• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    ORFV誘導(dǎo)HaCaT細胞CK1等分子mRNA轉(zhuǎn)錄波動

    2021-12-01 00:42:42劉圓圓張帆于永忠
    關(guān)鍵詞:角蛋白角質(zhì)病毒感染

    劉圓圓,張帆,于永忠

    (黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,大慶 163319)

    羊口瘡病毒(orf virus,ORFV)是痘病毒科副痘病毒屬的代表成員[1],其基因組為兩端閉合的雙鏈DNA,大小約為138 kb,主要由兩端反向重復(fù)序列(inverted terminal reapt,ITR)[2]和中央核心區(qū)(central core region,CCR)組成[3]。病毒基因組共編碼134個基因,其中中央核心區(qū)編碼100個左右的基因能夠維持遺傳穩(wěn)定性,主要負責病毒的復(fù)制與裝配;而兩側(cè)反向重復(fù)序列呈共價閉合的發(fā)夾結(jié)構(gòu),主要包含一些與病毒毒力因子強弱有關(guān)和致病機理有關(guān)的基因,但兩側(cè)反向重復(fù)序列的基因常常有突變的情況發(fā)生,進而呈現(xiàn)出種屬間差異顯著的現(xiàn)象,不僅如此該區(qū)域在感染性宿主時還發(fā)揮著免疫調(diào)控作用。盡管ORFV感染只是在宿主口唇等部位形成局部上皮病變,但極易造成宿主嚴重的持續(xù)性感染以及繼發(fā)性感染[4-5]。在臨床學(xué)上,ORFV主要引起羊傳染性膿皰皮炎俗稱羊口瘡(Orf),即在患病羊只的口唇等部位皮膚或黏膜上皮形成增生性病變,以丘疹、膿皰、潰瘍和炎癥滲出以及桑葚狀厚結(jié)痂為主要特點[6-7]。羊口瘡常群發(fā)于開放性牧場,尤其是羔羊和免疫力低下的羊群中,雖然單純病毒感染的成年動物的死亡率在5%以下,但由于其它病原微生物的繼發(fā)感染或混合感染,往往致使病畜的死亡率會達到30%[8],在一些防疫欠佳的牧場偶爾也會因爆發(fā)羊口瘡而會造成嚴重的經(jīng)濟損失,因此,該病在國內(nèi)外養(yǎng)羊國家受到普遍重視,在我國也被列為三類動物疫病。值得關(guān)注的是,羊口瘡也是一種人獸共患病[9],常引起與患病動物密切接觸人群如農(nóng)場主或屠宰場工人和獸醫(yī)的體表關(guān)節(jié)部位形成丘疹膿皰,也有少部分人群會在口鼻處產(chǎn)生一些典型的臨床癥狀,針對羊口瘡疫情的防控和ORFV感染機制的研究成為全球研究的熱點。

    角質(zhì)細胞又稱為表皮細胞是一種主要由角質(zhì)形成細胞組成的動態(tài)組織,也可以說是由四層鱗狀分層上皮細胞組成的,分別為基底層、棘層、顆粒層和角質(zhì)層,增殖只發(fā)生在與基底膜相鄰的基底層,而表皮細胞的分化及向表面移動都經(jīng)過棘層、顆粒層和角質(zhì)層,且分化往往伴隨著特異性標記物的(如中間絲形成蛋白、細胞角蛋白和橋粒鈣粘著蛋白家族、橋粒芯蛋白)表達量變化。經(jīng)研究證明角質(zhì)形成細胞都需經(jīng)歷從基底層向基底上層移動的一個嚴格控制的分化程序,而角質(zhì)形成細胞的增殖、分化和復(fù)制衰老之間的平衡對于防止表皮的病理改變起到重要作用。

    細胞角蛋白(cytokeratin,CKs)是上皮細胞特征性標記物,在人表皮中是由Ⅰ型酸性和Ⅱ型堿性-中性角蛋白多肽雜聚物形成的一個大的蛋白質(zhì)家族,根據(jù)細胞角蛋白的分子質(zhì)量的不同將其分為20種,而細胞角蛋白表達含量的檢測往往有助于鑒別皮膚不同的上皮性結(jié)構(gòu),也作為鑒別診斷腫瘤的方法之一,其在角化分層鱗狀上皮的基底層則會過量表達CK5(Ⅱ型)/CK14(Ⅰ型)[10],最上面的表皮層(在棘層和顆粒層的上部)差異化的角化細胞表達CK2[11],兩者中間的則是隨著基底層細胞會向上移動分化的棘層和顆粒層,往往會抑制CK5/CK14的表達取而代之的是表達細胞角蛋白1和10〔CK1(Ⅱ型)/CK10(Ⅰ型)〕[12-13],與細胞角蛋白結(jié)合的蛋白如外聚蛋白,可以共同形成細胞內(nèi)角蛋白網(wǎng)絡(luò)用來提供抵抗機械應(yīng)力[14]。

