從HBV X蛋白的生物學功能看靶向HBx臨床治愈慢性乙型肝炎的可能性

許梓萌 李德瑤 席婧媛 魯鳳民

乙型肝炎病毒(HBV)屬嗜肝DNA病毒，由其引起的慢性HBV感染是慢性乙型肝炎(CHB)的重要病因。據(jù)統(tǒng)計2015年全球仍有約2.57億慢性HBV 感染者，每年約88.7萬人死于慢性HBV感染所致的肝硬化、肝功能衰竭和肝細胞癌(HCC)[1]。CHB的臨床治愈面臨巨大挑戰(zhàn)。CHB難以治愈與其獨特的病毒復制過程及感染肝細胞廣泛存在HBV基因組DNA片段整合有關[2-3]。HBV基因組有兩種不同形式，其一為長約3.2 kb的松弛環(huán)狀不完全雙鏈DNA(rcDNA)，主要存在于具有感染性的、帶有包膜的完整病毒顆粒(Dane顆粒)和裸核衣殼內；其二為以游離的微小染色體形式存在于感染肝細胞核內的共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)。除此之外，HBV DNA還以亞基因組片段廣泛整合到肝細胞染色體DNA上。這種整合與肝癌的發(fā)生密切相關，但其對HBV復制的生物學意義尚不清楚。近期的研究顯示，對于長期接受核苷(酸)類藥物(NAs)抗病毒治療的CHB患者及HBeAg陰性患者，整合HBV DNA片段可能是其血清HBsAg的主要來源[4]。以微小染色體形式存在于感染肝細胞細胞核內的cccDNA是產(chǎn)生和維持病毒慢性感染主要原因[5]。由于NAs 僅通過抑制HBV逆轉錄和子代病毒DNA產(chǎn)生，其對cccDNA并無直接作用，在血清HBV DNA檢測不到的情況下，NAs治療的患者肝組織內cccDNA可能仍在轉錄和表達病毒蛋白，并導致停藥后復發(fā)[6]。近期研究發(fā)現(xiàn)，作為病毒共轉錄調控蛋白，HBx在cccDNA的轉錄激活和維持以及HBV相關肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[7-8]。因此，以靶向HBx蛋白的CHB治療成為新的研究熱點[9-10]。本文主要介紹HBx在HBV復制中的作用，并簡述靶向HBx藥物的研究進展。

一、HBx的結構及來源

已知的嗜肝DNA病毒屬由人HBV，鴨乙型肝炎病毒(DHBV)、土撥鼠肝炎病毒(WHV)等組成。上述病毒的基因組構成在不同種屬間高度保守，DHBV缺乏表達HBx的開放閱讀框架，也不表達HBx蛋白。人HBx蛋白含154個氨基酸，由具有負調控作用的氨基末端結構域和反式激活或共激活作用的羧基末端結構域組成，存在于感染肝細胞的細胞質和細胞核中[11]。由于既往對HBV病毒學特征的了解多來自于DHBV模型，因此在很長一段時間內，人們對HBx的功能知之甚少。直到2009年Belloni等[12]發(fā)現(xiàn)HBx可結合并調節(jié)cccDNA微染色體的表觀遺傳修飾，進而調節(jié)其轉錄，人們才重新開始關注HBx蛋白。2011年，Lucifora等[7]對人HBV感染早期事件的細致分析揭示，盡管帶有HBx表達缺失突變的rcDNA能入核并形成cccDNA，但該cccDNA往往缺乏轉錄活性，不能建立有效感染。該研究還證實，對于已建立感染的cccDNA，其轉錄活性的維持仍然需要HBx蛋白存在。除此之外，HBx還可激活肝細胞內的多種信號通路，分別對HBV復制產(chǎn)生不同影響[13-14]。以上研究充分說明HBx蛋白在HBV有效感染建立和感染病毒持續(xù)復制的維持中都發(fā)揮重要作用。

傳統(tǒng)認為，HBx蛋白由0.7 kb的X轉錄本翻譯而來。但后期的研究發(fā)現(xiàn)，除了經(jīng)典的5種HBV RNA外，在感染肝細胞內還存在3.9 kb的超長轉錄本，我們實驗室近期的一項對HBV 轉錄本的長測序結果也證實了這一點[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，在HBV感染早期，0.7 kb HBx mRNA雖然存在，但隨著感染的建立很快消失，而3.9 kb mRNA在感染過程中持續(xù)存在[16]。我們近期的體外轉錄組學全長測序證實，3.9 kb 轉錄本在豐度上遠遠高于0.7 kb HBx mRNA[15]。由于3.9 kb mRNA上存在完整的HBx編碼讀框，人們推測該3.9 kb的超長轉錄本可能翻譯HBx。通過轉染3.9 kb mRNA表達質粒檢測HBx的表達，Gilad Doitsh等[16]發(fā)現(xiàn)3.9 kb mRNA的確能夠表達HBx，但其自身出核相對較慢。

