基于CRISPR/Cas9的毛果楊bHLH106轉(zhuǎn)錄因子的功能研究

孫佳彤，國(guó)艷嬌，李 爽，周晨光，姜立泉，李 偉

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，黑龍江 哈爾濱 150040)

木材形成機(jī)制研究一直是林木研究的重點(diǎn)。木材的形成是一個(gè)高度有序且連續(xù)的過(guò)程，包括維管形成層的增殖、木質(zhì)部細(xì)胞的分化擴(kuò)張、次生細(xì)胞壁的沉積增厚、細(xì)胞的程序性死亡[1-2]。次生木質(zhì)部包括纖維細(xì)胞、導(dǎo)管細(xì)胞和射線細(xì)胞[3]。已經(jīng)從模式植物中鑒定出許多參與次生木質(zhì)部發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子，它們形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)用以調(diào)控木材的形成過(guò)程[4-6]。因此，探究轉(zhuǎn)錄因子在木材形成過(guò)程中的作用機(jī)制，可為利用林木分子生物學(xué)手段改良木材性狀，提高木材質(zhì)量提供理論依據(jù)。

bHLH(Basic Helix-Loop-Helix)是一類堿性螺旋-環(huán)-螺旋類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，主要存在于真核生物中，是僅次于MYB的第2大轉(zhuǎn)錄因子家族。在植物中，bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族對(duì)植物的調(diào)控發(fā)育、脅迫響應(yīng)、信號(hào)傳導(dǎo)和次生生長(zhǎng)方面起著重要作用[7-8]。大多數(shù)bHLH蛋白是在模式植物擬南芥中被發(fā)現(xiàn)和鑒定的，其功能包括：參與調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)合成代謝途徑，如植物激素的合成、光信號(hào)傳導(dǎo)[9-10]、光敏信號(hào)的調(diào)節(jié)[11-12]、脫落酸信號(hào)傳導(dǎo)[13]；參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育，如種子的萌發(fā)；調(diào)控植物抗逆脅迫，如低溫脅迫[14]、鹽脅迫[15]等。此外，bHLH基因家族同樣參與木質(zhì)部的生長(zhǎng)發(fā)育，例如一個(gè)非典型的bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素下游的早期木質(zhì)部發(fā)育[16]；棉花 bHLH 蛋白GhFP1正向調(diào)節(jié)纖維細(xì)胞的伸長(zhǎng)[17]；在擬南芥次生細(xì)胞壁的相關(guān)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，識(shí)別到了一些bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控次生細(xì)胞壁的合成[18]；在一項(xiàng)研究中確定一個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子二聚體TMO5/LHW是擬南芥中維管發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[19]，其缺失突變體中維管組織逐漸消失；bHLH轉(zhuǎn)錄因子LHW-T5L1二聚體促進(jìn)木質(zhì)部前體細(xì)胞中關(guān)鍵細(xì)胞分裂素基因的表達(dá)，導(dǎo)致周圍細(xì)胞中細(xì)胞分裂素水平升高，從而促進(jìn)原形成層細(xì)胞的特異性增殖[20]。然而，bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與林木木材形成還鮮見(jiàn)報(bào)道。

