鄧廉夫 邱明龍
骨發(fā)生發(fā)育及其骨形成依懶于軟骨內(nèi)化骨、膜內(nèi)化骨,以及貫穿其中的骨形狀適應(yīng)性變化的骨塑建過程。骨生長發(fā)育趨于終結(jié)后的骨組織,新骨的形成量及其形狀不再發(fā)生明顯的塑建性變化,而是以骨改建的方式,使骨形成和骨吸收處于動態(tài)平衡的狀態(tài)。這既可維持新舊骨組織的更替和正常骨構(gòu)筑的完整性,又有助于保證體內(nèi)礦物質(zhì)的水平及其生理性功能。
在骨塑建/骨改建過程中,先由破骨細(xì)胞“移除”陳舊骨組織,成骨細(xì)胞則隨之在“骨吸收陷窩”處形成新骨。周期性發(fā)生的骨吸收和骨形成不是隨機(jī)沿骨表面進(jìn)行的,而是分別由精確協(xié)調(diào)下的成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞發(fā)生在特殊的解剖部位和遵循著嚴(yán)格順序的生物學(xué)事件。
自出現(xiàn)成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成和發(fā)育的假說后,逐漸明晰的基本共識觀點(diǎn)認(rèn)為,成骨細(xì)胞除肩負(fù)“骨形成”的使命外,還可通過目前已知的巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Macrophage Colony stimulating Factor,M-CSF)和骨保護(hù)素/核轉(zhuǎn)錄因子-κB受體活化因子配體(osteoprotegerin/receptor activator of nuclear factor κB ligand,OPG/RANKL)二個關(guān)鍵調(diào)節(jié)途徑,決定著破骨細(xì)胞的生成與活性。成骨細(xì)胞分泌的M-CSF,首先賦予鄰近骨表面的單核細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞的潛能,成為破骨細(xì)胞前體細(xì)胞;成骨細(xì)胞產(chǎn)生的RANKL,則可趨化破骨細(xì)胞前體細(xì)胞募集至骨表面的骨吸收部位,并與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞膜表面的RANK結(jié)合,其信號經(jīng)細(xì)胞內(nèi)級聯(lián)反應(yīng),進(jìn)而調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞相互識別、逐漸融合并演化為成熟的破骨細(xì)胞而發(fā)揮骨吸收活性。與此同時,成骨細(xì)胞分泌RANKL的誘餌受體-OPG,二者結(jié)合后競爭性地阻礙RANKL與RANK相互作用,繼而抑制破骨細(xì)胞的分化和功能[1]。長期以來,有關(guān)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞功能的“耦聯(lián)”及其精細(xì)調(diào)節(jié)機(jī)制的研究,盡管在系統(tǒng)性、局部性和“耦聯(lián)”因子等方面獲得了理論認(rèn)識和以其為基礎(chǔ)的防治代謝性骨病的長足進(jìn)展,但隨研究深入,近十余年來逐漸向骨組織細(xì)胞生活的微環(huán)境方向聚焦。骨組織細(xì)胞處于低氧微環(huán)境,是其顯著特征之一[2]。
自發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor,HIFs)以來,這一反映生命活動氧依賴機(jī)制的重要組成部分,其意義和前景一直予以高度關(guān)注。HIFs是迄今發(fā)現(xiàn)的組織細(xì)胞在低氧狀態(tài)下誘生的最直接的唯一調(diào)控因子,包括3種亞型(HIF-1、HIF-2、HIF-3)。低氧對骨生物學(xué)特性的調(diào)節(jié)主要通過HIF-1及其氧感應(yīng)元件HIF-1α介導(dǎo)[3]。HIF-1α肽鏈序列中的脯氨酸殘基,在依賴氧、Fe2+、抗壞血酸等催化的脯氨酸-4-羥化酶(proline-4-hydroxylase,PHDs)作用下發(fā)生羥基化,羥基化的HIF-1α被稱之為腫瘤抑制蛋白(p tumor suppressor protein Von Hippel-Lindau,pVHL)識別、泛素化,最終被蛋白酶體降解。當(dāng)細(xì)胞處于低氧和/或Fe2+匱乏而導(dǎo)致PHDs的活性降低或失活時;或當(dāng)VHL表達(dá)降低乃至缺失時,其結(jié)果將引起HIF-1α聚積并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核,與核內(nèi)HIF-1β形成聚合體HIF-1,進(jìn)而激活涉及細(xì)胞不同功能的、眾多的HIF-1靶基因轉(zhuǎn)錄,從而引發(fā)組織細(xì)胞包括血管新生與重塑、葡萄糖和能量代謝、細(xì)胞增殖、凋亡、分化等一系列的耐氧適應(yīng)性分子反應(yīng)[4]。
骨組織細(xì)胞屬氧感應(yīng)細(xì)胞,在低氧或模擬低氧環(huán)境內(nèi)可表達(dá)HIF-1,進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞表型發(fā)生效應(yīng)性變化。采用條件性敲除成骨細(xì)胞Vhl基因小鼠的研究發(fā)現(xiàn),激活成骨細(xì)胞HIF-1α通路,HIF-1可直接觸發(fā)下游靶基因-血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá),誘導(dǎo)骨組織血管新生而“耦聯(lián)”骨形成過程,促進(jìn)骨形成[5]。隨后的研究進(jìn)一步表明,激活成骨細(xì)胞HIF-1α通路,因新生血管增加而促進(jìn)骨折愈合進(jìn)程中的骨痂形成[6-7];HIF-1α通路對成骨細(xì)胞的這種調(diào)節(jié)作用還可有效對抗因雌激素水平低下而引起的進(jìn)行性骨丟失[8]。骨組織中,與骨形成過程相“耦聯(lián)”的新生血管,主要是H型毛細(xì)血管。H型毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞,以豐度表達(dá)CD31、內(nèi)皮粘蛋白(endomucin)為特征,所營造的獨(dú)特微環(huán)境可介導(dǎo)骨生成細(xì)胞選擇性的定位其附近,促進(jìn)骨生成細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[9]。
