苦參堿對TGF-β1誘導的人腹膜間皮細胞成纖維細胞生長因子2的調(diào)控作用

段秀萍　何赟　梁靖梅　李福記　廖蘊華

[關(guān)鍵詞] 苦參堿;成纖維細胞生長因子2;人腹膜間皮細胞;上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化;TGF-β1

[中圖分類號] R563? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）18-0015-04

Regulation effect of matrine on fibroblast growth factor 2 induced by TGF-β1 in human peritoneal mesothelial cells

DUAN Xiuping? ?HE Yun? ?LIANG Jingmei? ?LI Fuji? ?LIAO Yunhua

Department of Nephrology， the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， Nanning? ?530021， China

[Abstract] Objective To investigate the regulatory effect of matrine on fibroblast growth factor 2 （FGF-2） during epithelial mesenchymal transition （EMT） of peritoneal mesenchymal cells. Methods Human peritoneal mesothelial cells were divided into three groups according to different treatment methods （the control group， the TGF-β1 stimulation group and the TGF-β1+0.8 mg/mL matrine treatment group）. The complete medium containing 5 ng/mL TGF-β1 was used in the TGF-β1 stimulation group， and the complete medium containing 5 ng/mL TGF-β1 and 0.8 mg/mL matrine was used in the treatment group. The control group was completely cultured with the same amount， and after 48 h of intervention treatment， the mRNA expression level of FGF-2 was analyzed by mRNA-seq. Finally， the mRNA and protein expression levels of FGF-2 in human peritoneal mesothelial cells were detected by relative real-time fluorescence quantitative PCR and western blot. Results It was found that 5 ng/mL of TGF-β1 could up-regulate the expression levels of FGF-2 mRNA and protein when stimulating human peritoneal mesothelial cells （6.18 times mRNA and 2.00 times protein）. After matrine intervention， the mRNA and protein expression levels of TGF-β1-induced FGF-2 gene were significantly down-regulated （mRNA and protein were down-regulated by 4.30 times and 1.77 times respectively）. Conclusion By inhibiting fibroblast growth factor 2， matrine prevents fibroblast from accumulating in peritoneal membrane， and finally prevents the occurrence of peritoneal fibrosis.

[Key words] Matrine; Fibroblast growth factor 2; Human peritoneal mesothelial cells;Epithelial-mesenchymal transition; TGF-β1

腹膜透析是尿毒癥患者的主要替代治療手段之一[1]，其經(jīng)濟方便，可居家進行，此外，還可以保護殘存的腎功能且對血流動力學影響小，目前廣泛應用于臨床[2]。近年來腹膜透析人數(shù)不斷增長，然而透析最主要的并發(fā)癥是腹膜纖維化，會導致腹膜透析的失敗。目前缺乏有效防止腹膜纖維化發(fā)生的藥物;此外，腹膜纖維化發(fā)生的分子病理機制尚不明確，但有研究表明，TGF-β1作為纖維化的一個關(guān)鍵因子[3]，在腹膜纖維化中也起著重要的作用。在活體實驗中，構(gòu)建含TGF-β1的腺病毒并將其注射到動物中，結(jié)果顯示其能誘導動物發(fā)生腹膜纖維化，且纖維化與透析相關(guān)性腹膜纖維化相類似[4]。

成纖維細胞生長因子2（Fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF-2）是一種成纖維細胞生長因子，參與多種細胞的增生和分化。在哺乳動物中存在18種FGF，根據(jù)其序列的同源性和產(chǎn)生的不同分為6個亞族，其中FGF-2為第一亞族，目前研究比較廣泛的也是FGF-2，其可誘導內(nèi)皮細胞和成纖維細胞等細胞增殖;除此之外，其還是一種趨化因子，其對星形膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞等有趨化作用[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-2與腎臟和肺臟等多種器官纖維化密切相關(guān)[6-8]。

1 材料與方法

1.1 材料來源

實驗使用的人腹膜間皮細胞（Human peritoneal mesothelial cells，HPMCs）、苦參堿和FGF-2單克隆抗體分別購于廣州吉賽科技有限公司、北京博奧拓達科技有限公司和abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)? 按細胞培養(yǎng)方法復蘇HPMCs細胞，待細胞長至80%～90%后傳代細胞，傳代細胞待其狀態(tài)良好后，消化細胞并將其接種到6孔板，待其長至70%左右開始干預實驗。根據(jù)實驗的不同處理方法將HPMCs細胞分為三組（對照組、TGF-β1刺激組及0.8 mg/mL苦參堿+TGF-β1處理組），具體方法如下：對照組采用等量的完全培養(yǎng)基，TGF-β1刺激組采用5 ng/mL的TGF-β1處理細胞，0.8 mg/mL苦參堿+TGF-β1處理組采用5 ng/mL的TGF-β1刺激細胞并同時給予0.8 mg/mL苦參堿干預處理細胞。

