受體相互作用蛋白1和受體相互作用蛋白3在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用

魏敏，閆言，李莉，王寶璽

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院整形外科醫(yī)院皮膚科，北京 100144)

免疫系統(tǒng)可通過激發(fā)各種機(jī)體保護(hù)反應(yīng)(包括誘導(dǎo)炎癥分子和干擾素)、激活細(xì)胞死亡途徑，消除病原體感染或受損的細(xì)胞，從而應(yīng)對(duì)感染和組織損傷。炎癥及細(xì)胞死亡信號(hào)通路廣泛存在于各類炎癥疾病和退行性疾病中。受體相互作用蛋白(receptor-interacting protein，RIP)家族共有7個(gè)成員，即RIP1～7，其中RIP1和RIP3是調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)和細(xì)胞死亡途徑的關(guān)鍵分子[1-2]。凋亡是一種可保持細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞死亡形式，而壞死性凋亡是一種可導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性受損的細(xì)胞死亡形式[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞不同死亡途徑間存在交互關(guān)聯(lián)，不僅凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的某些成分可以參與壞死性凋亡，有些成分還具有拮抗壞死性凋亡的作用[4]。因此，對(duì)細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡的研究逐漸成為研究的焦點(diǎn)。細(xì)胞通過凋亡、壞死性凋亡或兩種途徑混合死亡，取決于導(dǎo)致細(xì)胞死亡的關(guān)鍵蛋白R(shí)IP1和RIP3。RIP1被上游信號(hào)激活泛素化修飾后，可激活核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)，使NF-κB解除IκB的抑制而移位入核，促進(jìn)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄[5]。當(dāng)受到胞內(nèi)信號(hào)刺激發(fā)生去泛素化時(shí)，RIP1可通過與RIP3共有的RIP同型相互作用基序(RIP homotypic interaction motif，RHIM)結(jié)合，激活下游胱天蛋白酶(caspase)-8、caspase-3，引發(fā)細(xì)胞凋亡[6]。若caspase的激活受到抑制，RIP1和RIP3則可激活混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(mixed lineage kinase domain like protein，MLKL)，使其形成磷酸化的多聚體，破壞細(xì)胞膜，引發(fā)細(xì)胞壞死性凋亡[4,7]?，F(xiàn)就RIP1和RIP3在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用予以綜述。

1 RIP1和RIP3的結(jié)構(gòu)及功能

RIP家族共包括7個(gè)成員，即RIP1、RIP2、RIP3、RIP4、RIP5、RIP6和RIP7。RIP1由Stanger等[8]首先發(fā)現(xiàn)，被定義為含有死亡結(jié)構(gòu)域的蛋白，因其可與死亡受體CD95的死亡結(jié)構(gòu)域相互作用，故命名為“受體相互作用蛋白”。RIP家族成員均有一個(gè)同源的絲氨酸-蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，具有激酶和非激酶的作用。當(dāng)細(xì)胞周圍刺激信號(hào)發(fā)生變化時(shí)(如病毒感染、發(fā)生炎癥或組織損傷)，RIP蛋白家族被激發(fā)，可引發(fā)類瀑布樣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)。