基因編輯工具的出現(xiàn)，為基因功能的研究和植物性狀的改良帶來(lái)了很大的幫助[21]。CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)基因編輯技術(shù)在很大程度上提高了基因編輯的效率和實(shí)用性。目前，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)、人類疾病治療、作物基因功能及遺傳育種等領(lǐng)域的研究中[22]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)共包含了兩個(gè)部分：向?qū)NA(sgRNA)和Cas9核酸酶，該系統(tǒng)的主要功能是在特定的基因組位點(diǎn)誘導(dǎo)DNA雙鏈的斷裂[23]。雙鏈斷裂之后非同源末端連接的細(xì)胞修復(fù)可能導(dǎo)致堿基的插入或缺失[24]，從而改變堿基序列。利用CRISPR/Cas9技術(shù)可以對(duì)全基因組的任何一個(gè)基因進(jìn)行基因編輯，可通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性都更高的優(yōu)良品種[25]。例如通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)編輯馬鈴薯R基因得到抗病馬鈴薯品系[26]；以CRISPR 介導(dǎo)CCR的基因編輯技術(shù)獲得了低木質(zhì)素的新楊樹(shù)優(yōu)良品系[27]。自2015年首次將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于楊樹(shù)中以來(lái)[28]，已有許多將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于樹(shù)木的基因功能研究。例如，利用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制毛果楊PtrVCS2基因突變體，通過(guò)對(duì)突變體植株的分析發(fā)現(xiàn)PtrVCS2促進(jìn)形成層向木質(zhì)部分化，使植株提前產(chǎn)生增厚的次生細(xì)胞壁，表明毛果楊PtrVCS2參與木材形成的調(diào)控[29]；利用CRISPR/Cas9技術(shù)得到毛果楊形成層特異表達(dá)的PtrWOX4轉(zhuǎn)錄因子功能缺失突變體，使植株頂端優(yōu)勢(shì)被破壞，頂芽和根部發(fā)育不良，形成層發(fā)育受到顯著影響，木質(zhì)部分化紊亂[30]。

本研究通過(guò)分析東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室姜立泉團(tuán)隊(duì)前期對(duì)野生型(WT)毛果楊莖干不同細(xì)胞類型進(jìn)行的RNA-seq數(shù)據(jù)分析，鑒定出一個(gè)在形成層和次生木質(zhì)部細(xì)胞中較高表達(dá)的PtrbHLH106基因，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)創(chuàng)制了毛果楊PtrbHLH106基因功能缺失突變體。通過(guò)對(duì)突變體的表型觀察及分析，初步揭示該基因在木材形成方面的功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、載體及試劑

實(shí)驗(yàn)材料為東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(本實(shí)驗(yàn)室)保存的毛果楊植株，基因型為Nisqually-1。用次氯酸鈉(NaClO)對(duì)野生型毛果楊側(cè)枝進(jìn)行消毒后，經(jīng)植物組織培養(yǎng)進(jìn)行芽誘導(dǎo)，獲得無(wú)菌毛果楊組培苗。組織培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，光強(qiáng)約40 μmol/(m2· s)，光周期為16 h光照/8 h黑暗。溫室培養(yǎng)條件：溫度范圍22～25 ℃，光強(qiáng)約300 μmol/(m2· s)，光周期為16 h光照/8 h黑暗。溫室種植毛果楊使用135 ℃高溫高壓滅菌30 min后冷卻的土壤。

pENTR載體(pENTR/D-topo)購(gòu)自Life Invitrogen公司；T載體(pMD18-T)購(gòu)自TaKaRa；pUC19-GFP載體為本實(shí)驗(yàn)室保存；pEgP237-2A-GFP由Keishi Osakabe實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。RNA試劑盒(RNease plant Mini Kit)、膠回收試劑盒(GEL Extraction Kit)、PCR純化試劑盒(PCR purification kit)、質(zhì)粒提取試劑盒(Plasmid mini kit)均購(gòu)自QIAGEN公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit)購(gòu)自TAKARA；Pfu 聚合酶(Pfu DNA Polymerase)購(gòu)自Aglient公司；體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(T7 quick high yield RNA synthesis kit)購(gòu)自NEB；甲苯胺藍(lán)染色劑購(gòu)自Sigma；大腸桿菌(Escherichiacoli)TOP10感受態(tài)細(xì)胞、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101感受態(tài)細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 毛果楊PtrbHLH106基因的克隆與分析

根據(jù)PtrbHLH106基因的ID(Potri.006G037100)，在毛果楊基因組網(wǎng)站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下載基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物(表1)。使用RNA提取試劑盒對(duì)毛果楊的分化木質(zhì)部總RNA進(jìn)行提取，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA作為PCR擴(kuò)增模板，對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：10×Pfu Buffer 2 μL、dNTPs 2 μL、cDNA模板1 μL、正反向引物各1 μL、Pfu DNA Polymerase 0.4 μL、去離子水12.6 μL，反應(yīng)體系為20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性45 s，52 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；68 ℃再延伸30 min。PCR擴(kuò)增獲得該基因片段，并連接到pENTR載體上，經(jīng)熱激法大腸桿菌轉(zhuǎn)化后，獲得陽(yáng)性克隆，測(cè)序檢測(cè)PtrbHLH106序列。

