微粒在血栓性疾病中的研究進(jìn)展

孫宇婷，高春艷

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)(大慶)，黑龍江 大慶 163319)

隨著我國人口老齡化的進(jìn)一步加劇以及人們生產(chǎn)和生活方式的改變，血栓性疾病已經(jīng)逐漸成為嚴(yán)重威脅人類身體健康的疾病。根據(jù)發(fā)病部位，血栓性疾病可分為動脈血栓、靜脈血栓和微循環(huán)障礙等類型。血栓性疾病多由血管內(nèi)皮損傷、血液高凝狀態(tài)和血流緩慢等因素引起。研究表明，微粒與血栓性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1-2]。微粒是細(xì)胞活化或凋亡時細(xì)胞膜表面釋放的直徑為0.1～1 μm的囊泡，來源于血小板、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及癌細(xì)胞。正常人循環(huán)中有一定數(shù)量的微粒，血栓性疾病患者循環(huán)微粒水平顯著高于正常人[1-2]。微粒不僅能表達(dá)具有很強(qiáng)促凝活性的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)和組織因子，而且還富含親代細(xì)胞抗原和信使RNA等多種生物活性物質(zhì)[3]。微粒通過表面相互作用、受體激活和細(xì)胞融合等方式作用于靶細(xì)胞，繼而影響血栓性疾病的進(jìn)程[4]?，F(xiàn)就微粒在血栓性疾病中的研究現(xiàn)狀以及作用機(jī)制進(jìn)行綜述，以期更好地預(yù)防和治療血栓性疾病。

1 微粒的概述

1.1微粒的產(chǎn)生 微粒是細(xì)胞活化或凋亡的產(chǎn)物。在靜息狀態(tài)下，細(xì)胞自發(fā)的跨膜雙分子層的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)非常緩慢。磷脂在脂質(zhì)上分布的不對稱性是靜息細(xì)胞的共同特征：PS和磷脂酰乙醇胺被限制于質(zhì)膜的內(nèi)側(cè)；磷脂酰膽堿、神經(jīng)鞘磷脂和鞘糖脂等被隔離到質(zhì)膜外側(cè)。這種不對稱性是內(nèi)向翻轉(zhuǎn)酶和外向翻轉(zhuǎn)酶的相反活動以及非特異性雙向ATP非依賴性脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體共同作用的結(jié)果。當(dāng)細(xì)胞受凝血酶或鈣離子激動劑等刺激導(dǎo)致細(xì)胞活化或凋亡時，內(nèi)向翻轉(zhuǎn)酶發(fā)生鈣依賴性抑制，外向翻轉(zhuǎn)酶和非特異性雙向ATP非依賴性脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體被激活，導(dǎo)致PS外翻[5]。細(xì)胞骨架的鈣依賴性蛋白水解導(dǎo)致質(zhì)膜內(nèi)外側(cè)的磷脂水平的最終瞬態(tài)失衡：PS外翻、磷脂酰膽堿水平降低和神經(jīng)鞘磷脂逆向轉(zhuǎn)運(yùn)[6]。這些引起質(zhì)膜的不穩(wěn)定以及微粒釋放。另外，鈣依賴性通道TMEM16F是一種八跨膜蛋白，其在鈣離子引起的血小板微粒形成過程中起關(guān)鍵作用[7]。

1.2微粒的生物學(xué)功能 微粒具有很強(qiáng)的促凝活性，其促凝血功能與PS和組織因子的表達(dá)有關(guān)。微粒暴露的PS與凝血因子FⅤ、FⅧ的C樣結(jié)構(gòu)域選擇性結(jié)合，為凝血因子FⅤ、FⅧ和FⅩ的活化提供催化表面，促進(jìn)凝血酶的生成[8]。其次，微粒暴露的組織因子是人體內(nèi)生理性凝血的主要啟動因子，通過與凝血因子FⅦ/Ⅶa的相互作用啟動外源性凝血[9]。血小板衍生微粒的促凝血活性是活化血小板的50～100倍[10]。這些特性是微粒在止血的生理過程和血栓形成的病理過程中起作用的基礎(chǔ)。不僅如此，微粒攜帶的生物活性物質(zhì)使其具有更為廣泛的作用，包括致動脈粥樣硬化、促炎、免疫調(diào)節(jié)，甚至抗凝。