RIP1的分子質(zhì)量為76 000，編碼671個(gè)氨基酸，包含N端激酶結(jié)構(gòu)域、C端死亡結(jié)構(gòu)域和一個(gè)含有RHIM的橋接中間結(jié)構(gòu)域[9]。RIP1可通過其死亡結(jié)構(gòu)域以激酶非依賴性方式激活NF-κB或通過其RHIM發(fā)揮銜接子的功能，從而啟動(dòng)多個(gè)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。RIP1的泛素化是其激活NF-κB所必需的，然而不同位置氨基酸的泛素化可導(dǎo)致不同的反應(yīng)，如RIP1的第63位賴氨酸泛素化可激發(fā)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而其第48位賴氨酸泛素化可導(dǎo)致RIP1降解，抑制NF-κB炎癥反應(yīng)[10]。熱激蛋白90能夠促進(jìn)RIP1的調(diào)控，其功能受到抑制會(huì)影響RIP1功能的發(fā)揮及其應(yīng)對(duì)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)刺激時(shí)下游信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[11]。RIP1也可與其他含有RHIM的蛋白質(zhì)相互作用，如RIP3、干擾素(interferon，IFN)-β、TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β，TRIF)以及DNA依賴的干擾素調(diào)節(jié)因子激活因子(DNA-dependent activator of interferon-regulatory factor，DAI)等[12]。RIP2除了含有激酶結(jié)構(gòu)域、橋接中間結(jié)構(gòu)域(不包含RHIM序列)，還包含C端半胱氨酸蛋白酶激活和招募結(jié)構(gòu)域。RIP3的分子質(zhì)量為56 800，由518個(gè)氨基酸組成，含有與RIP1相似的N端激酶結(jié)構(gòu)域和RHIM基序[13]。RIP1和RIP3的激酶結(jié)構(gòu)域可發(fā)生自身磷酸化，并可磷酸化MLKL[4,7]。RIP3的C端RHIM可介導(dǎo)RIP3與具有相同結(jié)構(gòu)的RIPl、TRIF、IFN、DAI等蛋白的相互作用[14]。RIP3獨(dú)特的C端片段可以與RIP1結(jié)合，抑制RIP1和TNF受體1(tumor necrosis factor 1，TNFR1)介導(dǎo)的NF-κB活化[15]。RIP4與RIP5均包括激酶結(jié)構(gòu)域和橋接中間結(jié)構(gòu)域，且均含有C端錨蛋白重復(fù)序列；RIP6和RIP7除了RIP家族共有的激酶結(jié)構(gòu)域和錨蛋白重復(fù)序列，還包含一些其他結(jié)構(gòu)域，如富含亮氨酸重復(fù)序列和WD40重復(fù)序列[4]。

2 RIP1和RIP3參與調(diào)控的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

RIP1是一種多效性蛋白，可通過其死亡結(jié)構(gòu)域以激酶非依賴性的方式激活NF-κB通路，還可通過其RHIM基序與其他含有RHIM的蛋白相互作用，包括RIP3、TRIF和DAI。其中，RIP1與RIP3結(jié)合可以作為一種真正的激酶同時(shí)觸發(fā)細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡。

2.1RIP1參與調(diào)控NF-κB通路 TNF、Fas配體及TNF相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體均可結(jié)合相應(yīng)受體，激活RIP1，引發(fā)下游的炎癥反應(yīng)。例如，TNF與TNFR1結(jié)合形成信號(hào)復(fù)合物，導(dǎo)致磷酸化的RIP1結(jié)合E3泛素連接酶，同時(shí)誘發(fā)其他成員聚集而共同組成膜相關(guān)復(fù)合物，這些成員包括TNFR1相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白、TNFR相關(guān)因子2和細(xì)胞凋亡抑制蛋白(celluar inhibitor of apoptosis protein，cIAP)等[16]。cIAP可通過其泛素連接酶在RIP1上形成賴氨酸63連接的聚泛素鏈和(或)線性泛素鏈組裝復(fù)合體，激活NF-κB[17]。這種泛素化修飾排除了RIP3或Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(Fas-associated protein with a novel death domain，F(xiàn)ADD)與RIP1的結(jié)合，從而阻斷凋亡的誘導(dǎo)。RIP1泛素化后可以被抑制性IκB激酶和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β激活激酶1的成員識(shí)別，導(dǎo)致抑制性IκB激酶激活，進(jìn)而激活胞質(zhì)中與NF-κB結(jié)合的IκB激酶，并促使IκB激酶進(jìn)一步發(fā)生降解，導(dǎo)致NF-κB脫離與IκB的連接并移位至細(xì)胞核，與對(duì)應(yīng)的DNA片段連接，導(dǎo)致下游的炎癥因子在基因水平被轉(zhuǎn)錄；同時(shí)，NF-κB基本調(diào)節(jié)因子通過與RIP1的連接，抑制細(xì)胞死亡的發(fā)生[5]。NF-κB信號(hào)通路也可誘導(dǎo)抑制凋亡蛋白基因轉(zhuǎn)錄而負(fù)向調(diào)節(jié)凋亡，包括cIAP家族成員[18]、細(xì)胞 FADD樣白細(xì)胞介素-1β轉(zhuǎn)化酶抑制蛋白和抗凋亡Bcl-2家族等[19]。此外，RIP1還可通過隔離其他含有RHIM的蛋白質(zhì)保護(hù)細(xì)胞免受RIP3介導(dǎo)的壞死性凋亡的侵襲[20-21]。

