核桃油對大鼠視網膜缺血再灌注損傷視網膜神經節(jié)細胞的影響

劉金長，張海清，王輝，胡成全，徐蕾

（江西省贛州市贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院眼科，江西 贛州 341000）

隨著社會的不斷發(fā)展和生活方式的改變，眼科疾病越來越多，尤其是視網膜缺血之后再灌注造成的損傷病癥。該病是指在一定程度缺血后，發(fā)生的視網膜功能及結構變化，一般是在為視網膜血流實施再灌注時導致的損傷。核桃油具有很高的營養(yǎng)價值，除含有多種維生素還有更多的微量元素[1-2]。將核桃油應用于治療視網膜缺血再灌注損傷中具有一定的科學依據。但相關研究只是在提取方法和成分分析及分離方面，關于視網膜神經的營養(yǎng)研究較少[3-4]。因此，本研究主要分析核桃油在視網膜缺血再灌注損傷視網膜神經節(jié)細胞凋亡中產生的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取Sprague Dawley成年大鼠90只，雄性，體質量200～300 g，隨機分為正常組、視網膜缺血實施再灌注組（RIR）及核桃油組，每組30只。正常組大鼠給予常規(guī)治療，無任何手術操作，其他兩組大鼠實施前房穿刺，在缺血1 h后再次灌注，其中，RIR組大鼠不給予干預，核桃油組成功造模后喂養(yǎng)核桃油7 d。3組大鼠均選擇左眼對照。大鼠眼部和角膜透明度進行裂隙燈檢，所有大鼠的晶體均無任何渾濁，均未發(fā)生眼底病變問題。

實驗試劑及水合氯醛購自天根生化科技企業(yè)，NGF、酒精、甲醛溶液及PBS購自北京市賽馳生物有限公司；SABC試劑盒和BAX及BCL-2等購自武漢市博士德生物公司。本研究符合動物倫理委員會相關標準。

1.2 方法

1.2.1 構建RIRI模型 通過前房穿刺術升高大鼠的眼內壓，并對視網膜的中央動脈導致的視網膜缺血現(xiàn)象進行阻斷，這是現(xiàn)階段應用較多的一種RIRI模型建立的模型。首先進行稱重，需10%的水合氯醛，通過300 mg/kg的劑量為大鼠進行腹腔注射，麻醉起效后，取大鼠臥位，并固定其頭部，為右眼進行造模，然后選擇0.3%的奧布卡因滴眼液為大鼠進行局部的麻醉。將0.9%氯化鈉溶液和輸液器頭皮針順著顳側角鞏膜緣的位置向眼前房進行刺入，防止損傷虹膜以及晶體。打開輸液器開關，升高輸液袋，與實驗眼的垂直距離保持為150 cm，大鼠的眼內壓達到110 mmHg，球結膜和虹膜及視網膜會迅速變蒼白，此時大鼠的視網膜中央的動脈阻斷供血，選擇膠帶固定頭皮針。實施1 h高壓灌注，降低輸液袋，保持和眼球同水平，球結膜和虹膜顏色會快速恢復正常，同時，大鼠眼底的視網膜開始向橘紅色恢復，受阻的血流再次被開放，灌注形成。完成手術后運用左氧氟沙星的滴眼液防止術后感染。正常組不實施手術，其余均實施前房穿刺術。

1.2.2 統(tǒng)計視網膜的神經節(jié)細胞數(shù)量 完成造模后，需在灌注后7 d，及時為大鼠摘除眼球，同時保留1 mm視神經，通過酸性的福爾馬林液進行固定，實施石蠟包埋和視網膜鋪片，選擇每組實施再次灌注7 d后的石蠟切片，給予免疫組化的染色計數(shù)。通過顯微鏡放大400倍，取3個視野觀察，并且計數(shù)。

1.2.3 測定氧化指標 灌注7 d后為所有大鼠進行麻醉，并收集血液，4℃離心選擇血清，通過黃嘌呤氧化酶方法測定的活性SOD對吸光度進行測定。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據分析，計量資料以“”表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 核桃油對RIRI視網膜SOD及MDA含量的影響 造模7 d后，缺血再灌注組的大鼠和正常組的大鼠比較，視網膜組織勻漿液SOD活性降低，MDA含量提高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；核桃油喂養(yǎng)組大鼠和缺血再灌注組的大鼠比較，視網膜組織的勻漿液SOD活性明顯升高，MDA含量降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 核桃油對RIRI視網膜組織SOD及MDA含量的影響（±s）

表1 核桃油對RIRI視網膜組織SOD及MDA含量的影響（±s）

注：SOD，超氧化物歧化酶；MDA，丙二醛

指標SOD（U/mg）MDA（nmol/mg）正常組89.12±9.72 0.84±0.14缺血再灌注組43.27±10.32 1.78±0.35核桃油喂養(yǎng)組69.72±8.23 1.34±0.32

2.2 RIRI后的BAX和BCL-2蛋白表達比較 對于BAX蛋白性的表達，一般是黃色及棕黃色的染色，存在于細胞漿中。BCL-2的蛋白陽性是黃色及棕黃色，一般是存在于細胞漿中，正常組大鼠中無明顯的表達，經過7 d后檢測發(fā)現(xiàn)，BCL-2蛋白呈陽性，見表2。

表2 RIRI后BAX和BCL-2蛋白表達比較（±s）

表2 RIRI后BAX和BCL-2蛋白表達比較（±s）

指標BAX BCL-2正常組0.268±0.013 0.316±0.019缺血再灌注組0.431±0.019 0.312±0.002核桃油喂養(yǎng)組0.281±0.003 0.456±0.013

3 討論

正常生理情況下，大鼠細胞經過氧化后形成活性氧水平波動會在具體的范圍中，細胞內抗氧化的防御體系發(fā)生很大的改變，繼而使各個水平均實現(xiàn)氧化以及抗氧化的平衡。本研究結果顯示，與正常組比較，模型組SOD活性降低，MDA升高，視網膜缺血實施再次灌注時，該組大鼠的機體組織中的抗氧化酶活性得到降低，同時，脂質過氧化加重了損傷的程度。與模型組比較，實驗組大鼠的SOD活性明顯升高，MDA降低，說明視網膜缺血實施再次灌注損傷期間核桃油發(fā)揮保護性效果[5-6]。

本研究結果顯示，RIRI中凋亡的效果，BCL-2蛋白以及BAX蛋白表達受再灌注時間的影響，在6 h時RGC已明顯凋亡，長時間后，BCL-2蛋白的表達明顯增強，同時BAX表達增強，24 h開始達到高峰，48 h開始下降，但仍維持較高水平，至3 d減少。此時促凋亡的因素比較明顯，導致RGC受損程度逐漸加重，最終死亡。因此，可推測出，核桃油的應用會對BCL-2蛋白表達和BAX蛋白表達產生抑制效果，繼而對RIRI中視網膜的神經細胞凋亡進行抑制[7-8]。