1.3微粒的檢測 隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，越來越多方便快捷的技術(shù)被用于微粒的鑒定。目前微粒的檢測技術(shù)包括流式細(xì)胞術(shù)、電子顯微鏡觀察、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、蛋白組學(xué)技術(shù)等。

1.3.1流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù)是檢測微粒最常用的方法。一般情況下，通過已知大小的標(biāo)準(zhǔn)微球(直徑為1 μm的標(biāo)準(zhǔn)微球)設(shè)門，確定微粒在流式散點(diǎn)圖中的位置。由于膜聯(lián)蛋白與微粒的親和性，在研究中常用帶有熒光染料的膜聯(lián)蛋白來定義微粒。另外，由于不同種類的微粒也攜帶有各自親代細(xì)胞的表面標(biāo)志物，如血小板膜糖蛋白CD41a、內(nèi)皮細(xì)胞膜糖蛋白CD31等。膜糖蛋白與帶有熒光染料的膜聯(lián)蛋白聯(lián)合檢測常用來確定微粒的來源。膜聯(lián)蛋白在微粒的檢測中廣為應(yīng)用，但膜聯(lián)蛋白檢測微?？赡艽嬖诘膯栴}是微粒會在流式分析之前發(fā)生標(biāo)本的“微凝集”。這是由于膜聯(lián)蛋白檢測微粒時需要加入鈣離子，鈣離子的加入可引起凝血級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，最終導(dǎo)致纖維蛋白凝塊“微凝集”形成，其形成大大減少了流式細(xì)胞儀檢測到的微粒數(shù)量[11]。有學(xué)者使用帶有熒光標(biāo)記的乳黏素檢測微粒[12-13]。乳黏素與微粒有較強(qiáng)的親和性，且乳黏素與微粒結(jié)合時不需要鈣離子的介入，該特點(diǎn)使乳黏素檢測微粒更不易受鈣離子的影響。在不考慮經(jīng)濟(jì)因素的情況下，乳黏素較膜聯(lián)蛋白更加適合檢測微粒。

1.3.2酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)也可用來檢測微粒。一種方法是將膜聯(lián)蛋白包被在微孔板的底部，然后將待測物加入微孔板中，清洗微孔板后，再次向微孔板中加入凝血酶原、Ⅹa因子、Ⅴa因子以及鈣離子的混合物。微粒表面的PS可使凝血酶原在Ⅹa因子和Ⅴa因子的存在下活化為凝血酶。凝血酶的生成量利用特定的顯色底物測定[14]。另一種方法是微粒結(jié)合到膜聯(lián)蛋白包被的微孔板后，由于微粒表面暴露組織因子，利用組織因子的抗體及過氧化物酶檢測微孔板中微粒的水平[15-16]。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的靈敏度不高，且無法明確微粒的數(shù)量，雖然較流式細(xì)胞術(shù)更為經(jīng)濟(jì)、實(shí)惠，但實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性無法保障。