表1 所用引物及序列

1.3 毛果楊PtrbHLH106基因gRNA選取及體外切割驗(yàn)證

使用在線工具(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)對(duì)PtrbHLH106進(jìn)行g(shù)RNA的選取，選取gRNA的原則是分?jǐn)?shù)高、脫靶概率低于0.5、GC含量在50%左右，且定位在外顯子上。在挑選好的gRNA序列前加T7啟動(dòng)子(5′-TAATACGACTCACTATAGG-3′)，后加stem-loop(5′-GTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGG-3′)，該序列作為gRNA的體外轉(zhuǎn)錄模板序列，用于gRNA的體外切割驗(yàn)證。

將gRNA體外轉(zhuǎn)錄模板序列經(jīng)PCR反應(yīng)生成雙鏈DNA。PCR反應(yīng)體系為：T7-bHLH106-stem-loop (0.5 μmol/L) 2 μL、BS6 (0.5 μmol/L) 2 μL、T25 (10 μmol/L) 5 μL、BS7 (10 μmol/L) 5 μL、dNTP Mix 1 μL、10×PCR Buffer 5 μL、rTaq1 μL、去離子水29 μL，共50 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s，59 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，45個(gè)循環(huán)；72 ℃，30 s。

PtrbHLH106基因gRNA的體外轉(zhuǎn)錄：利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)gRNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為：NTP Buffer Mix 7.5 μL、Nuclease-free water 3 μL、Template DNA 8 μL、T7 RNA Polymerase 1.5 μL，共20 μL。置于37 ℃恒溫水浴鍋中4 h。

模板載體的構(gòu)建及模板質(zhì)粒線性化：依據(jù)毛果楊網(wǎng)站提供的PtrbHLH106基因全基因組的序列信息及pUC19-35S-GFP載體上所含有的酶切位點(diǎn)，在gRNA前后共1 kb位置設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的特異性引物(表1)。PCR模板為野生型的全基因組DNA，PCR擴(kuò)增后對(duì)目標(biāo)片段的膠回收產(chǎn)物和pUC19-35S-GFP質(zhì)粒分別同時(shí)進(jìn)行BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物利用熱激法轉(zhuǎn)化到TOP10大腸桿菌中，篩選陽(yáng)性單克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序正確的單克隆進(jìn)行質(zhì)粒的提取，使用PstⅠ進(jìn)行模板質(zhì)粒pUC19-PtrbHLH106的線性化，酶切產(chǎn)物純化后獲得線性化的體外切割模板DNA。

體外檢測(cè)gRNA切割結(jié)果：檢測(cè)體系為Cas9蛋白(1 mg/mL，本實(shí)驗(yàn)室前期純化獲得) 2 μL、gRNA 2 μL、線性化的DNA模板12 μL、Phosphate buffer (pH 7.5) 0.8 μL、DTT 0.02 μL、MgCl21 μL、PBS 2.18 μL。置于37 ℃恒溫水浴鍋1 h，1 h后迅速放入液氮中，隨后用PCR純化試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物純化，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并觀察結(jié)果。

1.4 CRISPR基因編輯載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)經(jīng)體外驗(yàn)證的gRNA引物(表1)，對(duì)gRNA進(jìn)行引物復(fù)性。反應(yīng)體系為：10×EX-TaqBuffer 2 μL、gRNA-F 9 μL、gRNA-R 9 μL，共20 μL。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃ 30 s；72 ℃ 2 min；37 ℃ 2 min；25 ℃ 2 min。PCR產(chǎn)物稀釋100倍待用。載體pEgP237-2A-GFP經(jīng)BsaⅠ單酶切，與PtrbHLH106的gRNA用T4 DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物利用熱激法轉(zhuǎn)化到TOP10大腸桿菌中，篩選陽(yáng)性單克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，隨后將陽(yáng)性質(zhì)粒pEgP237-U6-PtrbHLH106gRNA-35S-Cas9轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌中，用于毛果楊的遺傳轉(zhuǎn)化。