    研究表明,人類永生化表皮細胞系(HaCaT)是自發(fā)轉(zhuǎn)化的細胞系,有良好的表皮分化能力,且無致癌性,作為模式細胞目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于相關(guān)領(lǐng)域的研究[15-18]。研究利用ORFV-HaCaT感染模型,通過RT-PCR等方法監(jiān)測病毒感染對細胞CK1/CK10等Marker分子的實時影響,為闡明ORFV感染引起宿主黏膜上皮增生與分化的誘因,以及未來抗病毒藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    羊口瘡病毒(ORFV)OV-HLJ/05株,由實驗室分離于黑龍江省大慶市某私營牧場,保存于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命技術(shù)學(xué)院細胞生物學(xué)與分子病毒試驗室;人類永生化表皮細胞(HaCaT),由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院韓英浩老師惠贈,凍存于實驗室。

    1.2 細胞傳代培養(yǎng)與處理

    HaCaT細胞從液氮中取出,于37℃水浴鍋中復(fù)蘇后,置于添加了10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基中,放入含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當培養(yǎng)細胞長至培養(yǎng)皿底部60%~70%融合度時通過細胞計數(shù)進行傳代、凍存。試驗使用病毒感染處理一定時間,然后收集細胞,裂解、提取RNA,進行后續(xù)試驗。

    1.3 TCID50檢測

    取1×105個HaCaT細胞種植于96孔板內(nèi),將ORFV病毒液用細胞培養(yǎng)液進行10倍系列稀釋至10-1~10-9接種于96孔板內(nèi)細胞,每個稀釋度接種8孔,每孔100μL病毒稀釋液(設(shè)有未接毒的細胞對照),置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中,每天觀察細胞狀態(tài)。待細胞孔出現(xiàn)50%CPE,運用Reed-Muench算法來計算毒株的TCID50。其中距離比例=(高于50%的百分數(shù)-50%)/(高于50%的百分數(shù)-低于50%的百分數(shù));LgTCID50=距離比例×稀釋度對數(shù)之間的差+高于50%的病變率的稀釋度的對數(shù)。

    1.4 細胞活性和細胞死亡率的檢測

    將細胞傳代至96孔板中,設(shè)置試驗組、對照組和空白組。當傳代細胞數(shù)量達到可鋪滿每孔底部60%~70%時,進行細胞接毒處理,然后在病毒感染不同時間段內(nèi),按每孔液體總體積的10%加入2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽(CCK-8),再避光移入CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min,然后移至多功能酶標儀上讀取數(shù)值,測定分析細胞活力。

    1.5 qRT-PCR分析

    采用100μL TCID50病毒感染細胞后,于不同時間段收集細胞,進行細胞計數(shù),用mRNA快速提取試劑盒(Solarbio,China)提取總RNA,然后用Novodrop 2000測定提取RNA的濃度,并依據(jù)PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa,China)說明進行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA(根據(jù)基因參考序列設(shè)計的特異性引物列于表1中)。使用熒光染料法(NovoStart SYBR qPCR Super Mix Plus,Novoprotein)試劑盒處理得到的cDNA,移入Bio-Rad CFX96的qRT-PCR系統(tǒng)進行RT-PCR檢測。擴增條件為:95℃,作用時間1 min,40個循環(huán);95℃,主要是20 s;60℃,作用1 min和72℃,作用30 s。數(shù)據(jù)分析采用2-△△CT方法,將所有試驗組目的基因中的mRNA歸一化到內(nèi)參GAPDH標準。整個過程均使用DEPC水處理過的材料及用具,防止RNA降解。

    表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequence for qRT-PCR

    1.6 統(tǒng)計與分析

    試驗中,每個試驗均設(shè)置三組平行試驗,每組平行試驗又均設(shè)有三個重復(fù)孔。反復(fù)確定得到的所有數(shù)據(jù)均以平均值±SD表示,對于兩組以上顯著性差異的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA test),而其他數(shù)據(jù)比較采用GraphPad Prism軟件中非配對t檢驗,其中P<0.05視為顯著(*);P<0.01視為極顯著(**)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 TCID50檢測病毒毒價

