中藥材鑒定運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)的實(shí)踐探尋

謝 薇

中藥為我國中醫(yī)學(xué)必需的治療方法，在保健、養(yǎng)生、治療疾病等方面起到不可替代的作用。分子鑒定技術(shù)逐漸成為中藥鑒定的主要鑒定方法，是通過直接分析遺傳物質(zhì)的多態(tài)性以推斷物種內(nèi)遺傳變異情況，以實(shí)現(xiàn)藥材鑒定的方法[1]。本文對分子標(biāo)記技術(shù)分析和總結(jié)了該方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并闡述了分子鑒定技術(shù)未來發(fā)展方向。

1 分子標(biāo)記技術(shù)的分類

分子鑒定技術(shù)分為：以mDNA為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)、基于傳統(tǒng)Southern印跡雜交技術(shù)的分子標(biāo)記、以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)、以重復(fù)序列為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)、DNA序列分析、DNA條形碼技術(shù)[2]。

1.1 以RP-PCR為基礎(chǔ)的標(biāo)記技術(shù)以RP-PCR為基礎(chǔ)具有操作簡便、敏感性高、特異性強(qiáng)、高通量等優(yōu)點(diǎn)，其主要引用在遺傳多樣性分析和對中藥材快速鑒定中，存在的缺點(diǎn)為無法避免基因組DNA、定量準(zhǔn)確性弱、并且鑒定的誤差較大[3]。

1.2 Southern雜交技術(shù)的標(biāo)記技術(shù)主要為RFLP、單鏈多態(tài)性RFLP、變性梯度凝膠電泳-RFLP技術(shù)等，具有標(biāo)記數(shù)目無限、大部分標(biāo)記具有明顯性、任何生育期可進(jìn)行預(yù)測、不受到外部環(huán)境的影響且存在高度的變異性，多用于中藥的多樣性分析和品種鑒定分析，存在缺點(diǎn)為準(zhǔn)確性較差、容易產(chǎn)生假現(xiàn)象[4]。

1.3 以重復(fù)序列為基礎(chǔ)的標(biāo)記技術(shù)主要有DNA重復(fù)序列應(yīng)用于ISSR技術(shù)，為DNA微基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，其原理為用錨定的DNA為引物，在PCR反應(yīng)中可是錨定引物引起特定位點(diǎn)退火錨定引物互補(bǔ)和不太重復(fù)序列的DNA片段，開展PCR擴(kuò)增，可擴(kuò)增為多個(gè)條通過聚丙烯酞胺凝膠電泳進(jìn)行分辨，以發(fā)生顯性反應(yīng)[5]。

1.4 以mDNA為基礎(chǔ)的標(biāo)記技術(shù)主要為逆轉(zhuǎn)錄PCR、差異顯示、差異顯示逆轉(zhuǎn)錄PCR、特征性差異明顯，其中RT-PCR技術(shù)比較廣泛，是PCR廣泛應(yīng)用的變形形式[6]。一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄為相互補(bǔ)充的DNA，并通過PCR模板進(jìn)行DNA擴(kuò)增。

1.5 DNA條形碼技術(shù)的標(biāo)記技術(shù)主要優(yōu)點(diǎn)為不受形態(tài)特征和生物個(gè)體發(fā)育的限制、檢測樣本的范圍較廣，檢測具有高效、準(zhǔn)確、實(shí)現(xiàn)自動化和標(biāo)準(zhǔn)化的優(yōu)勢。主要應(yīng)用于品種鑒定、指紋圖譜構(gòu)建、遺傳育種及多樣性分析方面的鑒別[7]。該種鑒別方法的缺點(diǎn)為不能對藥材具有的DNA差異進(jìn)行烙印。

2 分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用

分子鑒定技術(shù)在中藥鑒定中主要表現(xiàn)為多基原鑒定、遺傳多樣性、正品替代品鑒定、真?zhèn)舞b定、產(chǎn)地鑒定及年限鑒別等。

2.1 多基原鑒定應(yīng)用分子鑒定技術(shù)鑒定中藥基原的研究，貝母、黃芩、太子參、枇杷通過ISSR技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性鑒定，溪黃草可通過RAPD技術(shù)進(jìn)行鑒定[8]。相關(guān)研究通過比較商品沉香、白木香、人工誘導(dǎo)沉香為材料，將醇溶性浸出物、顯微、形狀等進(jìn)行鑒別，通過基因測序進(jìn)行序列側(cè)列，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建最大簡約樹和鄰接樹。商品沉香、人工沉香醇溶性浸出物提高10%，另可通過《中華人民共和國藥典》中顯微鑒別的規(guī)定進(jìn)行[9]。沉香種內(nèi)遺傳存在距離，中間也存在距離。人工沉香、白木香、商品沉香均為發(fā)育樹上的一支，在鑒別理化性質(zhì)和浸出物基礎(chǔ)上，再通過ITS2條形碼序列可準(zhǔn)確鑒定基原物，為沉香鑒定分子生物學(xué)的研究提供依據(jù)。

