HIV儲(chǔ)存庫(kù)形成及檢測(cè)方法的研究現(xiàn)狀

王雪，陳曉紅

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院感染科，哈爾濱 150001)

人類免疫缺陷病毒(human immune deficiency virus，HIV)是一種雙鏈RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒，變異非常活躍。HIV-1主要選擇性地侵入人體免疫系統(tǒng)的CD4+T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，拷貝插入宿主細(xì)胞DNA中的HIV形成前病毒，即HIV儲(chǔ)存庫(kù)[1]。感染細(xì)胞以前病毒為模板，通過轉(zhuǎn)錄、剪切、翻譯等借助宿主細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)產(chǎn)生更多HIV顆粒[2]，創(chuàng)造新的感染周期，傳播受感染的細(xì)胞，從而導(dǎo)致HIV的惡性傳播。一般情況下，人體感染HIV后，如果不經(jīng)抗病毒治療，8～10年即可進(jìn)展至艾滋病期，因此早發(fā)現(xiàn)、早治療顯得尤為重要。高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy，HAART)的出現(xiàn)為獲得性免疫缺陷綜合征的治療提供了新途徑，但目前的治療方法并不能徹底清除HIV儲(chǔ)存庫(kù)。因此，研發(fā)可清除宿主細(xì)胞DNA中攜帶整合、可復(fù)制的HIV儲(chǔ)存庫(kù)的策略迫在眉睫。HIV儲(chǔ)存庫(kù)對(duì)HAART和宿主免疫系統(tǒng)的清除具有抗藥性，抗病毒治療一旦停止，就會(huì)導(dǎo)致病毒反彈，引起新一輪的感染[3]。現(xiàn)就HIV儲(chǔ)存庫(kù)形成及檢測(cè)方法的研究現(xiàn)狀予以綜述。

1 HIV儲(chǔ)存庫(kù)的形成

1.1HIV儲(chǔ)存庫(kù)潛伏期的機(jī)制 關(guān)于HIV儲(chǔ)存庫(kù)潛伏期的機(jī)制目前探討最多的為整合前潛伏和整合后潛伏。整合前潛伏是指HIV以雙鏈DNA的形式存在于靜息CD4+T細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)外界抗原進(jìn)入機(jī)體活化靜息CD4+T細(xì)胞時(shí)，HIV就整合進(jìn)入宿主遺傳物質(zhì)開始復(fù)制周期；整合后潛伏是指HIV的雙鏈DNA先整合到宿主遺傳物質(zhì)中，以前病毒的形式維持病毒庫(kù)的穩(wěn)定[4]，其中整合后潛伏占主導(dǎo)要地位。

1.1.1表觀遺傳 表觀遺傳可調(diào)控細(xì)胞染色質(zhì)，HIV DNA的整合位置主要是細(xì)胞染色質(zhì)，因此HIV DNA的表達(dá)受相同表觀遺傳機(jī)制的調(diào)控。有研究證明，當(dāng)DNA甲基化位于啟動(dòng)子時(shí)，可以導(dǎo)致體外潛伏期模型中的HIV原病毒表達(dá)沉默，這也是常見的與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)的表觀遺傳機(jī)制[5]。因此，可通過DNA甲基化維持HIV潛伏期。Hughes等[6]研究發(fā)現(xiàn)，約70%的脊椎動(dòng)物基因啟動(dòng)子與CpG島的DNA元素相關(guān)，而CpG島對(duì)DNA甲基化不敏感。CpG島可以影響染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子的活性，這些調(diào)節(jié)因子可以翻譯后修飾組蛋白并調(diào)節(jié)基因表達(dá)。另一方面，組蛋白乙酰化通常與活躍的轉(zhuǎn)錄相關(guān)[7]。用組蛋白去乙?；敢种苿┣乓志谹治療HIV潛伏感染細(xì)胞，可以激活病毒，表明組蛋白去乙?；诰S持潛伏期中起主要作用[8]。

