高遷移率族蛋白1參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機制的研究進展

方思佳，范永升，楊科朋

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，杭州 310053； 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，杭州 310005)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種以自身反應(yīng)性T細胞和B細胞過度活化、大量自身抗體形成、免疫復(fù)合物沉積為特征，累及多系統(tǒng)、多臟器的高異質(zhì)性自身免疫性疾病。免疫紊亂和炎癥反應(yīng)是SLE發(fā)生發(fā)展的基本病理過程，但其發(fā)生的細胞和分子機制目前仍不十分明確。高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)是一類主要存在于真核細胞核內(nèi)的非組蛋白；作為DNA結(jié)合蛋白，HMGB1通過影響染色體結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及DNA的重組、修復(fù)等[1]。此外，HMGB1作為一種損傷相關(guān)分子模式釋放至細胞外，除直接刺激細胞外，還能與細胞因子、DNA、核小體等內(nèi)源性和外源性因子形成免疫刺激復(fù)合物，在炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[2]。現(xiàn)就HMGB1的分子生物學(xué)特性及其參與SLE發(fā)病的細胞和分子機制予以綜述。

1 HMGB1的分子生物學(xué)特性

人HMGB1基因位于13q12染色體，編碼215個氨基酸殘基，結(jié)構(gòu)高度保守，由A盒(1～79氨基酸殘基)、B盒(95～163氨基酸殘基)、2個DNA結(jié)合區(qū)域和一個酸性的C端(186～215氨基酸殘基)組成。A盒和B盒能夠與DNA結(jié)合，并參與DNA雙鏈的折疊與扭曲；C端富含帶負電荷的天門冬氨酸和谷氨酸，促使A盒和B盒形成正確的空間構(gòu)象，調(diào)節(jié)HMGB1與DNA的特異性結(jié)合。當HMGB1釋放至胞外后，HMGB1可與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)、Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)等相應(yīng)受體結(jié)合，發(fā)揮促炎等功能；其中，B盒是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的功能區(qū)域，而A盒與全長HMGB1競爭性結(jié)合相應(yīng)受體，但不發(fā)揮生物學(xué)功能，故可作為HMGB1的特異性拮抗劑[3]。

HMGB1的生物學(xué)活性取決于其位置和翻譯后修飾。細胞核內(nèi)的HMGB1是一種DNA結(jié)合蛋白，可參與調(diào)節(jié)染色體結(jié)構(gòu)，釋放至胞外的HMGB1可作為內(nèi)源性危險信號刺激免疫系統(tǒng)并促進炎癥反應(yīng)。HMGB1的翻譯后修飾與其定位及生物學(xué)功能密切相關(guān)[4-5]。細胞核內(nèi)HMGB1與DNA結(jié)合的緊密程度取決于組蛋白的乙?；?，組蛋白乙酰化水平越低，HMGB1與DNA結(jié)合越緊密[6]。細胞壞死時，與染色質(zhì)松散結(jié)合的HMGB1釋放至胞外；但凋亡細胞中HMGB1因組蛋白廣泛去乙酰化而與染色質(zhì)緊密結(jié)合，故在細胞凋亡早期HMGB1仍駐留在細胞核內(nèi)；若凋亡細胞未被及時清除而發(fā)生二次壞死，HMGB1可以從二次壞死的細胞中被動釋放至胞外[7]。巨噬細胞等細胞活化后，HMGB1乙?；揎椏纱龠M其主動分泌至胞外[8]。HMGB1蛋白結(jié)構(gòu)中兩個DNA結(jié)合位點的磷酸化對于阻斷HMGB1重新進入細胞核并促進其在細胞質(zhì)中積累至關(guān)重要[9]。中性粒細胞中HMGB1的甲基化可能削弱其與DNA的結(jié)合，HMGB1進而被動擴散至細胞核外[10]。HMGB1包含3個半胱氨酸殘基，分別是Cys23、Cys45和Cys106，其中Cys106的氧化還原狀態(tài)與HMGB1的促炎活性相關(guān)，Cys106的氧化可阻斷HMGB1誘導(dǎo)的促炎介質(zhì)釋放[2]。

