兩種血性胸腔積液的細(xì)胞蠟塊制作方法對制片結(jié)果的影響

施丹飛，崔戈，李勇

湖州師范學(xué)院附屬第一醫(yī)院 病理科，浙江 湖州 313000

血性胸腔積液是惡性腫瘤晚期累及胸膜常見的臨床并發(fā)癥，其主要的臨床癥狀有呼吸困難、胸痛、咳嗽等，這些癥狀不但降低患者生活質(zhì)量，甚至?xí){患者的生命[1-2]。收集、尋找血性胸腔積液中的腫瘤細(xì)胞，必要時(shí)行免疫組化進(jìn)行進(jìn)一步診斷和鑒別診斷，可為患者的臨床治療提供依據(jù)。近年來，細(xì)胞蠟塊聯(lián)合免疫組化的方法由于操作簡單、檢出率較高被廣泛應(yīng)用于胸腔積液檢查中[3-4]。但是傳統(tǒng)細(xì)胞蠟塊制片中大量紅細(xì)胞常影響蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining, HE染色）制片及免疫組化制片結(jié)果。為此本研究通過改良血性胸腔積液細(xì)胞蠟塊的制作方法，提高細(xì)胞蠟塊的制片優(yōu)良率。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集湖州師范學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科2018年1月至2021年1月的55例臨床送檢的疑似惡性腫瘤的血性胸腔積液標(biāo)本，其中男39例，女16例，年齡28～87（63.4±13.5）歲，55例標(biāo)本全部進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)染色。

1.2 主要設(shè)備和試劑 低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，TDL-80-2B）、脫水機(jī)（德國LEICA公司，ASP-300S）、包埋機(jī)（德國LEICA公司，Arcadia）、切片機(jī)（德國LEICA公司，RM2245）、電熱恒溫箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DHG-9123A）、染片機(jī)（德國LEICA公司，AUTOSTAINERXL）、顯微鏡（德國LEICA公司，DM2000），抗體購自福州邁新公司，采用KIT-5230試劑盒及DAB顯色系統(tǒng)顯色。

1.3 方法 每例患者均取4支容積為50 mL的試管，標(biāo)記為A1、A2、A3和B管，A1、A2、A3管用于傳統(tǒng)細(xì)胞蠟塊制片（傳統(tǒng)組），B管用于改良細(xì)胞蠟塊制片（改良組）。具體操作如下：A1、A2、A3管分別采集胸腔積液15 mL，B管采集胸腔積液45 mL。4管胸腔積液皆以2 500 r/min離心10 min，用吸管吸干上清液。A1、A2、A3管采用傳統(tǒng)細(xì)胞蠟塊制作法，三管沉淀物富集于A1管中。步驟如下：①加入10%中性甲醛液混勻后固定10 min；②以2 500 r/min離心5 min，倒去固定液；③加入75%乙醇混勻，以 2 500 r/min離心5 min，倒掉75%乙醇；④輕輕加入95%的乙醇靜置30 min。B管采用改良細(xì)胞蠟塊制作法，首先添加5%的乙醇乙酸液（即95 mL 25%的乙醇加5 mL冰乙酸），混勻后靜置10 min用以破壞紅細(xì)胞，然后以2 500 r/min離心5 min，吸干上清液，留下沉淀，后續(xù)操作同傳統(tǒng)離心法（步驟①至④）。后續(xù)經(jīng)常規(guī)脫水、包埋、切片、HE染色及免疫組化染色。每例患者的胸水均制成2個(gè)蠟塊，共收集55例患者的胸水細(xì)胞蠟塊。

1.4 結(jié)果判讀 請同一位診斷醫(yī)師進(jìn)行閱片，以組織活檢的HE及免疫組化染色結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)HE和免疫組化質(zhì)控的指標(biāo)對制片質(zhì)量進(jìn)行評判。HE制片優(yōu)良指標(biāo)為：無破碎刀痕，無厚薄不均，染色清晰、核質(zhì)分明（細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色），染色對比好；免疫組化Ki-67制片優(yōu)良指標(biāo)為：無掉片，無非特異性染色，染色定位好（細(xì)胞核呈棕黑色，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜無染色）。符合上述要求的組織切片判斷為優(yōu)良，不符合者均納入不良制片數(shù)，統(tǒng)計(jì)制片優(yōu)良率和制片不良率。制片優(yōu)良率=（優(yōu)良制片數(shù)/制片總數(shù)）×100%。制片不良率=（不良制片數(shù)/制片總數(shù)）×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，2組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種細(xì)胞蠟塊制作方法的HE制片和免疫組化制片不良率比較 改良組的不良制片率顯著小于傳統(tǒng)組（χ2=8.419，P=0.004）。改良組的HE制片優(yōu)良率（94.6%）高于傳統(tǒng)組（74.5%）。改良組的不良制片率顯著小于傳統(tǒng)組（χ2=5.636，P=0.018）。改良組的HE制片優(yōu)良率（92.7%）高于傳統(tǒng)組（76.4%）。見表1和表2。