2.2RIP1和RIP3共同參與調(diào)控凋亡及壞死性凋亡通路

2.2.1凋亡通路及其調(diào)控 細(xì)胞凋亡于1972年由Kerr等[22]首次提出。細(xì)胞凋亡是機(jī)體調(diào)控發(fā)育、控制衰老、維系內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制。死亡的細(xì)胞可發(fā)生萎縮、膜起泡、染色質(zhì)凝聚和DNA片段化，還可觀察到膜結(jié)合的凋亡小體，而凋亡小體最終會(huì)被吞噬和消化。

細(xì)胞凋亡可以通過激活外源性途徑中的細(xì)胞表面死亡受體或內(nèi)源性途徑中的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)效應(yīng)器等多種信號(hào)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。外源性凋亡途徑主要通過TNF、Fas配體及TNF相關(guān)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體與相應(yīng)的細(xì)胞表面死亡受體結(jié)合，激活RIP1和(或)RIP3，引起下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[23]。細(xì)胞表面死亡受體屬于跨膜蛋白，為TNFR超家族。凋亡的內(nèi)外源性途徑間既互相關(guān)聯(lián)，又互相獨(dú)立，聯(lián)合調(diào)控細(xì)胞凋亡。例如，根據(jù)細(xì)胞發(fā)生凋亡的途徑不同，死亡受體Fas誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞可分為FasⅠ型細(xì)胞和FasⅡ型細(xì)胞，F(xiàn)asⅠ型細(xì)胞(如胸腺細(xì)胞)可直接通過caspase轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號(hào)，而FasⅡ型細(xì)胞(如肝細(xì)胞)可誘導(dǎo)鈣離子釋放，從而促使使線粒體分裂，進(jìn)而增強(qiáng)線粒體細(xì)胞色素酶釋放,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[24]。

啟動(dòng)外源性凋亡途徑中TNFR1介導(dǎo)的凋亡，需要將膜相關(guān)復(fù)合物Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)榘|(zhì)信號(hào)復(fù)合物，首先，Smac蛋白通過與cIAP結(jié)合，誘導(dǎo)cIAP上自毀的K43連接的泛素鏈，導(dǎo)致其降解[25]；然后，含有RIP1的膜相關(guān)復(fù)合物Ⅰ從質(zhì)膜上解離，RIP1上的泛素鏈被去泛素酶去除；最后，膜相關(guān)復(fù)合物Ⅰ轉(zhuǎn)換為由FADD、pro-caspase-8以及RIP1和RIP3組成的胞質(zhì)信號(hào)復(fù)合物，胞質(zhì)信號(hào)復(fù)合物通過caspase-8發(fā)出細(xì)胞凋亡信號(hào)，激活下游的caspase-3和caspase-7，啟動(dòng)外源性凋亡[6]。由于Smac蛋白是一種凋亡前釋放到細(xì)胞質(zhì)中的線粒體膜內(nèi)間隙蛋白，因此推測(cè)，凋亡和壞死性凋亡在線粒體水平再次發(fā)生了改變。含有RIP1的細(xì)胞質(zhì)復(fù)合物可以通過RIP1的死亡結(jié)構(gòu)域募集FADD-caspase-8，并通過其RHIM域募集RIP3；而RIP3的激活對(duì)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡非常重要，其中RIP3在227位絲氨酸(人)或231位蘇氨酸、232位絲氨酸 (小鼠)磷酸化，RIP1在14位絲氨酸、15位絲氨酸、161位絲氨酸和166位絲氨酸磷酸化(人)[4]。激活后的RIP3和RIP1通過RHIM相互結(jié)合，并形成具有獨(dú)特的形態(tài)學(xué)特征的促壞死復(fù)合體，而壞死復(fù)合體可激活其下游的壞死激酶[26]。He等[27]認(rèn)為，可能是由于特定的突變或小分子與RIP3激酶位點(diǎn)的結(jié)合，或者只是由于RIP3過度表達(dá)，導(dǎo)致其招募RIP1，伴隨著FADD參與的胞質(zhì)信號(hào)復(fù)合物的激活。