    OV-HLJ05株ORFV分離株來源于東北地區(qū)一起羊傳染性膿皰病暴發(fā)疫情,收集患病動物口唇部的丘疹結(jié)痂,研磨搗碎提取病毒粒子,在用Madin-Darby牛腎細胞(MDBK)進行幾輪細胞擴繁病毒后,用蔗糖梯度超速離心法純化成熟的病毒粒子,接著按照實驗室病毒TCID50操作規(guī)程,驗證了ORFV的TCID50(如表2所示)。采用Reed-Muench法計算距離比例為0.5,LogTCID50等于-7.5,則得出TCID50數(shù)值為10-7.5,即試驗中所使用的ORFV的TCID50為10-7.5·0.1 mL-1,將所有病毒儲存于HaCaT細胞中,滴定保存于-80℃以供進一步使用。

    表2 ORFV的TCID50效價Table 2 The TCID50 of ORFV

    2.2 ORFV影響HaCaT細胞增殖

    通過CCK-8檢測HaCaT細胞存活率結(jié)果如圖1所示,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ORFV在一定程度上能夠影響細胞的增殖,尤其是在病毒感染24 h后,能較明顯的抑制細胞增殖。但除了凋亡壞死的細胞,病毒對細胞增殖影響具體機制仍需進一步探究,除此之外ORFV是否可以促進細胞分化,需要通過細胞角蛋白(CKs)變化情況加以分析。

    2.3 ORFV感染HaCaT細胞后引起的角蛋白變化

    根據(jù)圖1結(jié)果顯示的ORFV對HaCaT細胞增殖的影響情況,研究采用ORFV-HaCaT體外感染模型進一步研究了病毒感染后對HaCaT細胞角蛋白表達的影響。如圖2所示,采用RT-PCR方法檢測了HaCaT細胞中各個分化階段表達的標志物及CKs的mRNA水平變化。結(jié)果顯示,在ORFV感染細胞整個過程中,細胞內(nèi)標志物都呈不同的變化趨勢。其中,橋粒芯糖蛋白3(DSG3)作為棘層中細胞間的橋粒,在病毒感染后細胞間橋粒表達量少于對照組,則表明病毒感染減少了細胞間連接,影響細胞增殖;而Ki67是一種存在于除表皮層外的各個角質(zhì)細胞中的核蛋白,可以作為一個細胞增殖的標記物,且Ki67在細胞增殖的各期(G1、S、G2和M)中均有表達,但在細胞靜止期G0期幾乎不表達。由此,可以從基因水平上證明病毒感染細胞后影響細胞增殖。此外,表皮層表達的CK2沒有異常變化。值得關(guān)注的是,基底層表達的CK5/CK14;棘層和顆粒層表達CK1/CK10在病毒感染時變化較為顯著。尤其是棘層、顆粒層表達的CK1與CK10,這對角蛋白的變化趨勢較對照組最為明顯。整體變化呈正向波動影響了細胞正常分化的趨勢,所有檢測分析結(jié)果均列于圖2中。

    圖1 ORFV感染6~66 h內(nèi)對細胞增殖的影響Fig.1 Effect of ORFV infection on cell proliferation within 6-66 h

    圖2 ORFV感染HaCaT細胞不同時間段內(nèi)CKs變化情況Fig.2 Changes in CKs of HaCaT cells infected by ORFV at different time periods

    3 討論

    ORFV是一種人畜共患病毒,臨床上可造成人或動物表皮增生、角質(zhì)化不全或角質(zhì)化過度、角化細胞變性以及炎癥浸潤反應(yīng)等皮膚病變。此外,ORFV還可以反復(fù)感染宿主,宿主再次感染后盡管病變部位面積縮小,恢復(fù)時間縮短,但受到感染的動物仍然存在繼發(fā)和混合感染的風險。在病理學(xué)方面研究表明,ORFV主要感染宿主皮膚的角質(zhì)形成細胞即棘層細胞,因為如果角質(zhì)細胞過度增生、分化,會導(dǎo)致病畜飲食功能障礙,久病難愈。由此,病毒與宿主細胞互作,特別是病毒感染影響細胞增殖、分化的特異性標記物的變化趨勢,是目前國內(nèi)外學(xué)者熱衷于研究的焦點。2019年,Muhsen等[19]采用3D體外感染模型研究ORFV對角質(zhì)形成細胞的CKs和loricrin進行了研究。據(jù)報道,ORFV在上皮組織模型中,會促使CK1和CK10分子的減少,并以此表明角質(zhì)細胞的去分化的趨勢。