二、HBx促進和維持HBV cccDNA活躍轉錄的分子機制

HBV基因組較小，攜帶的遺傳信息有限，需通過與宿主細胞內蛋白相互作用以促進其復制。HBx是HBV產(chǎn)生的主要調節(jié)蛋白，可與多種細胞因子、轉錄相關酶相互作用，促進cccDNA轉錄或解除宿主因子對cccDNA轉錄的抑制[17]。

(一)HBx調節(jié)cccDNA結合組蛋白的化學修飾 HBV cccDNA與組蛋白、非組蛋白結合形成微小染色體，以附加體(episome)的形式存在于細胞核中。并且與宿主細胞染色質結構相似，cccDNA也可以被宿主表觀遺傳相關蛋白修飾，其轉錄活性和宿主染色質一樣受染色質結構和修飾的影響。在感染肝細胞核內，與HBV cccDNA啟動子結合的組蛋白H3被低乙?；图谆惾旧|蛋白募集，從而使cccDNA轉錄被抑制。而HBx則可將CREB結合蛋白(CBP)、p300和p300/CBP相關因子等組蛋白乙酰轉移酶募集到cccDNA上，促進組蛋白乙酰化以維持cccDNA的活躍轉錄[12]。HBx還能夠將賴氨酸特異性去甲基酶-1(Lysine-specific demethylase-1，LSD1)和賴氨酸甲基轉移酶Set1A招募到病毒啟動子上，兩者分別通過抑制H3K9me2去甲基化和積聚激活H3K4me3來激活病毒轉錄[18]。除此之外，HBx還能夠抑制SETDB1介導的H3K9me3修飾和異染色質蛋白HP1在染色質上的蓄積，從而消除H3K9me3和HP1導致的cccDNA轉錄沉默，使致密超螺旋的非活性染色質轉換為活性狀態(tài)[19]。

(二)HBx促進SMC5/6的降解 真核細胞內的染色體結構維持復合物5/6(SMC5/6)對鏈狀DNA具有親和力，并以ATP依賴方式的使其固縮，降低DNA的轉錄活性。由于cccDNA與宿主雙鏈DNA結構相似，SMC5/6作為宿主限制因子也能夠抑制cccDNA的轉錄[20-21]。HBx蛋白通過與宿主DNA損傷結合蛋白1(Damage specific DNA binding protein 1，DDB1)，并通過后者招募SMC5/6并使之泛素化降解，從而解除SMC5/6對cccDNA轉錄的抑制作用[22-23]。

(三)HBx與 YY1等的空間互作介導cccDNA轉錄激活 細胞核作為一個空間，同一染色體內和不同染色體間的遠距離相互作用已被證明能使廣泛分離的功能性DNA元件在空間上緊密接近，并在這些元件之間產(chǎn)生相互作用。染色體元件之間的相互作用往往需要一種或多種細胞蛋白質參與，如轉錄因子CTCF、黏連蛋白和陰陽1(YY1)。YY1是一種細胞內普遍存在的轉錄因子，通過其鋅指基序識別特定的DNA序列并與之結合，發(fā)揮轉錄調控作用，在細胞發(fā)育、分化、增殖和凋亡中起作用。人染色體19p13.11區(qū)域包含一個強活性的增強子元件(http://genome.ucsc.edu)，我們近期的一項研究發(fā)現(xiàn)，YY1蛋白介導了19p13.11增強子與HBV cccDNA之間的空間相互作用，并在病毒蛋白HBx的協(xié)調作用下使cccDNA轉錄激活[24]。這與我國張鵬遠等[25]有關HBV cccDNA與宿主染色體上的高活性轉錄位點的報道相契合。近期，來自李文輝實驗室的另外一項研究對HBx缺失的cccDNA肝細胞核染色質定位，也發(fā)現(xiàn)轉錄靜默的cccDNA在空間上存在于19號染色體上與19p13.11增強子區(qū)域相毗鄰的轉錄靜默區(qū)域[26]?？偠灾@些研究為cccDNA微染色體通過與細胞染色體的空間相互作用調控其自身轉錄和HBV復制提供了實驗證據(jù)。

