miRNA參與調(diào)控病毒復制的研究進展

張黔東，王 微，袁 陽，曾茂芹，劉妍罕，楊 穎，2，3，溫貴蘭，2，3，程振濤，2，3，文 明，2，3*

(1. 貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025； 2. 貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3. 貴州省動物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550025)

miRNA(或microRNA)是廣泛分布于真核生物和動植物細胞內(nèi)的長度約為 22個核苷酸的內(nèi)源性單鏈小分子RNA，位于基因組非編碼區(qū)，最早在線蟲中被發(fā)現(xiàn)[1]。miRNA能夠與靶基因mRNA非編碼區(qū)域序列互補結(jié)合，通過阻止翻譯或降解mRNA實現(xiàn)調(diào)節(jié)基因的功能[2]。近年研究表明，病毒感染能夠引起宿主miRNA的變化，miRNA不但能夠調(diào)控病毒的復制和致病性，還能夠調(diào)控宿主的免疫反應。因此，通過揭示病毒感染后宿主miRNA表達譜的變化以尋找miRNA的調(diào)控機制，對研究病毒的致病機制具有重要作用。病毒在自然界中廣泛存在，其中動物病毒種類繁多，多數(shù)對宿主有致病作用，常引起疫病流行，造成重大損失，如口蹄疫病毒、流感病毒、狂犬病病毒等，有的還可引起腫瘤，如雞馬立克氏病病毒、禽白血病病毒等。現(xiàn)將miRNA參與調(diào)控多種病毒復制的研究情況介紹如下，供參考。

1 miRNA簡介

miRNA是由內(nèi)源性基因編碼的長度約22個核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA，可負調(diào)控靶mRNA的表達，最終導致mRNA降解或翻譯抑制[3]。miRNA調(diào)控具有多樣性和復雜性，1個miRNA可與1個或多個靶基因的3’UTR結(jié)合，1個靶基因也可被多個miRNA調(diào)控[4]。miRNA的作用機制主要有以下幾個過程：首先在細胞核中原始miRNA經(jīng)Drosha和輔助因子DGCR-8復合體的處理，形成pri-miRNA，之后去除帽子和尾巴結(jié)構(gòu)，形成長度為60～75 nt具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體(pre-miRNA)，轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)由Dicer酶剪切形成成熟的miRNA，miRNA與胞質(zhì)中RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC) 結(jié)合，形成miRNA沉默復合體，進而發(fā)揮作用。miRNA沉默復合體5’端6～8個核苷酸與靶基因3’端非翻譯區(qū)(3’-Untranslated region，3’-UTR)特異性結(jié)合，使靶基因mRNA降解或抑制其翻譯，負調(diào)控靶基因的表達[5]。

2 miRNA與病毒感染

病毒感染是影響動物生長發(fā)育的生物因素之一，甚至造成動物的死亡。研究表明，病毒感染宿主后2種不同來源的miRNA參與病毒基因的調(diào)控：1種是宿主細胞編碼的miRNA(宿主miRNA)；另外1種是病毒編碼的miRNA。前者主要通過天然免疫通路、炎癥因子和細胞凋亡等間接參與病毒的復制、感染及致病過程[6]。后者則通過調(diào)控病毒自身基因，幫助病毒潛伏或逃避宿主免疫系統(tǒng)的識別[7]。

2.1 miRAN與流感病毒流感病毒(Influenza virus，IV)，是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的代表種，包括人流感病毒和動物流感病毒，病毒顆粒多為球形(新分離的多為絲狀)，直徑為80～120 nm，有囊膜和纖突，呈核衣殼螺旋形對稱。基因組為線狀負鏈單股RNA，長度為10 000～13 600 nt。近年研究發(fā)現(xiàn)，流感病毒多個基因的保守區(qū)與宿主miRNA高度同源，這些病毒基因可作為宿主miRNA的潛在靶點。HA和NA是流感病毒的表面蛋白，HA的功能是參與病毒與宿主細胞的結(jié)合，NA的功能在于當病毒成熟釋放時，通過切割其表面上的糖基，協(xié)助病毒脫離宿主細胞[8]。研究發(fā)現(xiàn)，存在特定的宿主miRNA通過靶向病毒HA或NA抑制病毒復制增殖的作用。Zhang S等[9]研究表明，H7N9型流感病毒感染人單核細胞白血病細胞THP后，miRNA Let-7e作用于細胞的Toll樣受體4(toll like receptor 4，TLR4)信號通路，上調(diào)IL-1和IL-6的表達，通過增強宿主細胞的免疫應答降低HA表達，從而抑制病毒的復制與增殖，證明宿主miRNA可作為潛在的免疫系統(tǒng)激活劑而發(fā)揮抗病毒作用。張森[10]篩選了與IAV(甲型流感病毒)感染有關(guān)的宿主miRNA分子，并以其中表達差異顯著的miR-203(micro RNA-203)分子為研究對象，通過對miR-203靶基因的篩選和驗證，首次闡明了IAV感染過程中宿主miR-203與病毒之間的關(guān)系，解釋了IAV感染誘導miR-203表達的機制以及miR-203對病毒復制的負反饋調(diào)節(jié)，豐富了流感病毒感染過程中宿主-病毒在miRNA水平的相互作用機理。

