EphB4、Beclin-1在稽留流產(chǎn)絨毛組織中的表達及與微血管密度的關(guān)系

倪惠華，曉 霄，張家怡，李 娟，花敏慧

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 南通 226001)

稽留流產(chǎn)是自然流產(chǎn)的特殊類型，其主要表現(xiàn)為胚胎或者胎兒在停止發(fā)育死亡后在宮腔內(nèi)滯留，未能正常排出體外[1]。有研究報道指出[2]，精神壓力、遺傳因素、不良生活習(xí)慣、母體自身性疾病及免疫功能異常均可造成稽留流產(chǎn)的產(chǎn)生，其主要表現(xiàn)為停經(jīng)、腹痛、陰道流血等。胎盤中的血管畸形可阻斷患者的母體螺旋動脈的血流，造成局部病灶部位的缺氧，造成了稽留流產(chǎn)的形成[3]。EphB4屬于酪氨酸蛋白激酶受體(Receptor tyrosine kinase，RTK)家族中的一員，與胚胎的發(fā)育、神經(jīng)軸突的導(dǎo)向以及血管的形成顯著相關(guān)[4]；自噬基因Beclin-1在胚胎細胞的生長以及凋亡中發(fā)揮重要作用，是自身免疫性疾病、癌癥、炎癥性疾病等治療的重要靶點，目前關(guān)于稽留流產(chǎn)患者的研究較少[5]。本研究檢測比較稽留流產(chǎn)患者和正常患者絨毛組織中EphB4、Beclin-1蛋白表達和微血管密度(Microvessel density，MVD)，并分析兩者的相關(guān)性，為臨床稽留流產(chǎn)診斷以及治療提供科學(xué)依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料

本研究以2020年1月至12月在南通大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科確診為稽留流產(chǎn)終止妊娠的患者62例為觀察組，平均年齡26.33±2.33歲(20～35歲)，平均孕周8.56±2.03周；另選取同期正常早孕自愿終止妊娠患者60例為對照組；兩組患者的年齡、體重指數(shù)(Body Mass Index，BMI)及孕周間均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①既往月經(jīng)規(guī)則；②妊娠期間無明顯感染及服藥史，無黃體酮等保胎治療史；③觀察組患者通過末次月經(jīng)推算胎齡并且通過B型超聲核對孕周、孕囊小于停經(jīng)天數(shù)、妊娠囊>2cm未見胚芽、胚芽的長度>lcm未見心管搏動；④對照組患者早孕人流組血清人絨毛膜促性腺激素檢測陽性，B型超聲檢查可見胚芽或(和)心管搏動以證實胚胎存活，妊娠囊大小與停經(jīng)天數(shù)相符合。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠時間在6周以下或10周以上；②年齡在20歲以下或40歲以上；③生殖道結(jié)構(gòu)畸形、月經(jīng)周期不規(guī)律、生殖道感染等；④母體患有全身性疾??；⑤孕早期毒物、藥物、射線接觸史、家族遺傳史等。所有患者均簽署知情同意書，并經(jīng)倫理委員會論證通過。

1.2試劑與儀器

主要試劑：EphB4鼠抗人單克隆抗體、Beclin-1鼠抗人單克隆抗體、CD34鼠抗人單克隆抗體、β-actin鼠抗人單克隆抗體(santa cruz公司，美國)、蛋白裂解液(Roche公司，德國)、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、免疫組化試劑盒、HPR標(biāo)記山羊抗鼠二抗、DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。主要儀器：組織石蠟包埋機LK-l型(北京滔達經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)公司)、自動封片機(SAKURA公司，日本)、凝膠成像分析處理系統(tǒng)(Bio-rad公司，美國)、垂直電泳槽(Bio-rad公司，美國)、光學(xué)顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.3實驗方法

1.3.1標(biāo)本采集

觀察組和對照組所有患者在負壓吸宮術(shù)后取出胎盤絨毛，用生理鹽水反復(fù)沖洗干凈后，分裝2份；一份置于凍存管內(nèi)-80℃冰箱保存，進行Western Blot實驗；一份包埋成組織蠟塊，行免疫組化染色。

1.3.2 Western Blot檢測絨毛組織中EphB4和Beclin-1蛋白的表達

分別對患者的絨毛組織進行收集20mg，將其內(nèi)加入細胞裂解液，在4℃保存20min。使用10 000r/min進行離心10min，取上清液30μL，加入10μL SDS loading buffer，在100℃下進行預(yù)處理10min，再次使用10000r/min進行離心10min，取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。隨后使用12%的SDS-PAGE進行電泳分離，每孔上樣為10μL，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并用5%脫脂牛奶封閉1h。將膜在4℃下與一抗抗EphB4(1∶1 000稀釋)、Beclin-1(1∶1 500稀釋)、β-actin(1∶1 000 稀釋)進行孵育過夜。同時使用PBST進行洗滌3次，同時加入HPR標(biāo)記山羊抗鼠IgG(1∶10 000稀釋)在室溫下孵育1小時。使用ECL底物化學(xué)發(fā)光法進行檢測。使用Image J軟件進行灰度分析，計算EphB4和Beclin-1蛋白的相對表達量。

