白芍總苷對糖尿病所致心肌損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

王振賢 王立哲

糖尿病心肌病是由長期高血糖所導(dǎo)致的心肌組織結(jié)構(gòu)病變和功能損傷，是糖尿病患者最常見的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致其心力衰竭、心源性休克甚至死亡的主要因素之一[1-2]，因此防治糖尿病心肌病對糖尿病患者具有積極意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)和心肌纖維化在糖尿病心肌病并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[3-4]。白芍總苷（total glucosides of paeony,TGP）是中藥白芍中提取的一類活性化合物，包括芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等成分，具有良好的抗炎活性并對腹膜、肝纖維化具有顯著的抑制作用[5-7]。本研究通過腹腔注射鏈尿佐菌素聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)制備糖尿病心肌病大鼠模型，探討TGP對糖尿病所致心肌損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康、清潔級雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量（220±20）g，均購自河北省實驗動物中心[SYXK（冀）2018-004]。

1.2 藥物與試劑 TGP膠囊購自寧波立華制藥有限公司（批號：20190517，規(guī)格：0.3 g/粒）；鹽酸二甲雙胍片（metformin，Met）購自天津亞寶藥業(yè)科技有限公司（批號：190731，規(guī)格：0.3 g/片）；HE、Masson染色試劑盒和ELC超敏發(fā)光試劑盒均購自南京建成生物工程研究所（批號：191219、191124、200107）；TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒均購自北京索萊寶生物科技有限公司（批號：SEKR-0009、SEKR-0002、SEKR-0005）；Toll樣受體 4（TLR4）、髓樣分化蛋白（MyD88）、NF-κB抗體和IgG二抗均購自北京博奧森生物科技有限公司（批號：bs-20594R、bs-1047R、bs-23217R、bs-0294P）；BCA試劑盒、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠試劑盒均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司（批號：CW0014、CW0022M）。

1.3 主要儀器 Sure Step Plus型血糖儀購自美國強(qiáng)生公司；Vevo2100型動物超聲儀檢測購自加拿大Visual Sonics公司；HM340E石蠟切片機(jī)購自德國Thermo Scientific公司；Allegra 21R型低溫離心機(jī)購自美國Beckman公司；RT-6100型酶標(biāo)儀購自美國Rayto公司；DYCZ-24DN型電泳儀、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀均購自北京六一生物科技有限公司；Chem Doc XRS型凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組、模型制備與給藥 將120只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為 Met組（200 mg/kg）[8]、TGP 低、中、高劑量組（50、100、200 mg/kg）組[9]、模型組和正常對照組，每組20只。除正常對照組外，其余各組大鼠均采用一次性腹腔注射鏈尿佐菌素（65 mg/kg）聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)8周的方法制備糖尿病心肌病大鼠模型，造模成功標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[10]。自造模第1天開始，Met組1次/d 40 mg/ml的Met溶液灌胃（灌胃體積5 ml/kg），TGP 低、中、高劑量組分別 1次/d 10、20、40 mg/ml的TGP溶液灌胃（灌胃體積5 ml/kg），模型組和正常對照組同步予0.9%氯化鈉溶液灌胃（灌胃體積5 ml/kg），療程8周。

1.4.2 各組大鼠FPG水平和心功能指標(biāo)檢測 給藥8周后，各組隨機(jī)取10只大鼠，于清晨空腹采集尾靜脈血，用血糖儀檢測FPG水平。用動物超聲儀檢測心功能指標(biāo)：左心室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）、射血分?jǐn)?shù)（EF）、每搏輸出量（SV），連續(xù)測量5個心動周期，取其平均值。

1.4.3 各組大鼠心肌組織病理學(xué)改變和纖維化程度觀察 上述大鼠麻醉后開胸取心臟，切取左心室置10%甲醛溶液中固定3 d，石蠟包埋后5 μm厚度連續(xù)切片，二甲苯透明和梯度乙醇脫蠟水化后：（1）行HE染色，梯度乙醇脫水和透明處理后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察心肌組織病理學(xué)改變；（2）參照Masson染色試制盒操作說明書處理，顯微鏡下觀察心肌纖維化程度（肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色）。

1.4.4 各組大鼠血清炎癥因子含量檢測 取各組剩余的10只大鼠，麻醉后經(jīng)腹主動脈取血，2 000 r/min離心10 min取血清，參照ELISA試劑盒操作方法檢測血清 TNF-α、IL-1β、IL-6 含量。

1.4.5 各組大鼠心肌組織蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。上述大鼠取血完成后開胸取心臟，切取左心室心肌組織剪碎后加入9倍量冷裂解液充分裂解，4℃、12 000 r/min離心20 min后取上清液，然后參照BCA試劑盒說明書檢測總蛋白濃度、95℃水浴使蛋白變性后，經(jīng)SDS-PAGE膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、5%蛋白免疫印跡封閉液室溫封閉2 h，滴加目標(biāo)蛋白、β-actin抗體4℃孵育12 h，PBS溶液洗膜后滴加二抗37℃孵育1 h，PBS溶液洗膜后滴加ELC發(fā)光試劑后，通過凝膠成像儀顯示蛋白條帶，以β-actin為內(nèi)參、通過條帶灰度值半定量目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FPG水平比較 與正常對照組比較，模型組大鼠FPG水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，Met組和TGP中、高劑量組FPG水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。見表 1。

表1 各組大鼠FPG水平比較（mmol/L）

2.2 各組大鼠心功能指標(biāo)比較 與正常對照組比較，模型組大鼠LVIDd、LVIDs均明顯升高，而EF、SV均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；與模型組比較，Met組和TGP中、高劑量組LVIDd、LVIDs均明顯降低，而EF、SV均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與Met組比較，TGP高劑量組LVIDs明顯降低，EF、SV均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠心功能指標(biāo)比較