2 微粒與血栓性疾病

2.1急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS) ACS是冠狀動脈粥樣斑塊破裂引起的血栓性疾病，通常由動脈粥樣硬化遷延而來。ACS患者的循環(huán)中具有高水平的微粒。巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞是粥樣斑塊微粒的主要來源。微粒的促凝活性參與了ACS的發(fā)生發(fā)展。Liu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，ACS患者的微粒水平是健康對照者的2.5倍，這些微粒表達(dá)的PS和組織因子通過啟動凝血級聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)血栓形成。此外，微粒還通過促炎作用參與ACS的發(fā)展。Mavroudis等[18]對將要進(jìn)行經(jīng)皮冠狀動脈介入治療的ACS患者的冠狀動脈和右心房處的微粒水平和來源進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，病變處冠狀動脈總體微粒水平較高，微粒部分來自白細(xì)胞。病變處冠狀動脈具有更高水平的CD62P陽性和CD62E陽性微粒，這些微粒增加了血管炎癥的可能性：CD62P陽性微粒通過進(jìn)一步募集表達(dá)P-選擇素糖蛋白配體的炎癥細(xì)胞而促進(jìn)病變進(jìn)展[19]；CD62E陽性微粒與P-選擇素糖蛋白配體結(jié)合介導(dǎo)炎癥細(xì)胞與活化內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用[20]；中性粒細(xì)胞衍生的微?？赏ㄟ^與活化的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，放大血管炎癥反應(yīng)[21]。Diehl等[22]研究發(fā)現(xiàn)，溶血磷脂酰膽堿是血小板衍生微粒的主要成分，通過與血小板受體G2A受體相互作用，促進(jìn)血小板的活化、擴(kuò)散、遷移和聚集，最終導(dǎo)致血管炎癥。該研究還發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定或破裂的小鼠模型中，溶血磷脂酰膽堿可作為斑塊不穩(wěn)定的替代標(biāo)志物。同樣，人的溶血磷脂酰膽堿在易損斑塊區(qū)也有較高的水平。推測微粒不但促進(jìn)了血管炎癥的發(fā)生，還與斑塊不穩(wěn)定性密切相關(guān)，微粒的產(chǎn)生增加了斑塊的不穩(wěn)定性，提高了ACS的發(fā)病風(fēng)險。除促炎和促凝外，微粒還可通過攜帶信使RNA的方式促進(jìn)ACS的發(fā)展。Liu等[23]發(fā)現(xiàn)，包裝有miR-92a-3p的內(nèi)皮細(xì)胞衍生微粒在ACS患者中顯著增加，這些微粒促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞或血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖，加劇了動脈狹窄。綜上所述，微粒在ACS的發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色，通過促炎、促凝和細(xì)胞間信息通信等方式參與疾病的發(fā)展。

2.2缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS) IS是目前致殘率極高的疾病之一，是由于腦的供血動脈狹窄、栓塞、腦供血不足導(dǎo)致的腦組織壞死。微粒通過促凝和促炎作用參與了IS的發(fā)展。Yao等[24]研究發(fā)現(xiàn)，IS循環(huán)中高水平的微粒通過暴露PS和組織因子促進(jìn)血栓形成。He等[25]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照者相比，IS患者循環(huán)中白細(xì)胞衍生微粒數(shù)量增加，這些微粒通過炎癥作用促進(jìn)IS的發(fā)展。白細(xì)胞衍生微粒的促炎作用主要通過升高腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-6、活化蛋白C和白細(xì)胞介素-1β等炎癥因子的水平實(shí)現(xiàn)[26]。單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞衍生的微粒誘導(dǎo)核因子κB易位到細(xì)胞核中，導(dǎo)致白細(xì)胞介素-8產(chǎn)生增加[27]。另外，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞衍生的微粒還可誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞微粒的產(chǎn)生[28]。微粒不僅促進(jìn)了IS的發(fā)生發(fā)展，還可調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和再生。Varon等[29]發(fā)現(xiàn)，活化的血小板釋放的微粒能夠增強(qiáng)內(nèi)源性神經(jīng)祖細(xì)胞和干細(xì)胞血管的生成以及神經(jīng)發(fā)生，有助于IS后的神經(jīng)修復(fù)。Pan等[30]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞衍生微粒對血腦屏障發(fā)揮作用。在IS的疾病過程中，常有血腦屏障的破壞，星形膠質(zhì)細(xì)胞參與了血腦屏障的組成。正常培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的內(nèi)皮細(xì)胞衍生微粒促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，改善局部腦血流量，減少梗死體積；而在氧氣和葡萄糖剝奪的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的內(nèi)皮細(xì)胞衍生微粒對星形膠質(zhì)細(xì)胞有完全相反的作用[30]。推測微粒在IS中不僅僅促使疾病惡化，其對神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)也減輕了IS對機(jī)體的損害。

