字筆規(guī)范、真實、完整填寫采樣表，所填樣品編號應(yīng)與所采血樣編號對應(yīng)。

2 血清分離技術(shù)

(1)制備血清血采集完并編號后，立即輕放入能固定采血管的試管架內(nèi)(如原裝采血管泡沫盒)。(2)將試管架放在25～37 ℃室溫下靜置3～12 h(靜置時間與室溫成反比)，讓血清自然析出。如果氣溫低于25 ℃，可用礦泉水瓶、高溫瓶等裝1～3瓶60～100 ℃ 熱水放在疫苗保溫箱里可達(dá)所需溫度，注意放瓶時瓶和血樣距離5 cm以上，避免燙壞血樣。(3)血樣靜置3～12 h后，剔除溶血樣品，挑選血清析出效果好、管內(nèi)血樣基本一致的采血管對稱放入普通離心機(jī)。對血清析出效果不好或凝血塊未下沉堵住血清上溢的采血管，可在生物安全柜內(nèi)將1份血樣用1根無菌牙簽(注意不能混用)輕繞管壁1周松動血塊，蓋好蓋子靜置15～30 min，挑選血樣基本一致的采血管對稱放入普通離心機(jī)。(4)以2 000～3 000 r/min離心5～10 min，離心后靜置15～30 min，待氣溶膠沉淀后取出采血管，按編號順序放入泡沫試管架。(5)在生物安全柜內(nèi)打開采血管，直接用手(戴好橡膠手套)或移液器小心將血清緩慢倒入或移入潔凈、干燥的1.5～2 mL無菌EP離心管中，注意勿倒入(或移入)凝血塊。然后在EP離心管上用油性記號筆按采血管上的原始編號對應(yīng)編號。(6)將已編號血清放入2～8 ℃冷藏柜(箱)中，在最短時間內(nèi)送達(dá)實驗室。血清樣品到達(dá)實驗室后若暫時不進(jìn)行處理或檢測，則應(yīng)放入 -15 ℃冷凍柜中保存。

3 注意事項

(1)上述所有接觸動物和樣品的環(huán)節(jié)均應(yīng)做好個人防護(hù)，穿戴好防護(hù)服，做好動物的消毒、防護(hù)及環(huán)境、用具的無害化處理等。(2)采血前應(yīng)事先通知養(yǎng)殖場(戶)，準(zhǔn)備好被采血動物，保證充足的飲水，做好清潔衛(wèi)生、消毒工作等。采血時盡量不打亂飼養(yǎng)習(xí)慣，如盡量在早上9：00放養(yǎng)羊前進(jìn)行采血。(3)氣溶膠擴(kuò)散力較強(qiáng)，操作人員在采集血液時要站在上風(fēng)方向，分離血清時要在生物安全柜下操作。(4)采集血液前采血部位要剪毛或拔毛，嚴(yán)格由里向外做點(diǎn)狀螺旋式消毒，嚴(yán)禁手或物品等接觸針頭，避免皮毛、手或物品上的異物、病原微生物等隨針頭混進(jìn)采集管使樣品出現(xiàn)腐敗、溶血等現(xiàn)象，從而影響動物疫病監(jiān)測進(jìn)度和監(jiān)測結(jié)果。(5)動物耳靜脈、翅下靜脈采血完畢針頭拔出后采血部位容易出現(xiàn)淤血，特別是禽類容易出現(xiàn)且短期內(nèi)難以恢復(fù)，引起畜主的反感情緒。為了得到畜主對動物采血工作的支持和配合，要求操作人員在采集血液時技術(shù)熟練、利索，能達(dá)到“一針見血”，采血后嚴(yán)格止血3 min以上等。(6)集血時采血管應(yīng)稍微傾斜，避免血液直接滴入底部產(chǎn)生氣泡，或紅細(xì)胞受撞擊發(fā)生破裂引起溶血等。(7)劇烈晃動、冷凍溫度不合適會使紅細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)釋放入血漿，發(fā)生溶血現(xiàn)象，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，在混勻血液和抗凝劑時應(yīng)緩緩轉(zhuǎn)動采集管；在血樣運(yùn)輸途中、血清移出前應(yīng)盡量保持靜置狀態(tài)；抗凝血混勻后冷藏保存，血清樣品析出途中應(yīng)在25～37 ℃條件下保存。(8)血清在析出過程中，如果血液中比紅細(xì)胞比重小的纖維蛋白原不能聚集紅細(xì)胞形成比重較大的血凝塊，會發(fā)生凝固不全形成膠凍狀樣品。原因可能是采血時動物剛進(jìn)食不久、飲水過少、脂肪過多、血液保存溫度過低或者保存靜置時間不夠等。要避免此種現(xiàn)象，就應(yīng)嚴(yán)格在早晨飼喂前(空腹)或停食后6 h(保證飲水充足)采集體脂不能過多的動物血，血樣采集后立即放在室溫(25～37 ℃)靜置3～12 h。(9)注意動物、采樣表、血液樣品編號、血清樣品編號“四統(tǒng)一”，相互對應(yīng)，以防混淆。(10)血清不宜反復(fù)凍融，否則會使血清中的脂蛋白和纖維蛋白變性，導(dǎo)致出現(xiàn)絮狀沉淀物，影響血清檢測效價[2]。

4 小結(jié)

在動物采血及血清分離工作中，采血動物的選擇是前提，是采集有效血量、合格血液的基礎(chǔ)；保定牢固、部位準(zhǔn)確、規(guī)范操作、方法得當(dāng)是保障，是采集足量合格血液的保證；控溫保存、平穩(wěn)運(yùn)輸是關(guān)鍵，是分離出合格血清的重要環(huán)節(jié)；工作細(xì)致、環(huán)節(jié)緊扣、步步對應(yīng)是結(jié)果，是圓滿完成血液采集與血清分離的基本要求。