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    子宮內(nèi)膜異位癥動物模型建立方法

    2021-12-01 07:13:22陳元歡武權(quán)生周小靜蔡爽喬新穎
    醫(yī)學(xué)綜述 2021年16期
    關(guān)鍵詞:動物模型腹腔內(nèi)膜

    陳元歡,武權(quán)生,周小靜,蔡爽,喬新穎

    (甘肅中醫(yī)藥大學(xué),蘭州 730000)

    子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EMT)指子宮腔內(nèi)具有活性的內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮腔以外的部位,發(fā)病率高達10%~15%,復(fù)發(fā)率高,并有逐漸增加的趨勢,且存在一定的惡變率,多見于育齡期女性[1-2]。EMT異位病灶的形態(tài)及組織特點隨月經(jīng)周期的變化而變化,因此EMT的主要臨床表現(xiàn)為周期性的下腹部墜脹疼痛,且進行性加重,偶爾伴有肛門下墜感、性交痛及月經(jīng)紊亂,嚴(yán)重者可導(dǎo)致不孕,影響患者的生活質(zhì)量及生理、心理健康。目前,臨床多采用激素類藥物治療EMT,治療周期長且副作用大,如達那唑可導(dǎo)致痤瘡、體重增加和毛發(fā)增多等;促性腺激素釋放激素類藥物可引發(fā)低雌激素癥狀(如潮熱、陰道干燥和性欲減退),較難根治。因此,明確EMT的病因、病機是研究的主要目標(biāo),對指導(dǎo)臨床治療有重要意義,而構(gòu)建EMT動物模型是相關(guān)研究的基礎(chǔ)。

    Jacoson于1922年首次用兔子成功建立了EMT動物模型[3],但由于兔沒有規(guī)律的動情期,故此項研究對臨床的指導(dǎo)意義存在爭議;隨著相關(guān)研究的不斷探索發(fā)現(xiàn),大鼠與人類基因譜較接近[4],故可將大鼠作為主要的實驗類研究對象。1998年Vernon和Wilson借助自體移植法成功建立了EMT大鼠模型[5],此后國內(nèi)外學(xué)者不斷探索豐富了各種建模方法,包括自發(fā)性、誘發(fā)性以及種植性等方法?,F(xiàn)就EMT動物模型建立方法進行綜述,以期明確各種不同造模方法的潛力與局限,為造模方法的合理選擇提供參考。

    1 自發(fā)性動物模型

    1.1靈長類自發(fā)性動物模型 MacKenzie和Casey[6]在尸檢獼猴時發(fā)現(xiàn),獼猴盆腔內(nèi)存在充滿灰色或巧克力色液體的囊腫,之后D′Hooghe等[7]使用腹腔鏡首次發(fā)現(xiàn)懷孕期間的狒狒可自發(fā)EMT,且隨后的研究發(fā)現(xiàn),約27%的狒狒患有EMT[8]。Eva Gruber-Dujardin等[9]借助自發(fā)性恒河猴EMT動物模型,對其異位子宮內(nèi)膜病灶的解剖分布、大體形態(tài)、組織學(xué)分化、免疫組織化學(xué)等進行詳細(xì)的研究發(fā)現(xiàn),非人靈長類動物發(fā)生EMT的發(fā)病部位及病理學(xué)組織結(jié)構(gòu)特征與人類相近。國外研究報道,非人靈長類動物的EMT發(fā)病率高于人類[10-11]。EMT的發(fā)病機制尚不明確,其相關(guān)假說包括經(jīng)血逆流學(xué)說、在位內(nèi)膜決定論等,其中經(jīng)血逆流學(xué)說在EMT的發(fā)病中具有至關(guān)重要的作用,月經(jīng)和EMT僅自然發(fā)生于部分女性和非人靈長類動物中,使構(gòu)建非人靈長類動物模型成為研究EMT病因、發(fā)病機制及治療方法的主要手段,但EMT動物模型的成模率低,研究周期長,需要極大的人力、物力,且定期檢查對動物造成一定的創(chuàng)傷,可能影響實驗結(jié)果,因此該造模方法較難應(yīng)用于實驗研究中。