1.1.2位點(diǎn)選擇 前病毒對(duì)于宿主DNA位點(diǎn)的選擇存在特異性。對(duì)前病毒整合位點(diǎn)的進(jìn)一步分析表明，HIV-1更傾向于主動(dòng)轉(zhuǎn)錄的基因[9]。Singh等[9]對(duì)從培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞中分離的100萬(wàn)個(gè)HIV-1整合位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序分析后發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子和選擇性剪接均有助于整合位點(diǎn)的選擇。事實(shí)上，HIV-1整合酶通過與細(xì)胞剪接相互作用，在選擇整合位點(diǎn)方面起關(guān)鍵作用。HIV-1整合酶可直接與晶狀體上皮源性生長(zhǎng)因子/p75相互作用，通過將整合前復(fù)合體與染色質(zhì)結(jié)合促進(jìn)HIV整合[10]。晶狀體上皮源性生長(zhǎng)因子/p75常與許多剪接因子相互作用，并通過這些剪接因子將HIV-1整合到高度剪接的轉(zhuǎn)錄單元上。由此可見，HIV-1通過選擇主動(dòng)轉(zhuǎn)錄的基因進(jìn)行整合來(lái)避免潛伏期。

1.1.3轉(zhuǎn)錄干擾 整合是HIV復(fù)制中關(guān)鍵且不可逆的環(huán)節(jié)，盡管有抑制性抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療，但HIV在長(zhǎng)壽命細(xì)胞庫(kù)中仍持久存在，即潛在的前病毒常在高表達(dá)基因中整合，表明高表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄可干擾病毒的轉(zhuǎn)錄[11]。Lenasi等[12]研究證明，宿主基因在轉(zhuǎn)錄時(shí)會(huì)抑制整合在基因中的前病毒的表達(dá)。當(dāng)前病毒DNA的極性與宿主基因的極性相同時(shí)，啟動(dòng)子就會(huì)被阻斷，在這種情況下，通過延長(zhǎng)RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄可干擾HIV-1轉(zhuǎn)錄所必需的轉(zhuǎn)錄因子的組裝，而轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的缺乏會(huì)導(dǎo)致HIV-1潛伏期[13]。因此，在病毒潛伏期，HIV-1可以通過抑制上游轉(zhuǎn)錄或協(xié)同激活病毒轉(zhuǎn)錄起始和延伸來(lái)抵消轉(zhuǎn)錄；然而，當(dāng)前病毒DNA與宿主基因具有相反的極性時(shí)，RNA聚合酶Ⅱ可能發(fā)生碰撞，導(dǎo)致病毒轉(zhuǎn)錄提前終止[14]。

1.1.4病毒蛋白與HIV-1再激活 HIV感染細(xì)胞的潛伏期受兩種HIV-1蛋白(即Tat和Vpr)的調(diào)節(jié)。Tat是轉(zhuǎn)錄的反式激活因子，也是編碼于HIV基因組中的一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，受單個(gè)HIV啟動(dòng)子控制。Cao等[15]通過研究HIV感染細(xì)胞的潛伏機(jī)制和反式激活細(xì)胞表型發(fā)現(xiàn)，增加Tat乙?；娠@著增加Tat和病毒的產(chǎn)生，而增加Tat反式激活可更快地反式激活潛伏細(xì)胞。作為病毒反式激活因子的調(diào)節(jié)蛋白，Tat的缺失是HIV-1潛伏期的一個(gè)關(guān)鍵因素[16]。而HIV-1輔助蛋白Vpr則可再一次激活潛伏感染的細(xì)胞。對(duì)HIV-1感染患者進(jìn)行血清學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，患者外周血中Vpr的數(shù)量顯著高于Tat，因此細(xì)胞外Vpr在激活HIV-1潛伏感染細(xì)胞中占據(jù)重要地位[17]。Rev也是一種調(diào)節(jié)蛋白，可結(jié)合HIV的信使RNA，促進(jìn)病毒中信使MRA的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，且需要多個(gè)Rev單體結(jié)合Rev反應(yīng)元件將病毒信使RNA轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，因此Rev表達(dá)水平與功能間的關(guān)系是非線性的[18]；同時(shí)，還需要一定水平的Rev維持病毒蛋白的活性表達(dá)，Rev表達(dá)不足則可能導(dǎo)致HIV-1潛伏期[19]。

1.2HIV儲(chǔ)存庫(kù)的存在部位 HIV DNA儲(chǔ)存庫(kù)存在于外周血的多種細(xì)胞中，主要包括單核細(xì)胞和中心記憶CD4+T細(xì)胞、過渡狀態(tài)的記憶CD4+T細(xì)胞以及效應(yīng)記憶CD4+T細(xì)胞等。