2.2 遺傳多樣性鑒定有研究通過ISSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒別48份不同生態(tài)環(huán)境的絞股藍(lán)材料，探索其親緣關(guān)系和遺傳多樣性，結(jié)果顯示在15條擴(kuò)增條帶中，存在多態(tài)性明顯引物和穩(wěn)定性，共增加DNA擴(kuò)增位點(diǎn)200余個(gè)。說明絞股藍(lán)遺傳多樣性較高，種質(zhì)間的親緣關(guān)系、生態(tài)環(huán)境、地理分布完全不一樣。

2.3 正品和替代品鑒定中藥材正品為《中華人民共和國藥典》收載的，替代品為與正品有親緣關(guān)系且藥效相似的但未收錄到《中華人民共和國藥典》中。分子鑒定技術(shù)可將正品和替代品進(jìn)行鑒別和區(qū)分，研究采用ISSR、SRAP、SC0T分子標(biāo)記等分子鑒定技術(shù)對冬蟲夏草和替代品進(jìn)行鑒定，對所有菌株進(jìn)行有效區(qū)分且為總體狀況相同，可作為冬蟲夏草種內(nèi)、株內(nèi)鑒定的方法[10]。也有研究顯示通過對獨(dú)活樣本的ITS序列測序和擴(kuò)張，將樣本分為4大類，ITS序列具有堿基片段，可通過ITS序列鑒定物種，能夠?yàn)楠?dú)活的分類和鑒定提供有利證據(jù)。另外，通過ITS序列鑒別四帶芹類可作為獨(dú)活的首選替代品，牛尾獨(dú)活次之，九眼獨(dú)活可作為藥用上品。

2.4 真?zhèn)舞b定中藥材的真?zhèn)舞b別多采用纖維鑒定方法，對鑒定人的專業(yè)水平有較高的要求，科學(xué)依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，如采用化學(xué)計(jì)量法鑒別不但費(fèi)時(shí)還浪費(fèi)時(shí)間[11]。近些年來相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，通過分子鑒定技術(shù)鑒定中藥材真?zhèn)蔚臏?zhǔn)確性較高，并且比較省時(shí)省力。常用于中藥材烏梢蛇、重樓、西洋參、三七、人參、紫蘇的真?zhèn)舞b別。有研究以新疆藁本、遼藁本及藁本混偽品白芷、當(dāng)歸、石防風(fēng)為鑒定材料，通過提取樣本的DNA進(jìn)行序列擴(kuò)增，進(jìn)行雙向測序可進(jìn)行多序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)的發(fā)育樹，能夠鑒別新疆藁本和遼藁本的混偽品?；靷纹凡牧霞爱?dāng)歸的序列測序，可對其基因序列進(jìn)行分析比對，通過計(jì)算材料間的距離構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。且測定trnL-F序列順序，發(fā)現(xiàn)混偽品材料的堿基具有明顯差異，并且可特異鑒別A堿基重復(fù)區(qū)域?；靷纹烽g存在距離，通過trnL-Fxu序列對發(fā)育樹進(jìn)行重建并將混偽品和真品進(jìn)行區(qū)分[12]。通過rpoC1序列比對無法找到混偽品和當(dāng)歸的差異位點(diǎn)。另外，進(jìn)化樹也無法找到差異，說明通過rpoC1序列鑒別效果不佳，而可通過trnL-Fxu序列以堅(jiān)定混偽品的分子鑒定方法。研究當(dāng)歸的混偽品通過基因組多態(tài)性分析，從重復(fù)系列引物進(jìn)行篩選出多態(tài)性好、穩(wěn)定性高的引物并對其進(jìn)行擴(kuò)增，已獲得更多基因組引物?？蓪BC848引物組正品和混偽品分開鑒別，根據(jù)重復(fù)序列技術(shù)分析找到混偽品和當(dāng)歸的特異鑒別引物。通過SNP分子標(biāo)記重新建立的PCR體系能夠?qū)崿F(xiàn)人參品種大馬牙的鑒別分析，具有特異性條帶，確實(shí)因大馬牙特異性擴(kuò)增得到擴(kuò)張。建立多重PCR系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)大馬牙的鑒定，作為大馬牙品種鑒定的有效技術(shù)手段。