    1.2K-ras基因激活小鼠模型 K-ras是一類原癌基因,可通過點突變的方式激活,EMT的惡變與K-ras基因的激活有一定相關(guān)性[12]。研究發(fā)現(xiàn),K-ras 4B基因在EMT患者在位內(nèi)膜中表達增加,K-ras 4A于增殖期在EMT患者在位內(nèi)膜組織中表達,高于非EMT患者[13]。Dinulescu等[14]將表達Cre重組酶的重組腺病毒載體注射到loxP-Stop-loxP-K-rasG12D/+(LSL-K-rasG12D/+)小鼠卵巢囊中,以激活致癌K-ras基因,注射8個月后,除卵巢發(fā)生子宮內(nèi)膜樣變外,47%的小鼠同時發(fā)生了腹膜EMT,病變子宮內(nèi)膜異位腺內(nèi)的上皮細(xì)胞被Cre介導(dǎo)發(fā)生K-ras激活,病灶發(fā)生的潛伏期較長、發(fā)生率低。因此,該動物模型的EMT雖為自發(fā)性,但目前并無K-ras基因突變導(dǎo)致EMT發(fā)病的報道,故該模型的研究對EMT病因及發(fā)病機制的研究無指導(dǎo)意義,僅可用于對EMT形態(tài)學(xué)的觀察及新治療方法的研究。

    2 誘發(fā)性動物模型

    2.1單純重復(fù)婦科手術(shù)操作 Sampson提出了EMT病因的種植學(xué)說[15],指出具有活性的子宮內(nèi)膜組織可經(jīng)輸卵管逆流至其他部位,并因引力作用種植于該部位,當(dāng)手術(shù)治療時,可能導(dǎo)致子宮內(nèi)膜腹腔或盆腔種植,亦可造成EMT。Harirchian等[16]通過對實驗動物重復(fù)進行診斷性刮宮及腹腔鏡操作,構(gòu)建了EMT狒狒模型,內(nèi)膜種植1個月后即可在腹腔鏡下觀察到EMT病灶,且手術(shù)切除術(shù)后的EMT復(fù)發(fā)率為75%。上述EMT動物模型與人類EMT的病因及發(fā)病機制部分相似,但發(fā)病周期較自發(fā)性動物模型短、成模率較高,且通過腹腔鏡觀察成模情況,對動物創(chuàng)傷較小,是較理想的造模方法,但該方法對實驗動物的要求較高,所需實驗動物需有規(guī)律月經(jīng)周期,但滿足條件的實驗動物有限,飼養(yǎng)要求高,導(dǎo)致實驗成本升高。

    2.2經(jīng)血逆流法 朗景和[17]在子宮內(nèi)膜種植學(xué)說基礎(chǔ)上進一步補充說明,提出了“在位內(nèi)膜決定論”,闡述了在位內(nèi)膜的分子生物學(xué)特點,即異位內(nèi)膜通過黏附、侵襲和血管形成,最終發(fā)展為異位病灶,這是EMT發(fā)生的決定因素。以“子宮內(nèi)膜種植學(xué)說”和“在位內(nèi)膜決定論”為理論指導(dǎo)復(fù)制EMT動物模型,根據(jù)實驗動物有無規(guī)律陰道出血,造模方法分為宮頸環(huán)扎術(shù)和子宮內(nèi)膜逆流法。

    2.2.1閉鎖宮頸口 閉鎖宮頸口可用于有規(guī)律月經(jīng)的一類實驗動物,D′Hooghe等[18]借助硅膠、電凝及結(jié)扎等方法閉鎖宮頸口,構(gòu)建EMT狒狒模型;李舒婷等[19]借助宮頸環(huán)扎術(shù)成功構(gòu)建EMT食蟹猴模型,通過慕絲林宮頸環(huán)扎帶的穿刺針穿過子宮的無血管區(qū)完成宮頸環(huán)扎術(shù),使食蟹猴的月經(jīng)血不能從陰道流出,而經(jīng)輸卵管流至腹腔,符合經(jīng)血逆流學(xué)說,并通過觀察舌面舌底血液灌注量探討舌象變換與證型的相關(guān)性。非人靈長類動物生殖生理特性與人相似,上述方法通過堵塞宮頸促進經(jīng)血逆流建立模型,對臨床具有指導(dǎo)意義;但該造模方法的EMT發(fā)病原因局限,僅適用于研究EMT的發(fā)病機制、組織形態(tài)及治療,且所選實驗動物需有規(guī)律的內(nèi)膜剝脫出血現(xiàn)象,目前用于EMT研究的動物中僅有非人靈長類動物具有這一特征,而非人靈長類動物多為保護級動物,數(shù)量有限且飼養(yǎng)要求高,因此此類造模方法并不能推廣。

    2.2.2子宮內(nèi)膜逆流法 子宮內(nèi)膜逆流法可用于無規(guī)律子宮出血動物的EMT模型建立,如兔、大鼠、小鼠,王哲和路芳[20]通過此法成功構(gòu)建EMT Wistar大鼠模型,于子宮近輸卵管端作縱向切口,隨后反復(fù)搔刮子宮切口并使用0.9%氯化鈉溶液向盆腔沖洗內(nèi)膜組織,模擬人因反復(fù)宮腔操作導(dǎo)致EMT發(fā)病的過程,成模率70%。子宮內(nèi)膜逆流法操作簡單,同時嚙齒類動物來源廣泛、飼養(yǎng)簡單、實驗成本低、復(fù)制方便,與通過手術(shù)移植構(gòu)建EMT模型的方法相比,減少了因手術(shù)因素導(dǎo)致的差異;但是,子宮內(nèi)膜逆流法的成模率較手術(shù)移植方法低,實驗周期較手術(shù)移植構(gòu)建EMT模型長,且反復(fù)手術(shù)操作對實驗動物的創(chuàng)傷較大,存在動物不能耐受以及感染發(fā)生風(fēng)險高的不足[20]。