2.2.2壞死性凋亡通路及其調(diào)控 RIP3是參與壞死性凋亡的重要分子，其導(dǎo)致壞死性凋亡的上游通路主要包括IFN、TNF、Toll和病原微生物RHIM，其中最主要的是TNF通路。TNF與TNFR1結(jié)合可形成膜相關(guān)復(fù)合物Ⅰ。當(dāng)RIP1去泛素化后，胞質(zhì)信號(hào)復(fù)合物形成，當(dāng)caspase-8或FADD缺失時(shí)，RIP1與RIP3相互作用形成促壞死復(fù)合體[28]，發(fā)生壞死性凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，某些病毒(如皰疹病毒)具有RHIM競(jìng)爭(zhēng)功能，可通過抑制其自然宿主細(xì)胞中RIP3的激活對(duì)抗TNF誘導(dǎo)的壞死性凋亡[29-30]。IFN信號(hào)通路也是壞死性凋亡的主要機(jī)制，可直接通過RIP1和RIP3結(jié)合物激活MLKL引起壞死性凋亡；根據(jù)是否依賴于Toll/白細(xì)胞介素-1受體結(jié)構(gòu)域，IFN信號(hào)通路分為依賴Toll/白細(xì)胞介素-1受體結(jié)構(gòu)域和不依賴于Toll/白細(xì)胞介素-1受體結(jié)構(gòu)域兩種機(jī)制。Toll/白細(xì)胞介素-1受體結(jié)構(gòu)域可誘導(dǎo)IFN-β激活RIP3，引起壞死性凋亡的發(fā)生；同時(shí)，IFN刺激可導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子2和IFN調(diào)節(jié)因子9的持續(xù)表達(dá)，促進(jìn)IFN誘發(fā)的巨噬細(xì)胞壞死性凋亡的發(fā)生[4]。除了被RIP1激活外，RIP3還可被其他細(xì)胞內(nèi)含有RHIM的蛋白激活，包括TRIF[27]和DAI[31]。病毒雙鏈RNA和脂多糖可分別激活病原識(shí)別受體Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)3和TLR4，進(jìn)而激活下游的TRIF，TRIF可通過RHIM結(jié)構(gòu)域被招募到RIP3上；壞死性凋亡發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵是caspase-8的活性被抑制，在caspase-8被抑制時(shí)，TLR3或TLR4激活可導(dǎo)致RIP3介導(dǎo)的壞死性凋亡[27]。抑制RIP1的活性可消除TLR4誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞壞死性凋亡[27,32]。然而，RIP1對(duì)于TLR3誘導(dǎo)的小鼠成纖維細(xì)胞壞死性凋亡是非必要的，表明除了RIP1外，RIP3還可直接被TRIF激活[32]。DAI參與激活先天免疫反應(yīng)，病毒感染可激活DAI，DAI直接激活RIP3引起RIP1非依賴性壞死性凋亡[31]。因此，RIP3是一個(gè)可用于壞死性凋亡的信號(hào)整合分子，其可通過RHIM與其他含有RHIM的信號(hào)分子相互作用，導(dǎo)致接收壞死性凋亡誘導(dǎo)信號(hào)通路的差異。