2 HMGB1參與SLE發(fā)病的機制

SLE患者體內(nèi)吞噬細胞功能異常，凋亡細胞不能及時被清除而發(fā)生二次壞死，導(dǎo)致HMGB1被動釋放至胞外；此外，SLE患者循環(huán)和受累組織中單核巨噬細胞等細胞異?；罨⒅鲃臃置贖MGB1；同時，SLE患者體內(nèi)中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)增多，亦可導(dǎo)致HMGB1胞外釋放增加[11]。因此，SLE患者循環(huán)和受累組織中胞外HMGB1升高，且與疾病活動性相關(guān)[12]；而釋放至胞外的HMGB1通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫紊亂進一步促進SLE發(fā)生發(fā)展。

2.1HMGB1與固有免疫應(yīng)答

2.1.1HMGB1與單核巨噬細胞 SLE患者組織和循環(huán)中單核巨噬細胞數(shù)量增加并異常活化，進而分泌HMGB1等促炎介質(zhì)促進疾病發(fā)生發(fā)展；而胞外HMGB1可正反饋調(diào)控單核巨噬細胞活化。用淋巴細胞來源DNA(activated lymphocyte-derived DNA，ALD-DNA)刺激并活化巨噬細胞后，一方面，胞外HMGB1水平以TLR9依賴的方式顯著升高；另一方面，胞外HMGB1對ALD-DNA誘導(dǎo)的巨噬細胞活化有明顯的促進作用，且胞外HMGB1促進巨噬細胞活化可能通過加速和增加內(nèi)體ALD-DNA的積聚實現(xiàn)，功能性阻斷胞外HMGB1釋放能有效抑制ALD-DNA誘導(dǎo)的炎癥細胞因子釋放[13]。HMGB1促進單核巨噬細胞活化的功能可能由其受體RAGE介導(dǎo)，由于抗RAGE抗體可以阻斷含DNA的免疫復(fù)合物誘導(dǎo)的U937細胞活化及腫瘤壞死因子-α和B細胞活化因子分泌[14]。HMGB1促進巨噬細胞等細胞活化的生物學(xué)效應(yīng)可能是通過其與免疫刺激物形成復(fù)合物并促進后者被內(nèi)吞入胞實現(xiàn)的；HMGB1通過與RAGE結(jié)合促進免疫刺激物被內(nèi)吞入細胞并被胞內(nèi)受體識別，進而激活下游信號通路[15]。RAGE可促進細胞對核酸的攝?。籖AGE敲除小鼠及從該小鼠體內(nèi)提取的骨髓細胞對核酸誘導(dǎo)的炎癥應(yīng)均答降低[16-17]。

單核巨噬細胞的表型和功能異常是SLE發(fā)病的重要機制之一。單核巨噬細胞具有高度可塑性，在不同微環(huán)境刺激下可以極化為不同表型，包括經(jīng)典活化型(M1型)和替代活化型(M2型)，分別發(fā)揮促炎和抗炎的作用。SLE患者體內(nèi)，M1促炎表型增加。Labonte等[18]分析健康對照人群、穩(wěn)定期和活動期SLE患者髓系細胞的基因表達譜，結(jié)果顯示，與健康對照人群相比，穩(wěn)定期和活動期SLE患者髓系細胞中存在大量差異基因表達，包括調(diào)控巨噬細胞活化和極化的基因，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子6、細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3和CD163等；加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析顯示，SLE疾病活動與髓系細胞中M1型巨噬細胞相關(guān)基因的激活相關(guān)。HMGB1可以促進單核巨噬細胞向M1型極化。Schaper等[19]研究顯示，與健康對照者相比，SLE患者單核細胞CD163表達明顯降低，但兩者的CD86表達比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；體外誘導(dǎo)分化后，兩者M1、M2型巨噬細胞表面受體表達和吞噬能力比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；在M2型巨噬細胞的分化過程中，HMGB1可促進白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α信使RNA的高表達，降低巨噬細胞對凋亡細胞的吞噬能力，提示SLE患者的循環(huán)單核細胞以M1型為主，而其體外分化可消除這種差異，HMGB1可促進M2型巨噬細胞向M1型巨噬細胞的分化，從而抑制其吞噬功能。