    在分子機制方面具體研究顯示,CK1表達變化通常反映了角質(zhì)細胞系基底細胞的狀態(tài)[20],而CK10消長也常通過受控于蛋白激酶B(PKB,也稱為Akt)和非典型的PKC通路,從而影響細胞增殖[21],故角質(zhì)形成細胞的進一步分化(從棘層到顆粒層)往往伴隨著CK1抑制及CK10的轉(zhuǎn)錄表達[22]。因此,CK1與CK10是角質(zhì)細胞增殖分化的首要標志(Marker)分子[23]。在ORFV感染中,上皮組織因細胞病變(cytopathic effect,CPE)而過度角質(zhì)化形成桑葚狀結(jié)痂樣的病灶,期間血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)也促進了上皮細胞增生[24]。盡管這樣,還是懷疑ORFV對這些CKs的影響并不單純,尤其是感染初期階段,與宿主細胞對于CKs的競爭細節(jié),可能會讓我們更為客觀地描述ORFV侵染細胞行為,從而可以進一步探索病毒與細胞相互作用的分子機制。

    試驗中結(jié)果顯示了CK1與CK10受病毒影響表達水平產(chǎn)生了波動,反映出病毒與細胞間競爭的動態(tài)關(guān)系。此現(xiàn)象可能由于病毒與宿主細胞之間相互作用非常復(fù)雜,所以在一個不確定性因素較多的系統(tǒng)中得出的結(jié)論可能不具有統(tǒng)計學(xué)意義。而在相對獨立的體系中,許多類似的研究對于客觀評價數(shù)據(jù)的可靠性還是可取的。而人體永生化表皮細胞系(HaCaT)經(jīng)常被用作角質(zhì)形成細胞功能的研究模型,也為體外研究角質(zhì)形成細胞的生長與分化之間轉(zhuǎn)換提供了一個合適的研究平臺。研究首先利用ORFVHaCaT感染模型,通過CCK-8方法檢測了病毒感染6~66 h期間細胞的存活率與細胞活性。結(jié)果顯示在病毒存在的18 h和60 h區(qū)間內(nèi)細胞活性受到較大影響(如圖1所示)。此結(jié)果或許驗證了病毒復(fù)制和裝配等行為干擾了細胞正常的生理和代謝,同時也存在細胞啟動凋亡這種程序性死亡的機制以抑制病毒復(fù)制的可能性,但具體的調(diào)節(jié)機制還需進一步研究。

    除了研究病毒對細胞增殖的影響,又進一步采用RT-PCR的方法監(jiān)測病毒感染對細胞CK1/CK10等Marker分子的實時影響,以闡明ORFV感染引起宿主黏膜上皮細胞增生與分化的趨勢。此前曾有文獻報道,橋粒芯糖蛋白3(DSG3)分子作為肺及皮膚等器官的自身免疫性疾?。ㄌ彀挴彛┮环N主要的特異性抗原,一旦基因沉默會導(dǎo)致HaCaT細胞黏附缺陷和細胞增殖能力銳減[25]。而Ki67分子作為細胞增殖的主要標志物,能夠示蹤G和S期細胞增殖情況,可通過檢測Ki67表達水平來輔證細胞增殖情況[26]。試驗運用了RT-PCR檢測DSG3及Ki67的mRNA表達水平,證明ORFV感染HaCaT細胞后一定時間內(nèi)可影響細胞的增殖。除此以外,我們又檢測了其他細胞形態(tài)相關(guān)的CKs,諸如CK2等,但CK2在ORFV感染過程中變化趨勢不明顯。曾有研究表明,CK1和CK10作為棘層細胞分化的標志物,在HaCaT細胞中卻能表現(xiàn)出從無染色到強染色的異質(zhì)性染色形式,即HaCaT細胞可以同時表達CK1和CK10兩種分子,或者CK1和CK10其中之一,或者CK1和CK10都不表達。而在角蛋白表達上,HaCaT細胞也存在異質(zhì)性,即具有基底細胞和棘層細胞的雙重特質(zhì)[27]。試驗正是考慮到該細胞具有的這種雙重特性,著重闡述了ORFV感染HaCaT細胞后在不同時段的CKs的表達量變化,在6 h試驗組中CK5/CK14的轉(zhuǎn)錄水平就高于對照組;而在6~24 h,試驗組中CK1/CK10的轉(zhuǎn)錄水平也高于對照組。由此,推測病毒感染細胞后會影響細胞增殖或者促進細胞異常分化。而且,在6~24 h使得細胞停留在棘層細胞分化狀態(tài)的同時病毒感染細胞也有分化至表皮層的趨勢。盡管如此,病毒對于細胞的上述影響及其內(nèi)部的分子機制,需要從病毒對細胞分子信號通路的影響研究方面得到進一步證實。目前,通過文獻查找與研究發(fā)現(xiàn)有4個主要的細胞信號通路,可能受到ORFV不同程度的干預(yù),從而造成試驗中細胞CKs的異?,F(xiàn)象。這些通路包括PI3K/Akt通路[28]、MAPK(Raf/MEK/ErK、JNK和p38)通路[29]、Wnt/β-catenin通路[30]和Hippo通路[31]等。當然,也不排除病毒同時干預(yù)IP3-Ca2+和DAGPKC雙信號通路[32],以及各個信號通路之間交互作用可能性,總之還需進一步通過加入信號通路抑制劑來探究病毒感染細胞后,可能調(diào)控的信號通路影響細胞分化的分子機制。