表1 兩種細(xì)胞蠟塊制作方法的HE制片不良率的比較[每組n= 55，例（%）]

表2 兩種細(xì)胞蠟塊制作方法的免疫組化制片不良率的比較[每組n=55，例（%）]

2.2 兩種細(xì)胞蠟塊制作方法的HE染色及免疫組化染色結(jié)果比較 傳統(tǒng)制作法由于紅細(xì)胞量多，導(dǎo)致HE染色切片厚薄不均，開裂掉片，整個(gè)視野充滿了紅細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞分散不富集，免疫組化染色切片有非特異性染色，背景呈廣泛黃色；而改良制作法由于用乙醇乙酸液破壞了大部分紅細(xì)胞，HE染色切片沒有掉片，染色對比好，腫瘤細(xì)胞富集，免疫組化染色切片背景清晰。見圖1、圖2。

圖1 胸水細(xì)胞蠟塊傳統(tǒng)制作法（×100）

圖2 胸水細(xì)胞蠟塊改良制作法（×100）

3 討論

有些腫瘤晚期患者腫瘤范圍過大，有些高齡患者做手術(shù)有風(fēng)險(xiǎn)，皆不具備手術(shù)指征，此時(shí)胸腔積液細(xì)胞蠟塊病理診斷對于患者的病情評估具有重要意義。胸腔積液中原有的細(xì)胞呈分離狀，有時(shí)僅依靠涂片不能準(zhǔn)確辨別出良惡性，在涂片質(zhì)量差、較少的細(xì)胞量以及變形、細(xì)胞重疊等因素影響下，難以對患者的疾病性質(zhì)作出正確的判斷，造成誤診率增加，細(xì)胞蠟塊技術(shù)可彌補(bǔ)這一缺點(diǎn)[5]。細(xì)胞蠟塊制作方法簡單，在基層病理科均可開展。而且細(xì)胞蠟塊可以永久保存，重復(fù)多次制片，多項(xiàng)研究表明細(xì)胞蠟塊可以進(jìn)行免疫組織化學(xué)、分子檢測、原位雜交等，可對疾病進(jìn)行深入研究[6-7]。常見的細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組化的方法對于腫瘤的分型具有重要的作用，但是血性胸腔積液由于大量的紅細(xì)胞的存在，影響細(xì)胞蠟塊的切片質(zhì)量，給后續(xù)的HE染色及免疫組化染色增加了難度。對于免疫組化染色，富含大量紅細(xì)胞的細(xì)胞蠟塊經(jīng)脫水后會質(zhì)地變硬，切成片經(jīng)高溫修復(fù)后容易掉片，導(dǎo)致報(bào)告發(fā)布時(shí)間延遲；其次紅細(xì)胞中的類內(nèi)源性過氧化物酶會使組織產(chǎn)生非特異性染色，導(dǎo)致免疫背景加深，影響定位的準(zhǔn)確性，繼而影響診斷臨床醫(yī)師的判斷，最后影響診斷結(jié)果。采用改良法則能較好地去除紅細(xì)胞的影響，保證診斷結(jié)果的可靠性，且不易掉片，保證診斷報(bào)告發(fā)布的及時(shí)性。

在本研究中，采用改良法對55例滲出性胸腔積液樣本進(jìn)行細(xì)胞蠟塊的制片，其優(yōu)良率（HE：94.6%，免疫組化：92.7%）顯著高于傳統(tǒng)法（HE：74.5%，免疫組化：76.4%）。原理是乙醇乙酸液作用于紅細(xì)胞，使其快速膨脹裂解，裂解物可隨上清液被棄去，而間皮細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等結(jié)構(gòu)完整、不變形，核質(zhì)分明，核仁清晰[8]，從而提高了腫瘤細(xì)胞的檢出率，使用紅細(xì)胞破壞法制成的切片經(jīng)HE染色后背景清晰、紅藍(lán)分明；經(jīng)免疫組化染色后無非特異性染色、幾乎無掉片，對細(xì)胞學(xué)診斷具有較高的實(shí)用價(jià)值。總結(jié)本研究中的幾點(diǎn)注意事項(xiàng)：①選用容積為50 mL的試管，能聚集更多的細(xì)胞；②添加乙醇乙酸液的量以溶液略變淺紅色為宜，添加過多易引起細(xì)胞退變，添加過少則對紅細(xì)胞破壞不足；③在血性胸腔積液中添加乙醇乙酸液后，使用震蕩器震蕩能使兩者充分混勻，更利于紅細(xì)胞的去除。

綜上所述，血性胸腔積液使用改良法制作的細(xì)胞蠟塊，HE和免疫組化制片質(zhì)量好，對細(xì)胞學(xué)診斷的價(jià)值高，因此更具應(yīng)用價(jià)值。另外，該方法操作簡便，試劑易配制，結(jié)果較穩(wěn)定。