1.5 毛果楊遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

毛果楊遺傳轉(zhuǎn)化采用已建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[31-32]，選擇生長(zhǎng)30 d左右的健康毛果楊無(wú)菌組培苗，株高10～12 cm，切下第2～3節(jié)莖段，用農(nóng)桿菌侵染20 min后放置暗處共培養(yǎng)48 h;暗培養(yǎng)結(jié)束后，用含有250 mg/L頭孢霉素的無(wú)菌水浸泡清洗莖段，隨后移至含有25 mg/L卡那霉素和250 mg/L頭孢霉素的選擇培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25～30 d后，將抗性芽移至含有20 mg/L卡那霉素和125 mg/L頭孢霉素的抗性芽生根培養(yǎng)基中。待植株生根后，剪下轉(zhuǎn)基因植株的葉片并提取全基因組DNA，用pEgP237-2A-GFP上的F端引物M13F(表1)和PtrbHLH106基因gRNA的R端引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。

1.6 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)trbHLH106基因編輯情況鑒定

參照毛果楊DNA序列，在包含gRNA位點(diǎn)的上下游共500 bp處設(shè)計(jì)引物，以轉(zhuǎn)基因植株DNA為擴(kuò)增模板，擴(kuò)增目的片段DNA，加A尾后連接到T載體上，用熱激法轉(zhuǎn)化到TOP10大腸桿菌中，每個(gè)植株挑取30個(gè)陽(yáng)性單克隆進(jìn)行測(cè)序，與野生型序列進(jìn)行比對(duì)。

1.7 毛果楊表型分析及莖的橫切面解剖觀察

分別在ptrbhlh106突變體和野生型毛果楊生長(zhǎng)60、90和120 d時(shí)對(duì)其進(jìn)行株高、地徑測(cè)量，每個(gè)基因型取3株，重復(fù)3次測(cè)量。在ptrbhlh106突變體和野生型毛果楊生長(zhǎng)120 d時(shí)，分別取第2、4、6、8、10莖節(jié)制作石蠟切片，利用甲苯胺藍(lán)對(duì)切片進(jìn)行染色，在M8數(shù)字掃描顯微成像系統(tǒng)(Precipoint)下觀察橫切面細(xì)胞形態(tài)。

1.8 測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

測(cè)序服務(wù)及全部引物的合成均由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司完成(www.comatebio.com)。

利用SPSS軟件中的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法對(duì)各生長(zhǎng)指標(biāo)及細(xì)胞數(shù)進(jìn)行差異顯著性分析，當(dāng)P< 0.05時(shí)，表示差異顯著，當(dāng)P< 0.01時(shí)差異極顯著。用SigmaPlot 10.0軟件進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PtrbHLH106基因的獲得

研究團(tuán)隊(duì)前期通過(guò)激光顯微切割技術(shù)(laser capture microdissection, LCM)，分別精確收集了毛果楊野生型植株第8莖節(jié)的形成層、木質(zhì)部和韌皮部細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行RNA-seq數(shù)據(jù)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PtrbHLH106基因主要在形成層和木質(zhì)部細(xì)胞中表達(dá)(圖1)，因此推測(cè)PtrbHLH106可能在形成層和木質(zhì)部發(fā)育中發(fā)揮一定的調(diào)控作用。通過(guò)對(duì)PtrbHLH106的克隆及測(cè)序，獲得723 bp的CDS序列。

標(biāo)準(zhǔn)化FPKM值即轉(zhuǎn)錄本豐度標(biāo)準(zhǔn)化為每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的片段數(shù)，誤差線代表3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)誤。Normalized FPKM indicates normalized transcript abundances as fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments.Error bars represent SE values of three independent experiments.圖1 毛果楊PtrbHLH106基因在不同組織細(xì)胞類型中的表達(dá)Fig.1 The transcript abundance of PtrbHLH106 in different cell types in Populus trichocarpa