1.2.1淋巴結(jié) 淋巴結(jié)是主要的HIV儲(chǔ)存庫(kù),高水平激活和高水平復(fù)制的特點(diǎn)可以快速誘發(fā)其感染新的細(xì)胞。因此，淋巴結(jié)在HIV儲(chǔ)存庫(kù)的動(dòng)態(tài)變化中起重要作用。Fukazawa等[20]通過研究恒河猴胚胎干細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)，濾泡輔助性CD4+T細(xì)胞多在分化過程中被感染，且不易被特異性免疫反應(yīng)或抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物所獲取?？梢姡馨徒Y(jié)是HIV儲(chǔ)存庫(kù)清除的一個(gè)障礙。Lorenzo-Redondo等[21]研究證實(shí)，在HIV感染者行HAART過程中，淋巴組織中的HIV發(fā)生了變化，表明HIV儲(chǔ)存庫(kù)存在進(jìn)行性復(fù)制。但當(dāng)HAART中斷時(shí)，會(huì)出現(xiàn)許多表達(dá)不同病毒RNA的變異細(xì)胞，有助于HIV的反彈[22]。

1.2.2內(nèi)臟相關(guān)淋巴組織 對(duì)人類和猿類模型的研究顯示，內(nèi)臟相關(guān)淋巴組織包含人體60%的淋巴細(xì)胞，內(nèi)臟相關(guān)淋巴組織通過輔助性T細(xì)胞17耗竭、細(xì)菌易位和局部宿主細(xì)胞激活等方式促進(jìn)HIV復(fù)制，導(dǎo)致HIV在細(xì)胞感染中持續(xù)存在[23-25]。在急性和早期HIV感染期間，胃腸道CD4+T細(xì)胞的HIV DNA載量較血液中CD4+T細(xì)胞的HIV DNA載量平均高13倍[26]。非CD4+T細(xì)胞在腸道中攜帶的HIV DNA較CD4+T細(xì)胞攜帶的HIV DNA少，但內(nèi)臟相關(guān)淋巴組織中非CD4+T細(xì)胞的感染水平高于血液[27]。在內(nèi)臟相關(guān)淋巴組織中，髓細(xì)胞也含有HIV DNA[28]。在HAART啟動(dòng)后，內(nèi)臟相關(guān)淋巴組織中的HIV DNA載量降低但不會(huì)消失[29]，且HIV DNA載量在不同的腸道位置存在差異[30]。在回腸和直腸細(xì)胞中，記憶效應(yīng)CD4+T細(xì)胞中含有的HIV DNA最多[31]。與未接受HAART的患者相比，接受HAART患者直腸中的HIV DNA載量升高[32]?？梢?，內(nèi)臟相關(guān)淋巴組織中的總HIV DNA與感染不同階段血液中的總HIV DNA載量相關(guān)。

1.2.3其他組織 中樞神經(jīng)系統(tǒng)在單核細(xì)胞將感染由外周轉(zhuǎn)移至大腦的過程中具有特殊作用[33]。單核細(xì)胞可遷移到各種組織并分化為抗原呈遞細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等。膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中HIV-1的主要靶點(diǎn)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可以作為HIV儲(chǔ)存庫(kù)發(fā)揮作用[34]。另外，由于血腦屏障的存在，大部分抗病毒藥物難以透過血腦屏障進(jìn)入大腦，因此血腦屏障也成為HIV的天然保護(hù)層，增加了病毒耐藥突變的發(fā)生率[35]；其次，腦內(nèi)潛伏的HIV較少與外周細(xì)胞或組織進(jìn)行遺傳物質(zhì)交換[36]。由于HAART僅可起到局部抑制作用，且目前的抗病毒藥物對(duì)腦內(nèi)的病毒無(wú)效，因此含有HIV DNA的細(xì)胞一直存在[37]。另外，脂肪組織中的記憶CD4+T淋巴細(xì)胞也是一個(gè)潛在、重要的HIV儲(chǔ)存庫(kù)，在未經(jīng)治療的獼猴和接受有效治療的HIV感染者中均檢測(cè)到HIV DNA[38]。未來(lái)，測(cè)量不同組織和液體中的總HIV DNA，有助于評(píng)估針對(duì)清除HIV儲(chǔ)存庫(kù)的治療策略。