2.3 各組大鼠心肌組織病理學(xué)改變 正常對照組大鼠心肌纖維排列整齊規(guī)則，細(xì)胞形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整，著色均勻；模型組可見心肌纖維斷裂、排列紊亂，細(xì)胞呈空泡變性，可見大量炎性細(xì)胞浸潤；與模型組比較，Met組和TGP低、中、高劑量組心肌纖維和細(xì)胞病變呈不同程度改善，其中TGP高劑量組未見心肌纖維斷裂，炎性細(xì)胞浸潤數(shù)量明顯減少。見圖1（插頁）。

圖1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)改變[a：正常對照組；b：模型組；c：二甲雙胍（Met）組；d：白芍總苷（TGP）低劑量組；e：TGP 中劑量組；f：TGP高劑量組；HE染色，×200]

2.4 各組大鼠心肌纖維化程度改變 正常對照組大鼠心肌可見肌束平行方向的膠原纖維，含量適宜、分布均勻；與正常對照組比較，模型組藍(lán)染膠原纖維明顯增多，排列紊亂，分布不均、以血管周圍含量較多；與模型組比較，Met組和TGP低、中、高劑量組心肌纖維化呈不同程度減輕，其中以TGP高劑量改善最為明顯。見圖2（插頁）。

圖2 各組大鼠心肌纖維化程度改變[a：正常對照組；b：模型組；c：二甲雙胍（Met）組；d：白芍總苷（TGP）低劑量組；e：TGP中劑量組；f：TGP高劑量組；Masson染色，×200]

2.5 各組大鼠血清炎癥因子含量比較 與正常對照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；與模型組比較，Met組和TGP中、高劑量組 TNF-α、IL-1β、IL-6含量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；與 Met組比較，TGP高劑量組TNF-α、IL-6含量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠血清炎癥因子含量比較（pg/ml）

2.6 各組大鼠心肌組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較 與正常對照組比較，模型組大鼠TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；與模型組比較，Met組和TGP中、高劑量組TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與Met組比較，TGP 高劑量組 TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖 3、表 4。

表4 各組大鼠心肌組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較

圖3 各組大鼠心肌組織Toll樣受體4（TLR4）、髓樣分化蛋白（MyD88）、NF-κB 蛋白表達(dá)的電泳圖[a：正常對照組；b：模型組；c：二甲雙胍（Met）組；d：白芍總苷（TGP）低劑量組；e：TGP 中劑量組；f：TGP 高劑量組]

3 討論

糖尿病心肌病是糖尿病最常見的并發(fā)癥，以心肌細(xì)胞肥大和心肌纖維化為主要病理特征，可導(dǎo)致心肌收縮功能障礙進(jìn)而引發(fā)心力衰竭、心源性休克甚至致殘、致死，約占Ⅱ型糖尿病死亡數(shù)的80%[11]。Wu等[12]研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)高血糖刺激炎癥細(xì)胞因子大量釋放是導(dǎo)致心肌纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制。因此，以抑制炎癥反應(yīng)及心肌纖維化為治療靶點對防治糖尿病心肌病至關(guān)重要。

近年來，隨著國家中醫(yī)藥發(fā)展戰(zhàn)略的實施與深入，中醫(yī)藥治療糖尿病逐漸得到醫(yī)生和患者的關(guān)注與認(rèn)可。中藥白芍以毛茛科植物芍藥的干燥根入藥，味苦、性寒，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、平抑肝陽之功效。TGP為白芍的主要活性成分，具有良好的抗炎活性和抗纖維化作用[5-7]；曹秋夏等[13]研究發(fā)現(xiàn)TGP能夠通過抑制炎癥反應(yīng)和腎間質(zhì)纖維化而對糖尿病大鼠腎臟起到保護(hù)作用。本實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型大鼠呈現(xiàn)心肌纖維斷裂、細(xì)胞空泡變性、炎性細(xì)胞浸潤等病理性改變以及血管周圍較多見的心肌纖維化，這與劉金巖等[14]研究報道一致；給予TGP治療8周能夠明顯降低糖尿病大鼠FPG水平，明顯改善心功能指標(biāo)（降低LVIDd、LVIDs并提高EF、SV），改善心肌纖維和細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)病變并降低心肌纖維化程度，并且TGP高劑量組對心功能指標(biāo)和心肌病變的改善作用優(yōu)于Met組，提示TGP對糖尿病大鼠心肌結(jié)構(gòu)和功能具有保護(hù)作用。

持續(xù)高血糖將刺激心肌細(xì)胞大量釋放炎癥細(xì)胞因子和趨化因子等，TNF-α、1L-6、IL-1β 不但能夠介導(dǎo)炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致心肌損傷，并且能夠刺激粒細(xì)胞等進(jìn)一步合成與釋放炎癥因子引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)而逐漸加重心肌損傷[15]。TLR4在心肌組織中廣泛表達(dá)并參與心肌炎癥的調(diào)節(jié)[16]，TLR4被激活后能夠活化MyD88炎癥通路；另外，TLR4/MyD88通路能夠間接激活NF-κB，而 NF-κB 則能夠刺激 TNF-α、1L-6、IL-1β 轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而加重炎癥反應(yīng)[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予TGP治療8周能夠明顯降低糖尿病大鼠血清TNF-α、1L-6、IL-1β 水平，降低心肌組織 TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)水平，提示TGP具有抑制糖尿病大鼠心肌炎癥反應(yīng)的作用，可能與抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路有關(guān)。

綜上所述，TGP對糖尿病大鼠心肌結(jié)構(gòu)和功能具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。