1.3.3免疫組織化學(xué)法檢測絨毛組織中MVD的表達

對所有石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化，于高壓枸櫞酸鹽緩沖液中進行抗原修復(fù)，體積分數(shù)3%的雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，然后用山羊血清封閉液孵育。加入一抗CD34(1∶100稀釋)4℃孵育過夜后,滴加HPR標(biāo)記山羊抗鼠二抗，室溫孵育20min，DAB顯色，經(jīng)過蘇木精復(fù)染后脫水封片后顯微鏡下觀察CD34的染色情況。用CD34的表達量代表MVD。結(jié)果判定：CD34分布于細胞質(zhì)，以細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。微血管計數(shù)參考Weidner等[6]的標(biāo)準(zhǔn)：凡標(biāo)記清晰，著色強，與背景明顯有別的單個染色的血管內(nèi)皮細胞、管腔直徑小于8個紅細胞的血管或血管內(nèi)皮細胞簇，不論是否形成管腔或管腔內(nèi)是否有紅細胞，只要不和臨近的微血管、細胞及其它結(jié)締組織相連，就作為一個微血管。管壁有平滑肌的血管不予計數(shù)。先在低倍鏡下尋找新生血管最密集區(qū)，然后在200倍視野下選取5個視野，計數(shù)微血管染色數(shù)目,其平均值即該例的MVD。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1兩組患者一般情況比較

觀察組62例患者平均年齡為(26.33±2.33)歲，平均BMI為(23.18±1.39)kg/m2，平均孕周(8.56±2.03)周；對照組60例患者平均年齡(26.53±2.36)歲，孕前平均BMI為(23.13±2.36)kg/m2，平均孕周(8.62±2.22)周；兩組患者的年齡、BMI及孕周之間均無統(tǒng)計學(xué)差異(t值分別為0.47、0.14、0.16，P>0.05)，兩組具有可比性，見表1。

表1 兩組患者的一般情況比較 Table 1 Comparison of general conditions of the pregnantwomen between the two

2.2兩組患者絨毛組織中EphB4、Beclin-1蛋白相對表達量的比較

觀察組絨毛組織中EphB4蛋白相對表達量明顯低于對照組(t=4.97，P<0.01)，如圖1；觀察組絨毛組織中Beclin-1蛋白相對表達量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=23.04，P<0.01)，見圖2、表2。

表2 兩組患者絨毛組織中EphB4、Beclin-1蛋白相對表達量比較Table 2 Comparison of relative expression levels of EphB4and Beclin-1 proteins in the chorionic villous tissues ofthe pregnant women between the two

注：*表示與對照組比較，P<0.05。圖1 兩組絨毛組織中EphB4蛋白表達量比較Fig.1 Comparison of relative expression level of EphB4 protein in the chorionic villous tissues ofthe pregnant women betweenthe two groups

注：*表示與對照組比較，P<0.05。圖2 兩組絨毛組織中Beclin-1蛋白表達量比較Fig.2 Comparison of relative expression level of Beclin-1 protein in the chorionic villous tissues ofthe pregnant women between the two groups

2.3兩組患者絨毛組織中MVD的比較

觀察組患者絨毛組織中MVD(6.74±1.37)明顯低于對照組(15.70±5.51)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.42，P<0.01)，見圖3、表3。

表3 兩組患者絨毛組織中MVD的比較Table 3 Comparison of MVD in the chorionic villous tissues of the pregnant women

2.4稽留流產(chǎn)絨毛組織中EphB4、Beclin-1蛋白水平與MVD的相關(guān)性分析

在稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中，EphB4蛋白相對表達量與MVD呈正相關(guān)(r=0.44，P<0.01)，Beclin-1蛋白的相對表達量與MVD負正相關(guān)(r=-0.52，P<0.01)，具體如表4。

表4 稽留流產(chǎn)絨毛組織中EphB4、Beclin-1蛋白水平與MVD的相關(guān)性分析Table 4 Correlations of expression levels ofEphB4 and Beclin-1 proteins in chorionicvillous tissues of missed abortion with MVD