2.2 毛果楊PtrbHLH106基因突變體的創(chuàng)制

為了進(jìn)一步研究PtrbHLH106在木材形成過(guò)程中的功能，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制了毛果楊PtrbHLH106基因功能缺失突變體。在突變體創(chuàng)制前，利用體外切割技術(shù)對(duì)選取的gRNA進(jìn)行了驗(yàn)證，以便確定gRNA的可用性。

2.2.1 gRNA的體外驗(yàn)證

通過(guò)gRNA網(wǎng)站預(yù)測(cè)，選取1條分?jǐn)?shù)高、脫靶概率低、GC含量在50%左右的PtrbHLH106外顯子上gRNA，切割的模板示意圖如圖2A所示，gRNA位于線性化DNA模板的-952 bp處。經(jīng)過(guò)體外切割，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2B所示，在不加入gRNA或Cas9蛋白時(shí)，裝有PtrbHLH106基因片段的模板DNA均未被切斷(第1和2號(hào)泳道)，在加入gRNA、Cas9蛋白和模板DNA后，DNA被有效切成2段，電泳條帶在約4.5 kb和0.9 kb處(第3泳道)，與理論長(zhǎng)度相符。該結(jié)果說(shuō)明，選用的gRNA序列可有效結(jié)合Cas9蛋白，并對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

A. 模板DNA示意圖schematic diagram of template DNA；B. 凝膠電泳結(jié)果the electrophoresis results(M. DNA marker DL10 000; 1、2. 對(duì)照組negative control; 3. 檢測(cè)樣品sample)。圖2 gRNA體外驗(yàn)證Fig.2 The cleavage assay in vitro of gRNA

2.2.2 毛果楊遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株鑒定

構(gòu)建CRISPR載體pEgP237-U6-PtrbHLH106gRNA-35S-Cas9，通過(guò)農(nóng)桿菌侵染、抗性愈傷組織出芽、抗性芽在卡那霉素培養(yǎng)基上兩次生根篩選過(guò)程(圖3A—3C)，獲得3株抗性生根植株。提取待鑒定的抗性植株葉片基因組DNA，使用載體引物M13-F和PtrbHLH106的gRNA-R端引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定結(jié)果如圖3D所示，兩個(gè)陰性對(duì)照(第1和3泳道)均未擴(kuò)增出片段條帶，而抗性植株(第4～6泳道)均擴(kuò)增出與陽(yáng)性對(duì)照(第2泳道)相同大小的條帶，說(shuō)明PtrbHLH106重組質(zhì)粒已經(jīng)成功整合到毛果楊基因組中。

A. 愈傷組織分化誘導(dǎo)callus induction；B. 抗性芽誘導(dǎo)shoot induction；C. 抗性植株篩選screaning of the resistant plants；D. 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定the PCR detection results(M. DNA marker DL 2000。 1. ddH2O為模板的陰性對(duì)照negative control with ddH2O as PCR template; 2. pEgP237-U6-PtrbHLH106 gRNA-35S-Cas9質(zhì)粒為模板的陽(yáng)性對(duì)照positive control with plasmid pEgP237-U6-PtrbHLH106 gRNA-35S-Cas9 as PCR template; 3. 野生型毛果楊葉片DNA為模板的陰性對(duì)照negative control with leaf DNA of wild-type plant as PCR template; 4～6. 抗性植株葉片DNA為模板的樣品sample with leaf DNA of kanamycin-resistant plant as PCR template)。圖3 毛果楊轉(zhuǎn)基因植株的獲得Fig.3 Generation of Populus trichocarpa transgenic plants