    4 結(jié)論

    試驗主要通過CCK-8法檢測病毒對細胞活性以及存活率的影響,結(jié)果顯示在病毒感染24 h后能明顯影響細胞的增殖情況,除此之外又通過qRTPCR方法在mRNA轉(zhuǎn)錄水平,檢測了ORFV感染HaCaT細胞后在不同時間段對DSG3、Ki67及CKs等分子表達變化的影響,結(jié)果表明,病毒感染可以使CK1/CK10等分子表達產(chǎn)生波動,影響了細胞分化趨勢,之后將進一步探索對細胞增殖與分化的具體影響以及相應(yīng)的分子機制研究??傊?,研究為了解病毒與宿主細胞間“互作”奠定了基礎(chǔ),也為抗羊口瘡病毒感染的深入研究提供了參考。

    猜你喜歡
    角蛋白角質(zhì)病毒感染
    預(yù)防諾如病毒感染
    中老年保健(2022年1期)2022-08-17 06:14:30
    重組角蛋白單體外源表達、純化及鑒定
    豬細小病毒感染的防治
    豬瘟病毒感染的診治
    兔毛角蛋白的制備及其在防曬化妝品中的應(yīng)用
    紫外線A輻射對人角質(zhì)形成細胞的損傷作用
    角蛋白材料在生物領(lǐng)域中的應(yīng)用
    大科技(2016年29期)2016-07-14 08:52:43
    骨角質(zhì)文物保護研究進展
    角質(zhì)形成細胞和黑素細胞體外共培養(yǎng)體系的建立
    窄譜中波紫外線對角質(zhì)形成細胞角蛋白17 表達的影響
    三级经典国产精品| 国产成人91sexporn| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲天堂av无毛| 五月伊人婷婷丁香| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲熟女精品中文字幕| 日韩伦理黄色片| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 又大又黄又爽视频免费| 男女下面进入的视频免费午夜| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 丰满人妻一区二区三区视频av| av免费在线看不卡| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 夫妻午夜视频| 偷拍熟女少妇极品色| 免费大片18禁| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 一个人观看的视频www高清免费观看| 大片免费播放器 马上看| 久久6这里有精品| 老司机影院成人| 国产 一区 欧美 日韩| 伦理电影大哥的女人| 欧美日韩视频精品一区| 久久97久久精品| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲在久久综合| 日日啪夜夜撸| 免费大片18禁| 亚洲国产成人一精品久久久| h日本视频在线播放| 亚洲精品日韩av片在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 国产淫片久久久久久久久| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日本色播在线视频| 午夜福利视频精品| 欧美成人精品欧美一级黄| 欧美日本视频| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲最大成人av| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 国产探花极品一区二区| 精品国产三级普通话版| 美女内射精品一级片tv| 国产色爽女视频免费观看| 九九在线视频观看精品| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲精品影视一区二区三区av| 中文字幕免费在线视频6| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产一区二区三区av在线| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产中年淑女户外野战色| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 欧美另类一区| 国产男女内射视频| 99久国产av精品国产电影| 观看免费一级毛片| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲最大成人av| 国产视频内射| 97超碰精品成人国产| 国产免费一级a男人的天堂| av国产免费在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产 精品1| av线在线观看网站| 看黄色毛片网站| 色网站视频免费| 日韩欧美精品v在线| 黑人高潮一二区| 免费观看性生交大片5| 乱系列少妇在线播放| 伊人久久国产一区二区| 人人妻人人看人人澡| h日本视频在线播放| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 美女国产视频在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲国产最新在线播放| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 精品少妇黑人巨大在线播放| 大话2 男鬼变身卡| 搡女人真爽免费视频火全软件| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 午夜老司机福利剧场| 免费看av在线观看网站| 免费人成在线观看视频色| h日本视频在线播放| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲av福利一区| 91精品伊人久久大香线蕉| 99热6这里只有精品| 久久久a久久爽久久v久久| 十八禁网站网址无遮挡 | 亚洲天堂国产精品一区在线| 在线精品无人区一区二区三 | 日韩伦理黄色片| 久久久精品欧美日韩精品| 大香蕉97超碰在线| 欧美高清性xxxxhd video| 在线播放无遮挡| 