A.觀察組絨毛組織MVD(SP×200)；B.對照組絨毛組織MVD(SP×200)；C.兩組絨毛組織中MVD的比較；*表示與對照組比較，P<0.05。

3討論

以往研究認為，遺傳因素以及內(nèi)分泌因素均是造成患者稽留流產(chǎn)的重要影響因素，但仍然有超過50%稽留流產(chǎn)患者的病理生理學(xué)基礎(chǔ)尚不清晰[7]。最新研究報道顯示，胎盤的血管異常時造成患者稽留流產(chǎn)的重要原因，胎盤的發(fā)育與病灶部位的血管形成情況相關(guān)[8]。在正常的解剖關(guān)系中，胎盤組織具有較為復(fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò)，而在此結(jié)構(gòu)形成的過程中，主要可分為血管的形成以及血管的發(fā)生兩個階段，而血管的生成主要包括血管的出芽、內(nèi)填以及延長三個階段。而在胎盤組織上的氧分壓、炎性反應(yīng)以及局部氧化應(yīng)激反應(yīng)水平發(fā)生改變后，均可造成局部胎盤組織血管的形成發(fā)生障礙[9]。而隨著局部病灶部位的血管發(fā)生障礙后，局部組織的營養(yǎng)供給水平顯著下降，患者發(fā)生先兆流產(chǎn)以及胎兒窘迫的風(fēng)險顯著升高。有研究報道顯示，隨著病灶部位的胎盤血管形成顯著下降，顯著阻斷了病灶部位的螺旋小動脈的血液供應(yīng)，進而維持了1%～2%的低氧環(huán)境，隨著低氧環(huán)境的顯著升高，毛細血管的形成以及內(nèi)皮細胞的遷移作用也隨之下降，進一步造成了患者稽留流產(chǎn)風(fēng)險的升高[10]。

3.1絨毛組織EphB4表達與稽留流產(chǎn)MVD的相關(guān)性

Eph(Erythropoietin producing hepatoma cell line)受體家族是受體酪氨酸激酶家族的最大亞族，分成兩個亞群，EphA和EphB，其配體也被分為兩個亞群，分別為Ephrin-A和Ephrin-B。Eph的失調(diào)可導(dǎo)致細胞無限制生長甚至惡性轉(zhuǎn)化。EphB4是其重要組成成員，通過與其配體EphinB2結(jié)合，在血管的生成中發(fā)揮重要作用，對于血管的形成具有重要的意義。在動物實驗中已經(jīng)證實，通過對小鼠的EphB4基因進行敲除，小鼠的胚胎顯著壞死，而通過對死亡胚胎的解剖學(xué)分析，小鼠的胚胎壞死主要是由于缺陷型血管形成[11]。也有研究報道認為，患者的EphB4與機體的血管形成以及黏附、增殖顯著相關(guān)，在動物實驗中，隨著EphB4活性的顯著性下降，可造成胚胎發(fā)育的突然中止[12]。所以，EphB4的表達在胚胎的血管發(fā)育以及重塑中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，觀察組患者絨毛組織中EphB4蛋白相對量的表達顯著低于對照組；同時，相關(guān)性分析結(jié)果提示，稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中EphB4蛋白表達與MVD呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)。覃琴紅等[13]通過對早期稽留流產(chǎn)患者絨毛組織的EphB4水平分析顯示，在早期稽留流產(chǎn)患者中，患者的EphB4顯著下降，與本研究結(jié)果一致。

3.2絨毛組織 Beclin-1表達與稽留流產(chǎn)MVD的相關(guān)性

有研究報道顯示，在低氧狀態(tài)下，可通過對雷帕霉素靶蛋白信號途徑的調(diào)節(jié)作用，進一步增強滋養(yǎng)細胞的自噬作用，在正常的細胞狀態(tài)下，當(dāng)機體的局部滋養(yǎng)細胞的環(huán)境不利于細胞的生長時，少量的自噬細胞可通過對錯誤信號的折疊蛋白以及受損的細胞器進行吞噬，對機體的滋養(yǎng)細胞進行供能，維持機體的穩(wěn)定狀態(tài)。同時，通過對患者細胞的凋亡以及自噬作用的相互促進作用，維持機體的營養(yǎng)狀態(tài)[14]。本研究結(jié)果顯示，觀察組患者絨毛組織中Beclin-1蛋白相對量的表達顯著高于對照組；同時，相關(guān)性分析結(jié)果提示，稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中Beclin-1蛋白表達與MVD呈現(xiàn)顯著的負相關(guān)。提示在稽留流產(chǎn)患者的疾病進展中，局部胎盤的缺氧癥狀顯著，血管的形成以及畸形率顯著下降。目前對于稽留流產(chǎn)患者的研究中，機體的自噬作用對于稽留流產(chǎn)的發(fā)生發(fā)揮關(guān)鍵性作用[15]，認為在缺氧狀態(tài)下機體的mTOR負調(diào)控的自噬誘導(dǎo)、3級PI3K復(fù)合物與Beclin-1結(jié)合造成的自噬誘導(dǎo)、泛素養(yǎng)蛋白Atg8-PE 以及Atg12-Atg5-Atg16參與的雙層膜自噬誘導(dǎo)、自噬體與溶酶體形成的溶解階段自噬誘導(dǎo)顯著被激活，進一步對自噬體的形成以及成熟進行調(diào)控。本研究中，隨著患者的缺氧狀況的顯著升高，患者的Beclin-1顯著升高，MVD水平顯著下降，謝冰等[16]在對稽留流產(chǎn)患者的Beclin-1水平的分析中，患者的Beclin-1顯著升高，與本研究相互印證。

綜上所述，絨毛組織中EphB4、Beclin-1水平與稽留流產(chǎn)患者MVD有相關(guān)性，早孕期EphB4的低表達和Beclin-1水平高表達可導(dǎo)致血管生成障礙，可能與稽留流產(chǎn)發(fā)生發(fā)展具有一定的相關(guān)性。