三、整合來源的HBx截短體及其在HBV相關疾病中的作用

關于HBV整合的研究發(fā)現(xiàn)，除cccDNA外，整合的HBV基因組也可能表達羧基端截短的、融合未知氨基酸序列的HBx蛋白[27]。整合的HBV基因組通常具有HBx啟動子(XP)，能夠起始HBx mRNA的轉錄，但不具有polyA信號位點，因此轉錄本可以越過HBV-宿主基因連接部分，借由宿主基因上的polyA信號終止。融合轉錄本上的融合HBx ORF終止密碼子往往并非HBx本身的終止密碼子，而是宿主序列上的終止密碼子[28]。HBx的羧基端區(qū)域對于HBx蛋白的線粒體定位不可或缺，該結構域參與了多種細胞質信號轉導途徑的激活，因此，羧基端截短的HBx蛋白調控細胞增殖和轉錄活性的能力可能有所改變[28-29]。有研究發(fā)現(xiàn)與全長HBx相比，羧基端截短的HBx在HBV相關的HCC中表達更高，提示截短的HBx在HCC發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮更重要的作用[30]。HBx截短蛋白與p53結合并阻斷p53介導凋亡[31]。從肝癌細胞中分離出的HBx變體仍有維持cccDNA活躍轉錄的功能[32]，整合的HBV DNA表達羧基端缺失的HBx是否保有維持cccDNA轉錄的能力還有待進一步研究[27]。已有研究發(fā)現(xiàn)，保留完整DDB1結合域(aa88-100)的HBx截斷蛋白仍有可能結合DDB1并保護其自身免受蛋白酶體介導的降解[33-34]。HBx通過結合DDB1使SMC5/6被泛素化降解從而解除其對cccDNA轉錄的抑制作用[23]，來自整合表達的羧基端截短的HBx蛋白可能也參與了慢性HBV感染長期過程中cccDNA轉錄活性的維持和病毒復制。

四、靶向HBx的慢性乙肝抗病毒治療研究進展

聚乙二醇干擾素-α或正在開發(fā)的小干擾RNA(siRNA)可以通過清除包括HBx轉錄本在內的HBV mRNA促進SMC5/6重新出現(xiàn)，進而使cccDNA轉錄沉默[23]。干擾素誘導基因TRIM5γ可以促進K48連接的HBx蛋白K95泛素位點的泛素化降解，進而抑制HBV復制[35]。噻唑胺類抗感染藥物硝唑胺(NTZ)可有效抑制HBx-DDB1蛋白相互作用，顯著恢復SMC5蛋白水平，并抑制HBV轉錄和病毒蛋白的產(chǎn)生[36]。而RNA干擾可以整體降低由cccDNA產(chǎn)生的HBV RNA水平，進而全面抑制病毒復制，但設計時還需考慮到整合來源的HBV RNA，使之作用更為全面[37-38]。

黃愛龍團隊[9]報道了NAD(P)H:醌氧化還原酶1(NQO1)的抑制劑雙香豆素可劑量依賴性地降低HBx蛋白的表達。內源性NQO1能結合并保護HBx蛋白免受20S蛋白酶體介導的非泛素化途徑降解，當敲減NQO1或使用雙香豆素治療可以顯著減少HBx向cccDNA募集，使轉錄抑制因子SMC5/6蛋白再次出現(xiàn)，從而抑制cccDNA轉錄活性，阻斷HBV蛋白，HBx的致癌作用也被阻斷[9-10]。

直接抗病毒藥物(DAAs)帶來的丙型肝炎治愈為CHB治愈帶來了希望。但兩者維持慢性感染的機制截然不同，丙型肝炎病毒(HCV)主要通過持續(xù)的不間斷的復制來維持感染；對于HBV而言，由于其cccDNA相對較長的半衰期，再加上其有效的內補充機制，僅憑借現(xiàn)有藥物很難有效地實現(xiàn)CHB治愈。清除或沉默肝細胞核內的cccDNA可能是未來更有效的策略。而HBx具有多種生物學功能，無論是在cccDNA的轉錄調控以維持病毒的活躍復制、還是在HBV相關HCC的發(fā)生、發(fā)展中均發(fā)揮重要作用，因此以HBx為治療靶點的抗病毒策略可能是有前景的臨床治療策略。