2.5 產(chǎn)地鑒別中藥產(chǎn)地繁多，其中以道地藥材為質(zhì)量最佳，對于中藥材的產(chǎn)地鑒別特別重要。近些年隨著中藥現(xiàn)代鑒別技術(shù)對中藥產(chǎn)地進(jìn)行鑒別研究。研究顯示通過ISSE技術(shù)對丹參不同產(chǎn)地的樣本進(jìn)行鑒別[13]，也有通過DNA分析標(biāo)記技術(shù)聯(lián)合高效液相色譜對金銀花不同產(chǎn)地樣本進(jìn)行鑒別，利用分子ISSR-PCR分子標(biāo)記對菘藍(lán)不同產(chǎn)地進(jìn)行鑒別。有研究顯示利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對甘肅省不同產(chǎn)地的當(dāng)歸樣本進(jìn)行分析，通過軟件分析基因多樣性指數(shù)和遺傳信息，群間基因分?jǐn)?shù)距離變化范圍較大[14]。說明栽培當(dāng)歸在甘肅地區(qū)遺傳多樣性較高，群間的遺傳多樣性明顯高于群內(nèi)，居群間遺傳分化程度較高，但無基本基因交流情況。

2.6 年限鑒別研究顯示通過提取人參細(xì)胞中的端粒長度和端粒酶活性能夠通過DNA鑒別人參生長年限，通過染色體片段分析人參端粒平均長度，端粒長度可隨著年限的延長而延長，在此基礎(chǔ)上可通過端粒長度數(shù)據(jù)鑒別人參的生長年限。對不同生長年限、不同產(chǎn)地、不同品種的人參樣品經(jīng)過提取RNA采用PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的序列，從多份人參樣本中獲得符合測序要求的PCR產(chǎn)物，并與人參DS基因比對，建立PCR測序發(fā)掘人參基因的SNP序列，具有操作簡單、特異性[15]。分子標(biāo)記技術(shù)可作為人參和相關(guān)藥材產(chǎn)品質(zhì)量評價(jià)遺傳的工具。另有研究對水杉不同部位和不同年限的DNA進(jìn)行提取，并進(jìn)行序列擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示經(jīng)改良后的水杉DNA片段提取法，能夠保存DNA片段擴(kuò)增，在選擇DNA提取樣本中，邊材比心材更適合，水杉木材DNA具有篩選分析、遺傳距離、序列特征分析，以進(jìn)行系列物種鑒別。

3 存在問題

中藥分子鑒定技術(shù)被廣泛應(yīng)用在各個(gè)領(lǐng)域，但隨著分子鑒定技術(shù)的發(fā)展也遇到了需要解決的問題。通過分子遺傳標(biāo)記技術(shù)對道地藥材鑒定存在局限性，表現(xiàn)在自身技術(shù)缺陷，基因的真實(shí)性和DNA的同源性，分子標(biāo)記結(jié)果的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性；另外研究對象也存在一定問題，不是所有的道地藥材會有DNA印跡，道地性和DNA差異不存在直接關(guān)聯(lián)。隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，技術(shù)缺陷問題已經(jīng)得到解決，第2個(gè)問題仍然困擾著中藥分子鑒定領(lǐng)域的專家學(xué)者。

4 小結(jié)

中藥材的品種繁多，來源較復(fù)雜，且產(chǎn)地較多，相近的中藥極易造成混淆，甚至出現(xiàn)中藥用藥部位不同但療效相似的偽品和仿品充當(dāng)真品。鑒定方法不完善會導(dǎo)致用藥不安全事件發(fā)生，對中藥臨床療效帶來影響?！吨腥A人民共和國藥典》已經(jīng)收錄了部分中藥材的分子生物學(xué)鑒定方法，說明分子鑒定的時(shí)代已經(jīng)到來。雖然分子鑒定技術(shù)還需要進(jìn)一步發(fā)展，但隨著廣大研究者的不懈努力和技術(shù)進(jìn)步，分子鑒定技術(shù)一定能夠成為中藥鑒定的主要方法，為中醫(yī)藥走向國際提供技術(shù)保障。