    2.3藥物誘導(dǎo)法 Eskenazi等[21]的研究發(fā)現(xiàn),EMT的發(fā)病率與環(huán)境中二英濃度呈正相關(guān)。Rier等[22]的研究發(fā)現(xiàn),二英的慢性暴露與獼猴EMT的發(fā)生率有關(guān),認(rèn)為EMT模型也可通過藥物誘導(dǎo)獲得。張靜怡[23]通過米索前列醇成功誘導(dǎo)了恒河猴的子宮腺肌癥,即將一定量米索前列醇與0.9%氯化鈉溶液混合,連續(xù)6個月同一時間經(jīng)陰道注入陰道后穹窿處,并保證無藥物從陰道流出。藥物誘導(dǎo)法可避免手術(shù)操作中炎癥因素對實驗結(jié)果的影響,可針對性地研究EMT的病因及發(fā)病機制;但通過藥物誘導(dǎo)建立EMT動物模型的研究較少,由于實驗過程中可能出現(xiàn)的問題及風(fēng)險無法預(yù)料,且無明顯原因發(fā)生EMT的患者較多,此法EMT模型可能影響實驗動物的內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng),故對EMT患者的臨床指導(dǎo)意義較??;同時,建模周期長,且需開腹探查明確異位內(nèi)膜組織的形成,以上均限制了其應(yīng)用。

    2.4手術(shù)移植法

    2.4.1自體移植法 Vernon和Wilson[5]首次通過自體移植法成功建立EMT大鼠模型,隨后該方法被不斷完善,成為構(gòu)建EMT動物模型的常用方法。自體移植法包括子宮組織塊移植和子宮內(nèi)膜移植,與子宮組織塊移植相比,子宮內(nèi)膜移植較少發(fā)生粘連[24],因此,近年來多將子宮碎片的肌層與內(nèi)膜分離,將分離的子宮內(nèi)膜組織通過不同方法置于腹腔內(nèi)不同部位或皮下:①腹腔內(nèi)移植法[25-30]:利用可吸收縫線將分離的內(nèi)膜組織縫合于腹腔內(nèi)不同部位,如腹壁、腸系膜、腸壁等部位;②腹腔內(nèi)注射法[31-32]:將剝離好的內(nèi)膜組織剪成0.5 mm×0.5 mm的碎片,經(jīng)左下腹注入腹腔;③皮下移植法[33-34]:將分離好的子宮內(nèi)膜組織置入腹肌與皮下筋膜層之間;④皮下注射法[35-36]:用注射器將含有子宮內(nèi)膜碎片的0.9%氯化鈉溶液注射至盡量遠(yuǎn)離腹壁切口處的皮下。上述方法中使用的子宮內(nèi)膜組織均取自實驗大鼠自身的子宮,不存在免疫排斥反應(yīng),可觀察EMT的免疫發(fā)病機制及藥物治療作用。

    與腹腔內(nèi)注射法、皮下移植法及皮下注射法相比,腹腔內(nèi)移植法使用較多,技術(shù)更成熟,且定位準(zhǔn)確、成模率高,腹壁、骶韌帶等EMT好發(fā)部位均可移植成功,但將內(nèi)膜與欲移植部位縫合可能引發(fā)炎癥,造成盆腔粘連,病灶周圍病理形態(tài)改變,影響對病灶的觀察和測量,從而影響實驗結(jié)果。而腹腔內(nèi)注射法與皮下注射法避免了這一缺點,更符合子宮內(nèi)膜的自然黏附原則,同時可更直觀地觀察病灶發(fā)生發(fā)展的過程;但腹腔注射法易增加臟器浸潤的機會,皮下注射法因組織塊較小、生長緩慢,故兩法成模率均不高,且注射的含有內(nèi)膜的0.9%氯化鈉溶液濃度較難統(tǒng)一,易存在誤差。皮下移植法與皮下注射法均符合種植學(xué)說,與女性EMT的發(fā)病更為接近,且操作簡單,避免了內(nèi)膜縫合,但移植后實驗動物需腹腔注射雌激素,以促進內(nèi)膜黏附,若實驗?zāi)康呐c激素有關(guān),此法不適用。