2.1.2HMGB1與中性粒細胞 NETs是不同于凋亡和壞死的一種中性粒細胞新型死亡方式，以核內(nèi)或線粒體內(nèi)DNA為骨架，負載抗微生物肽及水解酶組成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包裹及殺傷外來入侵的病原體，這一過程稱為NETosis。NETosis與自身免疫病密切相關(guān)，若NETs過度形成或未及時清除，可導(dǎo)致組織損傷，同時釋放內(nèi)源性危險信號，誘導(dǎo)自身免疫。正常情況下，NETs被循環(huán)中的脫氧核糖核酸酶Ⅰ降解，但SLE患者體內(nèi)脫氧核糖核酸酶Ⅰ活性降低導(dǎo)致NETs降解減少[20]。低密度粒細胞是中性粒細胞的亞群之一；SLE患者體內(nèi)的低密度中性粒細胞可以自發(fā)形成NETs[21]。NETs是胞外HMGB1的重要來源之一[22]。同時，HMGB1可誘導(dǎo)NETs形成，當中性粒細胞暴露于HMGB1后，中性粒細胞DNA和組蛋白H3釋放以及細胞內(nèi)組蛋白H3瓜氨酸化均增加[23]。此外，HMGB1可能在其受體TLR2、TLR4、RAGE的介導(dǎo)下，增強抗中性粒細胞胞質(zhì)抗體誘導(dǎo)的NETs形成，進而參與抗中性粒細胞胞質(zhì)抗體相關(guān)性血管炎的發(fā)病[24]。

2.1.3HMGB1與漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cells，pDC) pDC是一類以分泌大量 Ⅰ 型干擾素(interferon，IFN)為特征的樹突狀細胞。pDC在SLE中的致病作用通常被認為是其產(chǎn)生 Ⅰ 型IFN的結(jié)果[25]。胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤寡脫氧核苷酸(cytosine-phosphoric acid-guanineoligodeoxynucleotide，CpG-ODN)是含有非甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤二核苷酸序列(CpG)的寡脫氧核苷酸，可在相應(yīng)受體介導(dǎo)下激活免疫細胞。HMGB1可在RAGE介導(dǎo)下促進CpG-ODN誘導(dǎo)的pDC激活以及Ⅰ型IFN產(chǎn)生，進而促進自身免疫應(yīng)答[26]。TLR7或TLR9激活后，一方面HMGB1從pDC的細胞核內(nèi)釋放，另一方面，在pDC活化過程中，pDC表面的RAGE表達增加[27]；因此，pDC活化后可在HMGB1/RAGE介導(dǎo)下維持 Ⅰ 型IFN分泌；同時，在HMGB1釋放到細胞外空間之前，IFN通過驅(qū)動HMGB1從細胞核到細胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運來調(diào)節(jié)HMGB1的分泌[28]；Ⅰ型IFN可通過激活JAK激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1信號通路誘導(dǎo)這一過程[29]。

2.2HMGB1與適應(yīng)性免疫應(yīng)答

2.2.1HMGB1與B細胞 B細胞過度活化產(chǎn)生大量自身抗體是SLE發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，HMGB1可促進B細胞活化。Tian等[26]研究表明，HMGB1可與A類CpG-ODN結(jié)合形成復(fù)合物，在RAGE和TLR9的介導(dǎo)下激活B細胞產(chǎn)生自身抗體，進而促進自身免疫應(yīng)答，提示HMGB1可能通過與RAGE結(jié)合介導(dǎo)CpG-ODN內(nèi)吞，隨后被胞質(zhì)中TLR9識別來促進B細胞活化。但是，當B細胞直接通過B細胞抗原受體識別抗原時則無需RAGE介導(dǎo)。Avalos等[30]研究顯示，HMGB1-DNA復(fù)合物只有在與IgG2a結(jié)合的情況下才能與B細胞抗原受體結(jié)合，進而激活B細胞；為了確定RAGE在自身反應(yīng)性B細胞活化中的作用，研究者將AM14和RAGE缺陷小鼠進行雜交，發(fā)現(xiàn)自發(fā)和限定的DNA免疫復(fù)合物激活RAGE陽性和RAGE陰性AM14 B細胞的程度相當，提示HMGB1通過RAGE非依賴機制促進B細胞對內(nèi)源性TLR9配體的反應(yīng)。