1.3HIV DNA在病毒復(fù)制中的主要存在形式 在HIV儲(chǔ)存庫(kù)中，非整合的前病毒占比為10∶1～100∶1，主要包括線性非整合DNA和環(huán)狀非整合DNA[39]。其中，環(huán)狀非整合DNA包括1個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)序列 (long terminal repeat，LTR)和含有2個(gè)LTR的環(huán)狀HIV DNA。線性非整合DNA和環(huán)狀非整合DNA在分子結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、表達(dá)特性以及在潛伏期中的作用等方面均存在差異。線性非整合DNA結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，很容易降解，因此其臨床意義較小[40-41]；2-LTR HIV DNA的結(jié)構(gòu)較特殊，因此與線性非整合HIV DNA相比，2-LTR HIV DNA的臨床意義更大[42]。非整合形式前病毒主要存在于感染細(xì)胞內(nèi)，參與HIV致病機(jī)制的形成。而整合的前病毒大部分因高突變、缺失以及轉(zhuǎn)錄后沉默造成缺陷不能形成病毒復(fù)制，這些缺陷前病毒的作用可能與非整合前病毒作用一致。在HIV持續(xù)復(fù)制中真正起作用的前病毒所占比例較小，非缺陷的整合前病毒是最穩(wěn)定的形式[43]，可導(dǎo)致潛伏性感染或有轉(zhuǎn)錄活性的感染；同時(shí)非缺陷的整合前病毒也是HIV儲(chǔ)存庫(kù)的基本成分，是病毒清除的主要障礙[44]。

2 HIV DNA的檢測(cè)方法及意義

2.1HIV DNA的檢測(cè)方法 HIV儲(chǔ)存庫(kù)的檢測(cè)方法主要包括以細(xì)胞培養(yǎng)為前提的病毒外生測(cè)定法以及基于DNA儲(chǔ)存庫(kù)核酸結(jié)構(gòu)的定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測(cè)法。而關(guān)于DNA儲(chǔ)存庫(kù)的臨床研究主要應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)法。

2.1.1Alu-gag PCR Alu-gag PCR是檢測(cè)感染細(xì)胞中整合前病毒的一種定量分析方法[45]。該方法主要通過兩個(gè)步驟實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)：①用與Alu、gag序列匹配的引物擴(kuò)增gag與最近的Alu之間的區(qū)域[46]；②通過巢式PCR擴(kuò)增識(shí)別第一步驟中特異性擴(kuò)增產(chǎn)物中長(zhǎng)末端重復(fù)序列的R-U5區(qū)域[45]。Alu-gag PCR檢測(cè)精確且靈敏度高，對(duì)整合前病毒的量化十分靈敏。Alu-gag PCR檢測(cè)的弊端在于不能辨別缺陷病毒與非缺陷病毒，導(dǎo)致實(shí)際測(cè)出的HIV儲(chǔ)存庫(kù)遠(yuǎn)高于理論數(shù)值。

2.1.2定量病毒生長(zhǎng)檢測(cè)法(quantitative viral outgrowth assay，Q-VOA) Q-VOA可以檢測(cè)出有復(fù)制能力的前病毒的數(shù)量[45]。傳統(tǒng)的Q-VOA以健康供者的CD4+T淋巴細(xì)胞為目標(biāo)，其病毒復(fù)制率低，且耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、程序復(fù)雜；最新的Q-VOA則以CC趨化因子受體5和CXC趨化因子受體4共受體的人急性淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞/CC趨化因子受體5體外細(xì)胞株為目標(biāo)，其克服了病毒復(fù)制率低、耗時(shí)長(zhǎng)、成本高等缺點(diǎn)[45,47]，因此目前廣泛應(yīng)用于臨床。但最新的Q-VOA也存在弊端：①其僅能檢測(cè)HIV生命周期的一個(gè)組成部分，無(wú)法完整檢測(cè)組織中的病毒庫(kù)，導(dǎo)致實(shí)際測(cè)出的HIV儲(chǔ)存庫(kù)遠(yuǎn)高于理論數(shù)值；②檢測(cè)的血樣本量較小，準(zhǔn)確檢測(cè)的血樣本量應(yīng)>150 mL[45]；③檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)且成本高，患者難以接受。

2.1.3Tat/Rev誘導(dǎo)的限制稀釋法 Tat/Rev誘導(dǎo)的限制稀釋法是一種基于PCR的分析方法，可重復(fù)、敏感地測(cè)量臨床樣本中有效和潛在的感染HIV的CD4+T細(xì)胞的頻率[48]。這些有效和潛在的感染HIV的CD4+T細(xì)胞主動(dòng)產(chǎn)生編碼Tat/Rev蛋白的多重剪接RNA，因?yàn)槎嘀丶艚覴NA在潛在感染細(xì)胞中不存在，但在病毒重新激活后可被誘導(dǎo)[48]。雖然Tat/Rev誘導(dǎo)的限制稀釋法需要較小的血樣量，不需要提取病毒核酸，但仍會(huì)導(dǎo)致實(shí)際測(cè)出的HIV儲(chǔ)存庫(kù)數(shù)量遠(yuǎn)高于理論數(shù)值[45]。