    2.4.2同種異體移植法 同種異體移植法是指將同系實驗動物的內(nèi)膜組織進行異體移植。張薇等[37]發(fā)現(xiàn),同種異體Wistar大鼠EMT模型的成模率略高于自體移植成模率。崔金秀[38]通過皮下移植法成功構(gòu)建大鼠同種異體EMT模型,成模率為66.7%。崔陽陽等[39]通過“腹腔+皮下”注射法成功構(gòu)建EMT KM大鼠模型,除內(nèi)膜組織來源不同外,其余方法均與自體移植法相同,不僅避免了對實驗動物子宮完整性的破壞,且避免了腹腔手術(shù)操作,減少了手術(shù)及異物對盆腔微環(huán)境的影響,故該方法簡單易重復(fù),對受體小鼠的創(chuàng)傷小,降低了因感染或反復(fù)手術(shù)操作導(dǎo)致的死亡率。但同種異體移植法在EMT動物模型構(gòu)建中的使用較少,實驗動物對同種屬來源的異位子宮內(nèi)膜免疫排斥的程度以及是否影響成模率尚不清楚。

    2.5宮腔開放法 哈春芳等[40]通過宮腔開方法成功構(gòu)建了EMT Wistar大鼠模型,即將實驗大鼠子宮內(nèi)膜面縫合至子宮骶韌帶及大網(wǎng)膜血運豐富處,成模率(81.08%)與傳統(tǒng)方法成模率(83.78%)差異較小,且肉眼所見病灶多以粘連為主,局部可見炎癥細(xì)胞浸潤。宮腔開放法充分利用炎癥誘導(dǎo)的腹腔內(nèi)環(huán)境建立EMT模型,與EMT雌激素依賴性炎癥性疾病的特征較為相似,且內(nèi)膜組織與盆腔的接觸面較大,便于取材、觀察;與傳統(tǒng)移植法相比,宮腔開放法不需要制備移植物,操作簡單,成模率與自體移植法無明顯差異,是較理想的EMT方法。但該方法使用較少,且相關(guān)實驗研究少,對實驗結(jié)果的不良影響亦不明確。

    3 種植法動物模型

    種植法又稱異種異體移植法[41],即將人的異位內(nèi)膜組織種植于實驗動物體內(nèi),主要移植方法包括①增殖期/分泌期內(nèi)膜移植;②人在位內(nèi)膜/異位內(nèi)膜/蛻膜組織等不同來源移植物移植,Stocks 等[42]手術(shù)切除裸鼠卵巢,皮下植入緩釋雌二醇膠囊,將人子宮內(nèi)膜組織片段注入裸鼠腹腔,成功建立人源性裸鼠EMT模型;③純化不同子宮內(nèi)膜細(xì)胞種植;④人免疫功能重建EMT模型。

    與其他方法相比,異種異體移植法保留了人異位內(nèi)膜的組織形態(tài)及生物特性,使病灶的病理改變與人體更為接近,且對藥物的反應(yīng)無變化,因此對研究 EMT的發(fā)病機制及治療具有重要意義;但此法仍存在不足:①對實驗動物的要求較高,目前僅免疫缺陷小鼠符合要求,對手術(shù)耐受性較小,多次手術(shù)操作易造成小鼠死亡;②由于實驗小鼠存在免疫缺陷,故不能用于免疫因素與EMT關(guān)系的研究;③移植物存活時間短,后續(xù)研究的開展時間受限;④免疫缺陷小鼠存在免疫功能缺陷,影響腹腔液中的細(xì)胞因子,不能應(yīng)用于EMT免疫學(xué)機制的研究;⑤將人的內(nèi)膜組織用于實驗研究不符合倫理要求,限制了此方法的推廣。

    4 小 結(jié)

    成功構(gòu)建EMT動物模型是EMT研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié),而成功的EMT動物模型不僅需要完全復(fù)制EMT的病理特征,還應(yīng)考慮EMT的發(fā)病原因與機制。同時,應(yīng)考慮動物實驗研究的可行性及成本、周期及成功率。因此,應(yīng)根據(jù)研究目的、實驗室條件、經(jīng)濟能力等,結(jié)合不同動物模型的優(yōu)缺點綜合考慮,選擇合適的模型,對EMT的病因及發(fā)病機制進行探討,并發(fā)現(xiàn)EMT低復(fù)發(fā)率及較少不良反應(yīng)的治療手段。自體移植法、經(jīng)血逆流法及藥物誘導(dǎo)法均需使用狒狒等保護動物進行實驗,故較難推廣;種植性動物模型需要人異位內(nèi)膜組織,違反了倫理要求,也不能用于實驗研究;各種手術(shù)移植法存在不同的缺陷,但使用廣泛,且在不斷完善,是未來建立EMT動物模型的主要方法。

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