2.2.3PtrbHLH106基因編輯情況分析

對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的PtrbHLH106基因靶位點(diǎn)的編輯情況進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果如圖4A所示：3個(gè)株系的突變體gRNA處均插入或缺失不同數(shù)量的堿基，如ptrbhlh106-1的兩條等位基因分別插入1個(gè)堿基和缺失2個(gè)堿基，ptrbhlh106-2的兩條等位基因分別插入1個(gè)堿基和缺失3個(gè)堿基，ptrbhlh106-3的兩條等位基因分別插入1個(gè)堿基和缺失16個(gè)堿基。3個(gè)突變體植株均為雙等位突變。編輯PtrbHLH106基因后的蛋白翻譯情況如圖4B，部分堿基的插入和缺失后，導(dǎo)致翻譯提前終止，產(chǎn)生的氨基酸序列遠(yuǎn)短于正常的PtrbHLH106，ptrbhlh106-2的1條等位基因缺失了1個(gè)氨基酸同時(shí)造成1個(gè)氨基酸的改變，其他基因序列的翻譯序列均未包含bHLH家族的典型HLH結(jié)構(gòu)域[18]。該結(jié)果表明，已成功獲得毛果楊ptrbhlh106突變體。為驗(yàn)證PtrbHLH106轉(zhuǎn)錄因子的功能，選取突變體植株ptrbhlh106-2、ptrbhlh106-3進(jìn)行后續(xù)研究。

A. 等位基因編輯情況(紅色字母表示堿基插入，紅色“-”表示堿基缺失，“-16 bp-”表示缺失16個(gè)堿基)gene editing of alleles (The red letters represent insertion; the red short lines “-” represent deletion; “-16 bp-” represents 16 nucleotide deletion)；B. 被編輯基因的蛋白翻譯情況預(yù)測(cè)(紅色塊區(qū)域代表氨基酸改變) the prediction of amino acid sequence translation (The red short lines represent amino acid changed)。圖4 毛果楊PtrbHLH106基因編輯情況Fig.4 Gene editing of PtrbHLH106 gene in Populus trichocarpa

誤差線代表由3個(gè)生物學(xué)重復(fù)計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)誤，*表示通過(guò)t檢驗(yàn)，突變體與野生型植物各株系之間存在顯著差異，*.P<0.05，**.P<0.01)。下同。Statistical analysis of growth index of wild-type(WT) and ptrbhlh106 plants. Error bars represent SE values of three independent experiments. Asterisks indicate significant differences between each line of the mutants and wild-type plants by Student’s t test. The same below.圖5 毛果楊野生型與ptrbhlh106突變體表型分析Fig.5 Phenotype observation of WT and ptrbhlh106 mutants in Populus trichocarpa

2.3 毛果楊ptrbhlh106突變體的表型分析

對(duì)ptrbhlh106突變體植株進(jìn)行無(wú)性擴(kuò)繁后，與高度相似的野生型毛果楊組培苗一起盆栽于溫室中，在植株自然生長(zhǎng)60、90和120 d時(shí)進(jìn)行表型觀察(圖5)。從生長(zhǎng)過(guò)程來(lái)看，毛果楊ptrbhlh106突變體與野生型相比，株高和地徑?jīng)]有明顯差異。同時(shí)對(duì)莖節(jié)數(shù)以及第8莖節(jié)長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)定，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，突變體植株在生長(zhǎng)60 d時(shí)的莖節(jié)數(shù)量顯著大于野生型，隨著植株生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，莖節(jié)數(shù)有增加的趨勢(shì)，但差異不顯著；第8莖節(jié)的長(zhǎng)度在植株生長(zhǎng)60和120 d時(shí)與WT差異顯著，從植株生長(zhǎng)周期來(lái)看，突變體植株第8莖節(jié)的長(zhǎng)度有縮短的趨勢(shì)。由以上結(jié)果初步推測(cè)，PtrbHLH106的功能缺失，對(duì)植株的生長(zhǎng)未造成嚴(yán)重的影響。

為了進(jìn)一步解析PtrbHLH106在楊樹(shù)木材形成過(guò)程中發(fā)揮的功能，通過(guò)石蠟切片對(duì)毛果楊bhlh106突變體的第2、4、6、8和10莖節(jié)的橫切面進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示突變體的各類型細(xì)胞的形態(tài)與野生型毛果楊無(wú)差異(圖6A)。對(duì)切片中單位面積的導(dǎo)管細(xì)胞、纖維細(xì)胞數(shù)量及單個(gè)導(dǎo)管細(xì)胞的孔徑進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果(圖6C和6D)表明，與野生型相比突變體植株的纖維細(xì)胞數(shù)量顯著減少，導(dǎo)管細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯差異，單個(gè)導(dǎo)管孔徑顯著增加。對(duì)形成層細(xì)胞進(jìn)行觀察分析，發(fā)現(xiàn)突變體植株的形成層層數(shù)有增加的趨勢(shì)，但差異不顯著(圖6B和6E)。以上結(jié)果表明，PtrbHLH106轉(zhuǎn)錄因子的功能缺失，導(dǎo)致木質(zhì)部纖維細(xì)胞數(shù)量減少，導(dǎo)管孔徑增大，初步說(shuō)明該轉(zhuǎn)錄因子在次生木質(zhì)部發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了調(diào)控作用。