MLKL是RIP3的下游靶標(biāo)，激活的RIP3招募MLKL并在蘇氨酸357位和色氨酸358位上磷酸化人MLKL，在絲氨酸345位和絲氨酸347位磷酸化小鼠MLKL[33]。MLKL磷酸化對(duì)壞死性凋亡的發(fā)生也非常重要。RIP3介導(dǎo)的MLKL磷酸化觸發(fā)其構(gòu)象變化，導(dǎo)致MLKL的N端四螺旋束暴露，進(jìn)而導(dǎo)致MLKL寡聚，寡聚的MLKL可以結(jié)合磷脂(如心磷脂)，使MLKL與膜結(jié)合并將其N端插入各種細(xì)胞器和質(zhì)膜，導(dǎo)致細(xì)胞壞死性膜破裂[34]。因此，RIP3的去磷酸化可抑制細(xì)胞壞死性凋亡的發(fā)生。

炎性腸病患兒炎癥組織中的RIP3和MLKL水平均升高、caspase-8水平降低，這為研究壞死性凋亡和炎性腸病之間的聯(lián)系提供了相關(guān)證據(jù)[35]。細(xì)胞膜破裂的確切機(jī)制目前尚不明確。Wang等[36]提出，MLKL可通過形成細(xì)胞膜孔道直接破壞膜的完整性，但目前僅體外脂質(zhì)體研究支持該假設(shè)。此外，MLKL的磷酸化及其向膜的轉(zhuǎn)運(yùn)均不會(huì)引起自發(fā)性細(xì)胞死亡。Xia等[37]提出，MLKL可通過激活鈣離子、鈉離子或鎂離子通道介導(dǎo)離子的流入，通過滲透壓導(dǎo)致細(xì)胞死亡；在膜破裂前，MLKL的激活可導(dǎo)致質(zhì)膜氣泡形成，其特征是暴露出磷脂酰絲氨酸，而磷脂酰絲氨酸是一種具有吞噬作用的信號(hào)分子，與凋亡細(xì)胞死亡有關(guān)[38-40]。Gong等[38]和Yoon等[39]研究認(rèn)為，ESCRT-Ⅲ(endosomal sorting complex required for transport-Ⅲ)蛋白組分是質(zhì)膜氣泡形成以及含有MLKL的外泌體脫落所必需的。

3 問題與展望

雖然近年關(guān)于RIP家族信號(hào)通路的研究取得了一定進(jìn)展，但目前仍存在許多問題，如RIP1及RIP3參與調(diào)節(jié)的炎癥等非細(xì)胞死亡與凋亡、壞死性凋亡之間復(fù)雜的相互作用以及壞死性凋亡的調(diào)控與執(zhí)行，特別是MLKL破壞質(zhì)膜及其在壞死性凋亡中對(duì)靶標(biāo)細(xì)胞內(nèi)膜的作用及調(diào)控機(jī)制。此外，RIP1和RIP3在炎性疾病和退行性疾病(如多發(fā)性硬化[41]、肌萎縮側(cè)索硬化癥[42]、阿爾茨海默病[43-44]、Niemann-Pick病[45]和遺傳性視網(wǎng)膜變性[46])、癌癥(急性髓系白血病、乳腺癌和結(jié)直腸癌[47-48]等)以及正常衰老[49]的發(fā)病機(jī)制中均具有重要作用，是許多疾病潛在的治療靶標(biāo)。目前一些常用的化學(xué)抑制劑，如RIP1激酶抑制劑Necrostatin-1[50]、caspase-8抑制劑z-VAD-FMK[27]、RIP3激酶抑制劑GSK-872(GSK2399872A)[51]、MLKL抑制劑壞死磺酰胺[7]以及熱激蛋白90抑制劑阿螺旋霉素[52]等均可調(diào)控炎癥、凋亡和壞死性凋亡。例如，在野生型雄性小鼠1歲后，使用RIP1活性抑制劑5個(gè)月可防止衰老的出現(xiàn)[49]。未來深入探究RIP1和RIP3作用的相關(guān)分子機(jī)制，可以為RIP1和RIP3參與調(diào)控的疾病(如衰老、癌癥、炎性腸病)的診療提供指導(dǎo)。