国产免费一级a男人的天堂| 日韩制服骚丝袜av| 久久99热这里只频精品6学生| 熟女人妻精品中文字幕| 国产大屁股一区二区在线视频| 内射极品少妇av片p| 日韩人妻高清精品专区| 我的女老师完整版在线观看| 69人妻影院| 麻豆成人午夜福利视频| 丝瓜视频免费看黄片| 在线播放无遮挡| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产伦精品一区二区三区视频9| 青春草亚洲视频在线观看| 下体分泌物呈黄色| av在线app专区| 黄色配什么色好看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 在线观看三级黄色| 国产免费一区二区三区四区乱码| 如何舔出高潮| 亚洲性久久影院| 中文字幕av成人在线电影| 五月玫瑰六月丁香| 一个人观看的视频www高清免费观看| 一级黄片播放器| 日韩视频在线欧美| 99精国产麻豆久久婷婷| 男女下面进入的视频免费午夜| 欧美一区二区亚洲| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲国产精品国产精品| 大香蕉久久网| 国产精品无大码| 亚洲精品国产成人久久av| 老司机影院成人| 老女人水多毛片| 久久久久久久久久人人人人人人| av国产免费在线观看| 成人漫画全彩无遮挡| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲在线观看片| 99视频精品全部免费 在线| 26uuu在线亚洲综合色| 国产综合精华液| 少妇 在线观看| av专区在线播放| 日本黄大片高清| av免费在线看不卡| 成人无遮挡网站| 高清毛片免费看| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲自拍偷在线| 在线观看国产h片| 乱系列少妇在线播放| 男女无遮挡免费网站观看| 天堂中文最新版在线下载 | 人妻少妇偷人精品九色| 丝袜喷水一区| 成人亚洲欧美一区二区av| 欧美bdsm另类| av在线播放精品| 嘟嘟电影网在线观看| 人妻一区二区av| 日日啪夜夜撸| 精品一区在线观看国产| 亚洲成人久久爱视频| 免费人成在线观看视频色| 三级国产精品欧美在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 精品人妻熟女av久视频| 久久久a久久爽久久v久久| 成人亚洲欧美一区二区av| 99久久精品热视频| 91久久精品国产一区二区成人| 日韩一区二区三区影片| 日韩欧美一区视频在线观看 | 99热全是精品| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲精品aⅴ在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 国产精品嫩草影院av在线观看| av在线老鸭窝| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产成人91sexporn| 成人无遮挡网站| videos熟女内射| 亚洲成人av在线免费| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲精品影视一区二区三区av| 欧美成人午夜免费资源| .国产精品久久| 免费av毛片视频| 国产在视频线精品| av在线老鸭窝| 身体一侧抽搐| 2018国产大陆天天弄谢| 成年人午夜在线观看视频| 精品一区二区三卡| av在线蜜桃| 精品久久久久久久久av| 丝袜脚勾引网站| 可以在线观看毛片的网站| 交换朋友夫妻互换小说| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 男人爽女人下面视频在线观看| 男人添女人高潮全过程视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久久久精品94久久精品| 99热全是精品| 伦精品一区二区三区| 久久国产乱子免费精品| av国产精品久久久久影院| 99热这里只有精品一区| 亚洲成色77777| 日日撸夜夜添| 国产亚洲精品久久久com| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 日韩一区二区视频免费看| 日韩一本色道免费dvd| 嫩草影院精品99| 女人被狂操c到高潮| 亚洲欧美日韩东京热| 久久精品国产自在天天线| 精品久久久久久久末码| 中文在线观看免费www的网站| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲av福利一区| 国产美女午夜福利| 熟女av电影| 街头女战士在线观看网站| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲精品一区蜜桃| 免费观看av网站的网址| 久久人人爽人人爽人人片va| 熟女人妻精品中文字幕| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 免费高清在线观看视频在线观看| 在线观看国产h片| 热re99久久精品国产66热6| 国产成人一区二区在线| eeuss影院久久| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 男女那种视频在线观看| 国产免费福利视频在线观看| 国产精品三级大全| 人妻系列 视频| 亚洲欧美日韩东京热| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 秋霞在线观看毛片| 日韩av不卡免费在线播放| 97热精品久久久久久| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲精品国产色婷婷电影| tube8黄色片| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲第一区二区三区不卡| 久久6这里有精品| 亚洲精品一二三| 国产一区亚洲一区在线观看| 观看免费一级毛片| 在线观看一区二区三区| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲熟女精品中文字幕| 超碰97精品在线观看| av网站免费在线观看视频| 