2.3靜脈血栓栓塞(venous thromboembolism，VTE) VTE是指血液在靜脈內(nèi)病理性凝結(jié)導(dǎo)致血管完全或不完全阻塞，屬靜脈回流障礙性疾病。VTE包括深靜脈血栓形成和肺血栓栓塞癥。手術(shù)外傷、限制活動或靜脈功能不全引起的靜脈瘀滯等是導(dǎo)致VTE的病理性原因，以上因素易引起各種凝血因子和促凝物質(zhì)在病變部位濃縮，促進(jìn)VTE發(fā)生。癌癥引起的VTE是近年研究的熱點(diǎn)，而VTE也是癌癥患者的常見并發(fā)癥。許多研究探討了來自癌細(xì)胞和癌癥患者的微粒的促凝機(jī)制，但研究大多集中在組織因子的作用上。癌癥患者組織因子陽性微粒的表達(dá)與VTE的發(fā)生發(fā)展可能存在相關(guān)性。Timp等[31]研究發(fā)現(xiàn)，癌癥患者VTE的風(fēng)險增加了4～7倍，這是由于循環(huán)中腫瘤細(xì)胞衍生的組織因子陽性微粒引起了高凝狀態(tài)。Hisada等[32]將人源性胰腺癌細(xì)胞衍生微粒(pancreatic cancer cell-derived microparticle，pcMP)注入小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，pcMP促進(jìn)了小鼠的VTE。目前，許多研究者已就腫瘤細(xì)胞衍生的組織因子陽性微粒促進(jìn)VTE形成達(dá)成了共識。Stark等[33]認(rèn)為，癌癥相關(guān)VTE的發(fā)病機(jī)制為：①pcMP衍生的組織因子不足以誘導(dǎo)VTE；②活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞可能提供了部分組織因子，這些組織因子與pcMP衍生的組織因子協(xié)同促進(jìn)了VTE的發(fā)生；③磷脂酰乙醇胺支持FⅩa的生成，對pcMP的促凝血活性有重要作用。Stark等[33]的研究結(jié)果與公認(rèn)的“腫瘤細(xì)胞衍生組織因子陽性微粒促進(jìn)VTE”有所不同，說明微粒促進(jìn)癌癥相關(guān)VTE的機(jī)制仍不完全清楚，需進(jìn)一步探究。

2.4抗磷脂綜合征(antiphospholipid-antibody syndrome,APS) APS是一種以反復(fù)動脈或靜脈血栓、病態(tài)妊娠和抗磷脂抗體持續(xù)陽性為特征的疾病。APS的實(shí)驗(yàn)室檢查中有診斷價值的抗磷脂抗體包括狼瘡抗凝物、抗心磷脂抗體和抗β2-糖蛋白Ⅰ(β2-glycoprotein Ⅰ，β2GPⅠ)抗體[34]。β2GPⅠ是APS的主要抗原。一直以來人們對微粒在APS中作用的認(rèn)識僅限于β2GPⅠ參與清除循環(huán)中的微粒以及APS患者體內(nèi)產(chǎn)生的微粒能夠促進(jìn)血栓形成[35]。Mobarrez等[36]提出了新觀點(diǎn)，認(rèn)為PS陰性微粒的積累可能參與了APS的發(fā)病機(jī)制，APS患者具有較健康對照者更低水平的β2GPⅠ陽性微粒。據(jù)推測，這可能是由于β2GPⅠ先與微粒表達(dá)的PS特異性結(jié)合，導(dǎo)致抗β2GPⅠ抗體與β2GPⅠ-PS的復(fù)合物結(jié)合。這一過程導(dǎo)致循環(huán)中β2GPⅠ陽性微粒水平降低，PS陰性微粒積累，微粒可能成為自身抗原的來源。以往很少有研究關(guān)注PS陰性微粒對APS的影響，Mobarrez等[36]的研究為APS的發(fā)病機(jī)制研究提供了新思路。

3 小 結(jié)

流式細(xì)胞術(shù)是目前檢測微粒最常用的方法。微粒暴露的PS和組織因子通過內(nèi)源性和外源性凝血途徑促進(jìn)血栓的形成。不僅如此，微粒還通過促炎、致動脈粥樣硬化、細(xì)胞間信息通信等多種方式影響了ACS、VTE和IS等血栓性疾病的進(jìn)程。近年來，越來越多的研究致力于將微粒作為血栓性疾病的生物標(biāo)志物，但現(xiàn)今微粒的檢測技術(shù)還存在較多缺點(diǎn)，未來需進(jìn)一步優(yōu)化微粒的檢測技術(shù)。明確微粒在血栓性疾病中的作用機(jī)制，有助于預(yù)防和診斷血栓性疾病，以期降低血栓性疾病的發(fā)病率和致死率。