2.2.2HMGB1與T細胞 T細胞可以分為不同的亞群，其亞群比例失調(diào)及功能異常參與SLE發(fā)病[31]。SLE患者CD4+T細胞的功能異常與CD11a和CD70基因調(diào)控區(qū)的DNA甲基化不足有關(guān)。SLE患者CD4+T細胞HMGB1基因和蛋白表達均顯著升高，且HMGB1信使RNA與CD11a、CD70信使RNA呈正相關(guān)，提示HMGB1可能通過與生長阻滯和DNA損傷基因45A結(jié)合參與SLE體內(nèi)CD4+T細胞的DNA去甲基化過程[32]。調(diào)節(jié)性T細胞是輔助性T細胞(helper T cell，Th細胞)的亞群，是維持機體免疫耐受的重要因素之一；SLE患者體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量減少和功能受損有助于效應(yīng)T細胞的活化[33]。HMGB1可通過與其受體RAGE和TLR4結(jié)合，增強磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而損害調(diào)節(jié)性T細胞的穩(wěn)定性并導(dǎo)致其功能異常[34]。Th2細胞和Th17細胞是Th細胞的兩個亞群，Th2細胞可促進體液免疫應(yīng)答，Th17細胞促進自身免疫應(yīng)答，均與SLE發(fā)病密切相關(guān)。HMGB1可通過與受體TLR2、TLR4和RAGE結(jié)合，激活核因子κB信號通路，進而誘導(dǎo)CD4+T細胞向Th2、Th17細胞分化[35]。

2.3HMGB1與狼瘡性腎炎(lupus nephitis，LN) LN是SLE最常見且嚴重的并發(fā)癥，50%～70%的SLE患者病程中會出現(xiàn)臨床腎臟受累表現(xiàn)，幾乎所有SLE患者的腎活檢均顯示腎臟病理學(xué)改變[36]。HMGB1與LN發(fā)病相關(guān)，LN患者腎臟HMGB1表達增加，且活動期LN患者HMGB1表達水平高于非活動期LN患者；尿HMGB1水平與SLE疾病活動度評分呈正相關(guān)，與補體C3、C4呈負相關(guān)，膜性LN患者尿HMGB1水平高于增生型和混合型LN患者；活動期LN患者腎組織細胞質(zhì)和細胞外HMGB1的表達增加，提示HMGB1釋放活躍[37-39]。

腎小球系膜細胞增殖及系膜基質(zhì)沉積是LN發(fā)生發(fā)展的重要病理過程，而HMGB1能促進以上病理過程。敲低腎組織HMGB1表達可改善MRL/lpr小鼠腎功能，降低腎小球細胞的增殖水平[40]。體外研究亦證實，人重組HMGB1刺激后，人系膜細胞增殖水平明顯升高，同時腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白3和p65蛋白表達水平明顯升高，提示HMGB1可能通過活化腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白3和核因子κB信號通路促進LN系膜細胞過度增殖[41]。HMGB1誘導(dǎo)的LN腎小球細胞增殖可能由TLR2受體通過叉頭框蛋白O1信號通路介導(dǎo)。MRL/lpr小鼠腎小球TLR2表達上調(diào)；體外實驗顯示，通過TLR2中和抗體或轉(zhuǎn)染shTLR2抑制TLR2表達均能減少叉頭框蛋白O1的核易位，降低HMGB1誘導(dǎo)的小鼠系膜細胞增殖[42]。此外，HMGB1在TLR2的介導(dǎo)下促進腎小球系膜基質(zhì)沉積。TLR2和HMGB1缺陷MRL/lpr小鼠均出現(xiàn)24 h尿蛋白水平降低，腎小球病理改變和硬化程度改善；體外研究顯示，重組HMGB1可促進人系膜細胞分泌纖連蛋白，而抑制TLR2或HMGB1表達均可抑制LN血漿誘導(dǎo)的髓樣分化因子88/核因子κB通路活化和纖連蛋白分泌[43]。HMGB1亦能在RAGE的介導(dǎo)下促進腎小球系膜細胞外基質(zhì)沉積。LN患者腎組織RAGE與Ⅳ型膠原蛋白(collagen Ⅳ，ColⅣ)的表達水平均明顯上調(diào)，且兩者呈明顯正相關(guān)；免疫共沉淀和Westernblot結(jié)果顯示，HMGB1可與人系膜細胞表面的RAGE結(jié)合并上調(diào)RAGE的表達[44]。