精品久久久精品久久久| 免费大片黄手机在线观看| 成人特级av手机在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲av中文av极速乱| 日韩亚洲欧美综合| 黄色日韩在线| 最近中文字幕高清免费大全6| 另类亚洲欧美激情| 国产av不卡久久| 国产乱人偷精品视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 女人被狂操c到高潮| 亚洲精品亚洲一区二区| 狂野欧美激情性bbbbbb| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久久久久精品性色| 边亲边吃奶的免费视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产老妇女一区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | av国产久精品久网站免费入址| 日本熟妇午夜| 日韩成人av中文字幕在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 国产亚洲91精品色在线| 在线观看一区二区三区激情| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲国产av新网站| 国产乱人偷精品视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 成年av动漫网址| 欧美日韩视频精品一区| 青春草国产在线视频| 国产爱豆传媒在线观看| 简卡轻食公司| 中文字幕av成人在线电影| 在现免费观看毛片| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲电影在线观看av| 欧美成人a在线观看| 岛国毛片在线播放| 91精品伊人久久大香线蕉| 久久久久国产网址| 色播亚洲综合网| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲国产欧美在线一区| 国产高清三级在线| 亚州av有码| 久久久a久久爽久久v久久| 日本色播在线视频| 国产成人a∨麻豆精品| 99久久精品一区二区三区| 日韩精品有码人妻一区| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看 | 人妻 亚洲 视频| 只有这里有精品99| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲精品成人久久久久久| 在线免费十八禁| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 一级黄片播放器| 大陆偷拍与自拍| 一级二级三级毛片免费看| 亚洲美女搞黄在线观看| 边亲边吃奶的免费视频| av卡一久久| 看黄色毛片网站| 七月丁香在线播放| 成人二区视频| 在线观看av片永久免费下载| 久久午夜福利片| 亚洲国产精品999| 国产精品一及| 秋霞在线观看毛片| 国产一区二区三区综合在线观看 | 麻豆久久精品国产亚洲av| 观看美女的网站| 国产高清三级在线| av国产免费在线观看| 在线免费十八禁| 亚洲av二区三区四区| 97在线视频观看| 日日啪夜夜爽| 久久99精品国语久久久| 插阴视频在线观看视频| 亚洲国产精品999| 午夜激情久久久久久久| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 久久久久久九九精品二区国产| av国产久精品久网站免费入址| 国产伦在线观看视频一区| 777米奇影视久久| 九九爱精品视频在线观看| 只有这里有精品99| 欧美成人精品欧美一级黄| eeuss影院久久| 少妇人妻精品综合一区二区| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | av网站免费在线观看视频| 久久久色成人| 日韩人妻高清精品专区| 麻豆乱淫一区二区| 欧美日韩视频精品一区| 高清毛片免费看| 美女国产视频在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 欧美另类一区| 在线精品无人区一区二区三 | 亚洲美女搞黄在线观看| 中国三级夫妇交换| 日韩一区二区视频免费看| 激情五月婷婷亚洲| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲色图综合在线观看| 老司机影院毛片| 亚洲精品国产av成人精品| 天堂中文最新版在线下载 | 国产av码专区亚洲av| 2021少妇久久久久久久久久久| 成人毛片60女人毛片免费| 黄色视频在线播放观看不卡| 街头女战士在线观看网站| 特大巨黑吊av在线直播| 七月丁香在线播放| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产综合懂色| 欧美国产精品一级二级三级 | 成年女人在线观看亚洲视频 | 波野结衣二区三区在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日韩欧美 国产精品| 一级黄片播放器| 男的添女的下面高潮视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 欧美区成人在线视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲国产精品专区欧美| 欧美成人精品欧美一级黄| 久久99精品国语久久久| 丝袜脚勾引网站| 日本-黄色视频高清免费观看| 在线观看免费高清a一片| 欧美+日韩+精品| 欧美国产精品一级二级三级 | av卡一久久| 国产探花极品一区二区| 偷拍熟女少妇极品色| 久久久欧美国产精品| 午夜激情久久久久久久| 最近最新中文字幕大全电影3| 99久久精品热视频| 成人一区二区视频在线观看| 青青草视频在线视频观看| 岛国毛片在线播放| 大香蕉97超碰在线| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 如何舔出高潮| 亚州av有码| 看黄色毛片网站| 