A. 野生型(WT)和突變體(ptrbhlh106)毛果楊各莖節(jié)細(xì)胞形態(tài)觀察(比例尺為200 μm)morphologic observation of stem internodes of WT and ptrbhlh106 (Bars=200 μm)；B. 形成層細(xì)胞形態(tài)觀察(紅色線表示形成層區(qū)域，比例尺為100 μm)morphologic observation of cambium cells (Red line showed cambium areas, Bars=100 μm)；C. 單位面積細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)statistics analysis of number of fiber and vessel cells in per unit cells；D. 導(dǎo)管孔徑面積統(tǒng)計(jì)statistics analysis of lumen area of per vessel；E. 形成層細(xì)胞層數(shù)統(tǒng)計(jì)statistics analysis of number of cambium cell layer。圖6 毛果楊ptrbhh106突變體石蠟切片觀察及細(xì)胞統(tǒng)計(jì)Fig.6 Paraffin section observation and statistical analyses of cells in ptrbhlh106 in Populus trichocarpa

3 討 論

因樹(shù)木生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、遺傳背景復(fù)雜、基因組信息不完善等因素的制約，對(duì)樹(shù)木的生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)等方面的研究受到很多技術(shù)的限制，尤其是在基因功能研究過(guò)程中，功能缺失突變體的創(chuàng)制異常困難。然而CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在2015年首次用于楊樹(shù)[28]，就預(yù)示著樹(shù)木突變體的創(chuàng)制不再是困擾科研人員的技術(shù)問(wèn)題。應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功獲得了一個(gè)毛果楊轉(zhuǎn)錄因子的功能缺失突變體，為研究該轉(zhuǎn)錄因子功能提供了重要的遺傳材料。在研究中，為了更加高效地獲得毛果楊突變體，應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)原理，開(kāi)發(fā)了簡(jiǎn)易的體外切割實(shí)驗(yàn)，對(duì)選取的gRNA進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的gRNA在毛果楊體內(nèi)同樣發(fā)揮著靶向高效性。該實(shí)驗(yàn)體系具有簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、結(jié)果易觀察等優(yōu)點(diǎn)，但也存在DNA模板單一的缺點(diǎn)，后續(xù)將對(duì)該體系進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

不同的載體系統(tǒng)隨著CRISPR系統(tǒng)在作物中的廣泛應(yīng)用應(yīng)運(yùn)而生，本研究使用的載體系統(tǒng)來(lái)自O(shè)sakabe研究團(tuán)隊(duì)[33-34]，該載體系統(tǒng)可成功應(yīng)用于蘋(píng)果、葡萄等木本植物中，也同樣成功地應(yīng)用到林木中[32, 35]。本研究中獲得的3株轉(zhuǎn)基因毛果楊經(jīng)測(cè)序鑒定，均為雙等位突變體，說(shuō)明該載體系統(tǒng)在毛果楊中具有很高的編輯效率。目前獲得樹(shù)木的單突變體已不再困難，但是獲得樹(shù)木的雙突變體或多突變體，仍是對(duì)開(kāi)發(fā)高效CRISPR系統(tǒng)的挑戰(zhàn)。樹(shù)木的遺傳背景復(fù)雜，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，獲得完整、高質(zhì)量基因注釋的樹(shù)種還較少，許多樹(shù)種的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)不完善，缺少針對(duì)樹(shù)木開(kāi)發(fā)的RNA聚合酶Ⅲ類啟動(dòng)子，都是制約樹(shù)木多突變體創(chuàng)制的因素。此外，基因的精準(zhǔn)編輯如單堿基編輯已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物中[36]，而在樹(shù)木中還未建立完善的堿基編輯系統(tǒng)。Li等[37]首次在楊樹(shù)中成功利用堿基編輯器對(duì)木質(zhì)素合成酶基因4CL進(jìn)行單堿基突變，預(yù)示著CRISPR/Cas系統(tǒng)也將在樹(shù)木中持續(xù)發(fā)揮其巨大的潛力。