1.2.2 蛋白免疫印跡和實時熒光定量PCR? ①蛋白免疫印跡：根據(jù)實驗的不同處理方法對HPMCs細胞處理48 h后，提取HPMCs細胞的總蛋白，BCA試劑盒測定提取蛋白的濃度，加入上樣緩沖液并煮沸使蛋白變性后，配置分離膠和濃縮膠，上樣后用小電壓壓平，然后加大電壓于聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離蛋白，根據(jù)Marker切膠并將膠上蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，使用抗原封閉液封閉抗原1 h后，加入一抗，在4℃的冰箱孵育過夜，吸出一抗，PBST溶液洗滌3次，加入二抗于抗體孵育盒中孵育1 h，最后加入曝光液，在成像系統(tǒng)中拍照獲取蛋白條帶。②實時熒光定量PCR：根據(jù)實驗的不同處理方法對HPMCs細胞處理48 h后，PBS洗滌細胞2次后，使用天根生化科技有限公司的RNA抽提試劑盒，按照說明書提取HPMCs細胞總RNA，檢測其純度與濃度，使用Takara公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取好的RNA逆轉(zhuǎn)錄為單鏈DNA（即cDNA），再以cDNA作為模板，與Takara公司的熒光試劑盒配成20 μL的反應體系，然后在實時熒光定量PCR儀運行反應體系，最后根據(jù)CT值使用公式計算相對mRNA的表達量;RT-PCR過程中使用的引物通過Pubmed數(shù)據(jù)庫中在線設(shè)計軟件進行設(shè)計，獲得引物序列后發(fā)送至公司合成。具體序列見表1。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組分析? mRNA-seq分析人腹膜間皮細胞干預處理48 h后收集細胞，使用干冰將細胞寄往公司進行轉(zhuǎn)錄組測序分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件處理，對對照組、TGF-β1刺激組及TGF-β1+0.8 mg/mL苦參堿處理組的mRNA和蛋白表達水平的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間數(shù)據(jù)比較使用單因素方差進行分析，組間比較使用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序分析FGF-2基因的mRNA表達水平

按照分組（對照組、TGF-β1刺激組及0.8 mg/mL苦參堿+TGF-β1處理組）處理細胞48 h后提取細胞總RNA送公司進行轉(zhuǎn)錄組測序，測序結(jié)果顯示TGF-β1刺激HPMCs細胞后能上調(diào)FGF-2的mRNA表達，而苦參堿干預處理HPMCs細胞后使FGF-2的mRNA表達下調(diào)。見表2。

2.2 實時熒光定量PCR檢測FGF-2的mRNA的表達水平

按照分組（對照組、TGF-β1刺激組及0.8 mg/mL苦參堿+ TGF-β1處理組）處理細胞48 h后，實時熒光定量PCR檢測各組HPMCs細胞FGF-2的mRNA表達情況。結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序分析基本相符，TGF-β1刺激HPMCs細胞后會顯著上調(diào)FGF-2的mRNA表達，給予苦參堿處理后FGF-2的mRNA表達顯著下調(diào)。見表3。

2.3 蛋白免疫印跡檢測FGF-2的蛋白表達水平

根據(jù)實驗的不同處理方法將HPMCs細胞分為三組（對照組、TGF-β1刺激組及0.8 mg/mL苦參堿+TGF-β1處理組），按預設(shè)的實驗方法對各組HPMCs細胞處理，干預后培養(yǎng)48 h，蛋白免疫印跡檢測各組HPMCs細胞FGF-2的蛋白表達情況。結(jié)果顯示，TGF-β1刺激組FGF-2的蛋白表達水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），0.8 mg/mL苦參堿+TGF-β1處理組FGF-2的蛋白表達水平顯著低于對照組，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖1、表4。

3 討論

腹膜纖維化是腹膜透析患者最為嚴重的并發(fā)癥，如何有效防治腹膜纖維化是維持長期腹膜透析的關(guān)鍵。腹膜纖維化發(fā)生的分子病理機制目前尚不明確;但大量研究認為，TGF-β1與腹膜纖維化的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[3，9-11]。Wu等[10]在發(fā)生腹膜纖維化的腹膜組織中檢測到TGF-β1的高表達;Duan等[9]研究顯示，TGF-β1能誘導小鼠腹膜間皮細胞發(fā)生EMT;此外，前期研究數(shù)據(jù)顯示，TGF-β1刺激HPMCs細胞后會使其E-cadherin的mRNA表達下調(diào)，而使其α-SMA的mRNA表達上調(diào)，證實TGF-β1也能誘導HPMCs細胞發(fā)生EMT[12]。根據(jù)以上研究結(jié)果可以推測，TGF-β1在HPMCs細胞EMT及腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化中具有重要的作用。有研究顯示，F(xiàn)GF-2與公認的致纖維化因子TGF-β1具有明顯的正反饋調(diào)節(jié)作用[7]，更為有趣的是，有研究認為TGF-β1作用的發(fā)揮與FGF-2密切相關(guān)[13]。本研究采用TGF-β1誘導HPMCs細胞發(fā)生EMT并通過mRNA-seq分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-2的mRNA表達水平顯著上調(diào);進一步驗證結(jié)果顯示，TGF-β1刺激HPMCs細胞后能顯著上調(diào)FGF-2蛋白的表達水平。FGF-2作為一種成纖維細胞生長因子，近年來許多研究報道了其在腎臟和肺臟等多種器官纖維化中占據(jù)有重要的作用[6-8]，本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)GF-2與HPMCs細胞的EMT和腹膜纖維化有著密不可分的關(guān)系。

此外，本研究結(jié)果還顯示，苦參堿對HPMCs細胞FGF-2蛋白和mRNA的表達水平具有顯著的抑制作用。苦參堿是生物堿的一種，具有鎮(zhèn)痛解熱、調(diào)節(jié)免疫力、抑制細菌生長、抗病毒等功效。相關(guān)研究表明，苦參堿在許多器官纖維化中具有顯著的抗纖維化作用[14-16]。目前，苦參堿在抗人腹膜纖維化作用方面的研究報道相對較少，而本研究結(jié)果提示苦參堿可能通過調(diào)控FGF-2的表達水平，進而抑制腹膜間皮EMT，防止腹膜纖維化的發(fā)生。

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（收稿日期：2021-03-15）