2.4HMGB1與神經(jīng)精神性SLE(neuropsychiatric systemic lupus erythematosus，NPSLE) 神經(jīng)系統(tǒng)是SLE患者的主要受累系統(tǒng)之一。NPSLE的患病率尚不明確，有資料表明，NPSLE影響12%～95%的SLE患者[45]。NPSLE的臨床表現(xiàn)呈高度多樣化，可影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)，認知障礙是其常見的臨床表現(xiàn)。NPSLE患者血清HMGB1水平較非NPSLE患者升高，提示血清HMGB1水平可能預(yù)測NPSLE發(fā)生[46]。小膠質(zhì)細胞在NPSLE發(fā)病中發(fā)揮重要作用。在大腦中，HMGB1通過與受體RAGE或TLR4結(jié)合促進小膠質(zhì)細胞活化；而且，HMGB1可以橋接C1q與N-甲基-D-天冬氨酸受體結(jié)合，促進小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的樹突修剪，導(dǎo)致空間記憶缺陷[47]。

3 靶向HMGB1治療SLE

HMGB1通過多種途徑參與SLE發(fā)病，可能是SLE的潛在治療靶點。動物實驗證實，通過轉(zhuǎn)染shHMGB1敲低MRL/lpr小鼠腎臟HMGB1基因表達后，小鼠腎損傷減輕[40]。靶向HMGB1治療的制劑主要包括中和性HMGB1單克隆抗體、重組HMGB1 A盒結(jié)構(gòu)域、抑制HMGB1向胞外分泌的化合物(如丙酮酸乙酯)以及可直接與HMGB1結(jié)合的小分子甘草酸等[4]。靶向HMGB1的動物研究結(jié)果不同。Zhang等[48]研究表明，抗HMGB1單克隆抗體治療可明顯降低狼瘡易感雄性BXSB小鼠蛋白尿和循環(huán)抗dsDNA抗體水平，減輕腎小球腎炎和免疫復(fù)合物沉積，并降低腎臟胱天蛋白酶1活性和小鼠死亡率。然而，Schaper等[49]研究表明，抗HMGB1單克隆抗體治療不影響MRL/lpr小鼠LN的發(fā)生、進展及促炎細胞因子水平；提示用該中和抗體封閉HMGB1對MRL/lpr小鼠LN無明顯影響。雖然SLE患者循環(huán)和受累組織中HMGB1增加，但是SLE患者血清亦能檢測到抗HMGB1抗體，且該抗體可能與SLE疾病活動度呈正相關(guān)[50-52]。因此，抗HMGB1單克隆抗體可能不是靶向HMGB1治療的可行選擇。

4 小 結(jié)

HMGB1可通過多種途徑參與SLE發(fā)病，既能直接作用于固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的免疫細胞(如單核巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞及淋巴細胞)，促進免疫細胞活化、促炎因子表達及自身抗體產(chǎn)生；亦可作用于腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)等受累組織中的局部細胞(如腎小球系膜細胞、小膠質(zhì)細胞)，導(dǎo)致局部細胞功能異常，加重受累組織病理改變，從而促進SLE的發(fā)生發(fā)展。因此，HMGB1可能是SLE的潛在治療靶點。但目前靶向HMGB1治療SLE的研究僅限于動物實驗，且不同研究的結(jié)果存在矛盾。因此，靶向HMGB1治療SLE的可行性和有效性仍有待進一步探索。