木材形成是一個(gè)高度復(fù)雜的發(fā)育過(guò)程，涉及多類轉(zhuǎn)錄因子家族的參與和調(diào)控。從生物解剖學(xué)來(lái)看，木材是由次生木質(zhì)部增厚的次生細(xì)胞壁形成的，而有關(guān)次生細(xì)胞壁的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)更是涉及多種轉(zhuǎn)錄因子，如NAC、MYB家族轉(zhuǎn)錄因子，分別在木質(zhì)部纖維細(xì)胞、導(dǎo)管細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中起到分子開(kāi)關(guān)、次級(jí)調(diào)控因子的作用[38-39]。除此之外，其他家族轉(zhuǎn)錄因子在木材形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中也直接或間接地調(diào)控木材形成相關(guān)基因的表達(dá)[6]。bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子參與木質(zhì)部的發(fā)育過(guò)程[16-18]，本研究的PtrbHLH106屬于該家族成員，主要在毛果楊的形成層和木質(zhì)部表達(dá)。CRISPR/Cas9基因編輯的突變體ptrbhlh106在生長(zhǎng)上并未受到影響，并且形成層的細(xì)胞層數(shù)有增加的趨勢(shì)但變化不顯著，說(shuō)明PtrbHLH106的功能缺失未對(duì)整個(gè)植株的生長(zhǎng)和形成層細(xì)胞的分裂分化造成明顯影響。值得注意的是，在選取突變體做后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，其中1株突變體的基因編輯結(jié)果并未造成PtrbHLH106氨基酸序列的較大變化，推測(cè)還保留該基因的功能。而兩個(gè)突變體的表型一致，綜合兩個(gè)突變體的基因編輯情況和表型結(jié)果，說(shuō)明可能是由于基因存在功能冗余[32]，單獨(dú)敲除1個(gè)基因，往往不能對(duì)樹(shù)木重要發(fā)育過(guò)程產(chǎn)生很大影響。這一推測(cè)將通過(guò)后續(xù)獲得多突變體等手段進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究在木材發(fā)育相關(guān)基因的功能研究中發(fā)現(xiàn)，bHLH106基因在木材發(fā)育方面具有重要功能。毛果楊ptrbhlh106突變體與野生型植株相比，雖然苗高生長(zhǎng)和地徑在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著的差別，但解剖視野中纖維細(xì)胞數(shù)量顯著減少、導(dǎo)管孔徑顯著增大，形成層細(xì)胞層數(shù)增加，這說(shuō)明PtrbHLH106在樹(shù)木的木質(zhì)部細(xì)胞發(fā)育和木材形成過(guò)程中，對(duì)調(diào)控徑向生長(zhǎng)量可能有重要的作用。在木本植物中，有關(guān)木質(zhì)部發(fā)育的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，與木材生物質(zhì)累積和木質(zhì)資源的生物產(chǎn)品轉(zhuǎn)化高度相關(guān)[40-41]。PtrbHLH106基因?qū)δ静募?xì)胞壁纖維細(xì)胞的數(shù)量、導(dǎo)管的孔徑大小，以及形成層細(xì)胞層數(shù)的調(diào)控，可能對(duì)木質(zhì)部的組分，如纖維素含量、木質(zhì)素S/G比例、含量甚至結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，從而改變木材的理化性質(zhì)及終產(chǎn)品的加工利用工藝和品質(zhì)。這也是楊樹(shù)木材材性遺傳改良的重要發(fā)展方向和研究重點(diǎn)[42-43]。誠(chéng)然，本研究雖然拓寬了bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能范圍，但有關(guān)PtrbHLH106基因的更多功能及其分子調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步深入探究。