2.2HIV DNA定量檢測(cè)的意義

2.2.1在早期篩查方面的意義 HIV DNA作為HIV儲(chǔ)存庫(kù)標(biāo)志物，其最主要的優(yōu)勢(shì)為窗口期最短，即在感染HIV后3～7 d就可建立HIV儲(chǔ)存庫(kù)，因此將其應(yīng)用于HIV早期篩查可準(zhǔn)確揭示病毒感染程度、患者病情進(jìn)展及臨床分期。在國(guó)內(nèi)，HIV DNA定量檢測(cè)技術(shù)還具有價(jià)格相對(duì)較低且穩(wěn)定性高等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)需要的血液量少、所受干擾少、特異性高，因此可用于嬰幼兒HIV感染的診斷。HIV DNA可以在血液和其他體液中被檢測(cè)到，HIV DNA定量檢測(cè)技術(shù)是組織活檢標(biāo)本中應(yīng)用最廣泛的量化HIV儲(chǔ)存庫(kù)的方法[49]。在大多數(shù)情況下，血清學(xué)檢測(cè)在區(qū)分 18個(gè)月以下嬰兒HIV抗體來(lái)源方面缺乏足夠的敏感性和特異性，因此HIV DNA檢測(cè)有助于確認(rèn)特異性抗體產(chǎn)生不足時(shí)的HIV感染[50]。采集嬰兒血樣標(biāo)本時(shí)應(yīng)注意：①要具備小嬰兒靜脈穿刺所需的專業(yè)知識(shí)；②在2～25 ℃下運(yùn)輸和儲(chǔ)存血樣標(biāo)本；③在獲得血樣后4 d內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

2.2.2在病情預(yù)測(cè)方面的意義 HIV DNA定量檢測(cè)具有簡(jiǎn)單、標(biāo)準(zhǔn)化、靈敏和可重復(fù)的特點(diǎn)。在臨床上，HIV DNA載量可以反映HIV感染的過程，特別是，HIV DNA是獲得性免疫缺陷綜合征進(jìn)展和死亡的預(yù)測(cè)因子，獨(dú)立于HIV RNA和CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)之外?；€總HIV DNA載量可預(yù)測(cè)HAART，HIV DNA載量在HAART期間降低但仍可量化，其水平既可反映感染史(HIV RNA峰值、CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)的最低點(diǎn))，也可反映療效(殘余病毒血癥、累積病毒血癥、免疫恢復(fù)、免疫細(xì)胞活化)[51]。血液中總的HIV DNA載量還可預(yù)測(cè)某些HIV-1相關(guān)終末器官疾病的存在和嚴(yán)重程度。雖然HIV DNA不能區(qū)分復(fù)制能力強(qiáng)的和有缺陷的潛伏病毒，但血液、組織和細(xì)胞中的總HIV DNA載量可從某種程度上反映HIV的發(fā)病機(jī)制，這可能由于所有的病毒形式均參與了宿主細(xì)胞的激活和HIV的發(fā)病過程。HIV DNA是獲得性免疫缺陷綜合征進(jìn)展和死亡的預(yù)測(cè)因子，HIV DNA載量高的患者病程進(jìn)展快、免疫功能差、并發(fā)癥嚴(yán)重且合并感染及病死率均更高[51]。

3 小 結(jié)

雖然經(jīng)HAART后HIV感染者的壽命延長(zhǎng)，但長(zhǎng)期服藥的依從性不良、耐藥性、不能徹底根除HIV仍是HIV感染者潛在的致命威脅。徹底治愈HIV感染者，HIV儲(chǔ)存庫(kù)仍是研究重點(diǎn)。首先應(yīng)明確HIV潛伏感染的機(jī)制，找到準(zhǔn)確且敏感的測(cè)量方法以量化HIV儲(chǔ)存庫(kù)的大小。雖然研究者嘗試多種方法清除體內(nèi)整合的HIV，且取得了一定進(jìn)展，但要應(yīng)用于臨床還需更深入的研究。HIV DNA作為HIV儲(chǔ)存庫(kù)的標(biāo)志物具有臨床相關(guān)性，可在臨床實(shí)踐中廣泛應(yīng)用。將HIV DNA用于監(jiān)測(cè)HAART的效果，或許可為減少或清除HIV策略的研究提供新思路。