2.2 miRNA與新城疫病毒新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)，副黏病毒亞科(Paramyxovirinae)，禽腮腺炎病毒(或禽副黏病毒)屬(Avulavirus)。病毒顆粒呈多形性(可呈絲狀)，直徑150～300 nm。有囊膜和纖突，纖突長8～20 nm，核衣殼螺旋對稱?；蚪M為負鏈單股RNA，長度為15 000～16 000 nt。NDV 通過其表面糖蛋白與含唾液酸的化合物(如神經(jīng)節(jié)苷脂和 Ngc 蛋白受體)結(jié)合攻擊呼吸道上皮細胞。膜融合是NDV入侵宿主的主要方式，除此之外還有受體介導的內(nèi)吞作用方式、胞膜窖依賴性內(nèi)吞方式[11]。陳嚴玉[12]通過分析感染新城疫強、弱毒株后雞巨噬細胞的miRNA表達譜，并對差異表達的miRNA進行功能分析，證實了宿主miRNA155參與病毒感染引起的炎癥反應，并且可能參與了TAB2所在的p38MAPK信號通路，通過一系列的反應影響細胞的病變現(xiàn)象或者病毒的組裝和出芽。Chen Yu等[13]用NDV感染雞胚成纖維細胞株DF-1細胞后，將miRNA模擬物和抑制劑轉(zhuǎn)染到NDV感染的DF-1細胞中，觀察miRNA在NDV復制中的作用，結(jié)果表明gga-miR-451和gga-miR-199-5p促進了NDV的復制，而gga-miR-19b-3p和gga-miR-29a-3p抑制了NDV的復制，進一步的功能研究顯示gga-miR-451可抑制NDV誘導的炎癥反應。

2.3 miRNA與日本乙型腦炎病毒日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)又稱乙腦病毒，屬于黃病毒科(Flaviviridae)，黃病毒屬(Flavivirus)。病毒顆粒為球狀，直徑約50 nm，有1層結(jié)合牢固的類脂囊膜及不明顯的膜粒，核衣殼可能為20面體對稱?；蚪M為線狀正鏈單股RNA，長度為10 600～10 900 nt。JEV感染神經(jīng)元細胞可顯著上調(diào)宿主miR-let-7f的表達；當JEV感染miR-let-7f過表達的細胞后，細胞內(nèi)病毒效價以及釋放至體液中的病毒顆粒數(shù)會明顯降低，證明miR-let-7f上調(diào)可抑制JEV復制[14]。杜加茹等[15]通過分析感染JEV小鼠原代神經(jīng)元細胞中miRNA的表達譜，小鼠原代腦神經(jīng)元細胞中mmu-miR-21a-3p、mmu-miR-223-5p、mmu-miR-147-3p、mmu-miR-155-5p、mmu-miR-146a-5p的表達可促進JEV-E基因在神經(jīng)元細胞中的表達，而mmu-miR-301a的表達抑制JEV-E基因的表達。JEV-E蛋白基因是JEV的毒力蛋白基因。JEV-E蛋白的毒力氨基酸位點突變可以改變JEV的致病性。這些位點通常用作檢測減毒疫苗質(zhì)量和判斷野毒JEV突變毒力的關(guān)鍵指標。呂雯婷[16]以miR-499-5p為研究對象，通過增殖培養(yǎng)、TCID50測定、JEV qRT-PCR等檢測方法，最終證實了在乳倉鼠腎細胞(BHK-21)及豬腎傳代細胞(PK-15)中miR-499-5p表達上調(diào)均可抑制JEV增殖，證明miR-499-5p對JEV的抑制作用具有普遍性。

2.4 miRNA與禽白血病病毒禽白血病病毒亞型J(Avian leukosis virus-J，ALV-J)，屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，正逆轉(zhuǎn)錄病毒亞科(Orthortrovirinae)，甲型逆轉(zhuǎn)錄病毒屬(Alpharetrovirus)。病毒顆粒直徑80～100 nm，有囊膜，具有獨特的3層結(jié)構(gòu)。最內(nèi)層為基因組核衣殼蛋白復合物，包含反轉(zhuǎn)錄酶，螺旋對稱；中間層為20面體衣殼，直徑約60 nm；外層為源于宿主細胞膜的囊膜?；蚪M為二倍體，由2個線狀正鏈單股RNA組成，每個單體長7 000～11 000 nt，具有3’端聚A尾及5’端帽。Feng W等[17]發(fā)現(xiàn)3個宿主miR-146a-5p、miR-429-3p、miR-155的靶標均參與Wnt通路，通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路導致感染ALV-J的雞生長遲緩。謝青梅[18]利用miRNA芯片技術(shù)，在感染ALV-J的10周齡雞肝臟中發(fā)現(xiàn)并鑒定出12個與雞J亞群禽白血病腫瘤形成相關(guān)的重要miRNA，并發(fā)現(xiàn)了gga-miR-375、gga-let-7b/7i、gga-miR-221/222、gga-miR-125b在J亞群禽白血病腫瘤形成過程中起抑癌基因的作用，而gga-miR-2127、gga-miR-1456、gga-miR-1790則起到致癌基因作用。

3 小結(jié)與展望

綜上所述，宿主編碼靶向病毒基因的miRNA是在病毒與宿主的相互作用過程中產(chǎn)生并保留下來的、可作為宿主抗病毒免疫反應的重要抗病毒因子，在病毒感染的早期發(fā)揮重要作用[19]。miRNA對在病毒感染以及宿主抗病毒感染的免疫應答中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。因此，對miRNA的研究越來越受到重視，同時也取得了較大進展。相信隨著miRNA研究的深入，特別是miRNA相關(guān)檢測技術(shù)的發(fā)展，miRNA會成為病毒診斷及療效監(jiān)控中特異性和靈敏度均較高的生物標志物。