91在线精品国自产拍蜜月| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产淫片久久久久久久久| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲天堂av无毛| 又爽又黄a免费视频| 亚洲国产精品专区欧美| 久久精品国产a三级三级三级| 精品国产乱码久久久久久小说| 女人被狂操c到高潮| av网站免费在线观看视频| 舔av片在线| 免费人成在线观看视频色| 欧美另类一区| 久热这里只有精品99| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 久久综合国产亚洲精品| h日本视频在线播放| 毛片女人毛片| av在线观看视频网站免费| 午夜精品国产一区二区电影 | 久热久热在线精品观看| 99热网站在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看 | 日韩强制内射视频| 女人久久www免费人成看片| 美女cb高潮喷水在线观看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产一级毛片在线| 日韩大片免费观看网站| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 日本黄大片高清| 青春草国产在线视频| 精品国产三级普通话版| 国产淫语在线视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 亚洲成人av在线免费| 精品人妻熟女av久视频| 午夜免费观看性视频| 观看美女的网站| 人体艺术视频欧美日本| 久久久久性生活片| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 欧美潮喷喷水| 免费观看无遮挡的男女| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产成人a区在线观看| 欧美另类一区| 波野结衣二区三区在线| 欧美xxxx性猛交bbbb| 日韩伦理黄色片| 欧美97在线视频| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲国产高清在线一区二区三| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 搡女人真爽免费视频火全软件| 成年女人在线观看亚洲视频 | 身体一侧抽搐| 国产精品久久久久久久久免| 欧美精品国产亚洲| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产精品熟女久久久久浪| 国产真实伦视频高清在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 插逼视频在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产精品99久久久久久久久| 男男h啪啪无遮挡| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产成人福利小说| 成人免费观看视频高清| 欧美xxxx性猛交bbbb| 少妇人妻 视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲高清免费不卡视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 熟妇人妻不卡中文字幕| 男女国产视频网站| 最近中文字幕2019免费版| 三级国产精品片| 日日撸夜夜添| 伦精品一区二区三区| 大香蕉97超碰在线| 欧美日韩精品成人综合77777| 精品一区二区三卡| 日日摸夜夜添夜夜爱| 中文字幕av成人在线电影| 国产亚洲一区二区精品| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲图色成人| 久久久久久伊人网av| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲欧洲日产国产| 尾随美女入室| 久久6这里有精品| av天堂中文字幕网| 国产乱来视频区| 七月丁香在线播放| 亚洲在久久综合| 亚洲国产精品成人久久小说| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产免费一区二区三区四区乱码| 免费看a级黄色片| 在线观看一区二区三区激情| 国精品久久久久久国模美| 在线观看av片永久免费下载| 97在线人人人人妻| 免费大片18禁| 国内精品美女久久久久久| 日本黄色片子视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 在线观看一区二区三区激情| 欧美另类一区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 久久精品久久久久久久性| 日本wwww免费看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 舔av片在线| 日本黄大片高清| 内地一区二区视频在线| 国产高清国产精品国产三级 | 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产欧美亚洲国产| 99热6这里只有精品| 爱豆传媒免费全集在线观看| 黄色配什么色好看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚州av有码| 国产精品.久久久| 国产乱来视频区| 欧美精品国产亚洲| 亚洲av二区三区四区| 欧美丝袜亚洲另类| 在线观看三级黄色| 亚洲成色77777| 婷婷色av中文字幕| 久久精品综合一区二区三区| 成人亚洲欧美一区二区av| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲国产欧美人成| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 成人亚洲精品av一区二区| 激情五月婷婷亚洲| 永久网站在线| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 国产av国产精品国产| 午夜福利在线在线| 夜夜爽夜夜爽视频|