改善骨微環(huán)境、提高細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)水平,將有益于促進(jìn)骨組織血管新生、建立新的血供,加速骨形成。然而,值得關(guān)注的問題是,條件性敲除成骨細(xì)胞Vhl基因而持續(xù)、高表達(dá)HIF-1α的小鼠,長骨骨量進(jìn)行性增加,至出生后6周齡小鼠的骨髓腔近乎完全被骨組織充填,表現(xiàn)為骨塑建/骨改建過程偏向過度骨形成的“失衡”現(xiàn)象,類似于“骨硬化癥(osteopetrosis)”的組織形態(tài)學(xué)特征[5]。
血液中的單核細(xì)胞可隨血流貼近(附)于骨組織表面,伺機(jī)生成破骨細(xì)胞并發(fā)揮骨吸收活性,以“平衡”骨塑建/骨改建過程[1]。因此,在成骨細(xì)胞HIF-1α通路激活后的骨形成“過度”增加,除通過誘導(dǎo)血管新生而促進(jìn)骨形成的機(jī)制外,還存在其它調(diào)控因素或原因。
1.激活成骨細(xì)胞HIF-1α通路可通過VEGF/HO-1作用途徑介導(dǎo)基質(zhì)干細(xì)胞成骨性分化:基質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)作為成骨細(xì)胞的補(bǔ)充源,其成骨性分化受多種因素調(diào)節(jié)。近年來有關(guān)MSCs低氧/HIF-1α通路直接參與調(diào)控其自身成骨性分化的研究結(jié)論,尚存有爭議甚至相悖[10-11]。貼附于骨表面的成骨細(xì)胞所產(chǎn)生的調(diào)節(jié)因子,釋放至骨髓腔可引起骨髓腔微環(huán)境的變化而調(diào)節(jié)骨髓細(xì)胞的分化方向。應(yīng)用條件性敲除Vhl基因的成骨細(xì)胞的上清液制備條件培養(yǎng)液,可刺激骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cell,BMSCs)表達(dá)血紅素氧化酶(heme oxygenase,HO)-1;隨HO-1表達(dá)量增加及其活性升高,BMSCs增殖活躍、成骨性標(biāo)志物表達(dá)水平升高;這一現(xiàn)象可因添加VEGF抗體被部分阻斷;而加入HO-1α激動劑可逆轉(zhuǎn)VEGF抗體對培養(yǎng)的BMSCs增殖和成骨性分化的抑制作用。研究表明,Vhl基因條件性敲除后激活HIF-1 通路的成骨細(xì)胞,分泌VEGF并釋放至骨髓腔,誘導(dǎo)BMSCs表達(dá)HO-1,進(jìn)而調(diào)節(jié)BMSCs優(yōu)先轉(zhuǎn)向成骨性分化,抑制其成脂性分化[12]。
2.激活成骨細(xì)胞HIF-1α通路可阻抑破骨細(xì)胞的生成和分化:低氧/HIF-1α通路直接調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的相關(guān)研究較少。模擬低氧環(huán)境以穩(wěn)定骨髓源性單核細(xì)胞HIF-1α的蛋白水平,可延遲單核細(xì)胞相互識別、逐漸融合的破骨細(xì)胞生成過程[13]。在條件性敲除成骨細(xì)胞Vhl基因小鼠的骨髓腔,白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-33的濃度明顯升高和破骨細(xì)胞數(shù)量顯著減少。體外進(jìn)一步就其發(fā)生機(jī)制的研究表明,因Vhl基因敲除而累積于成骨細(xì)胞胞漿的HIF-1α,入核后可直接結(jié)合于IL-33基因的啟動子并激活I(lǐng)L-33表達(dá);由成骨細(xì)胞分泌的IL-33,可抑制源于骨髓的單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化,其作用在破骨細(xì)胞分化的早期階段尤為明顯;IL-33抑制破骨細(xì)胞生成與分化的作用,是通過誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)miR-34a-5p,進(jìn)而激活Notch-1基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。由此,激活成骨細(xì)胞HIF-1α通路,可通過IL-33/miR-34a-5p/Notch1途徑抑制破骨細(xì)胞的生成與分化這一新的作用機(jī)制,參與調(diào)控骨塑建/骨改建過程[14]。
3.激活成骨細(xì)胞HIF-1α通路可延遲其向骨細(xì)胞演化的進(jìn)程進(jìn)而參與調(diào)節(jié)骨塑建/骨改建過程:成熟的成骨細(xì)胞將發(fā)生凋亡、演變?yōu)楣羌?xì)胞和轉(zhuǎn)化為襯里細(xì)胞3種歸宿。當(dāng)終末分化的成骨細(xì)胞被自身形成的骨基質(zhì)包埋后,即“演變”為骨細(xì)胞,歷經(jīng)以表達(dá)E11/gp38為標(biāo)志物的早期階段、以表達(dá)牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白(Dmp1)為標(biāo)志物的中期階段,分化發(fā)育為以表達(dá)骨硬化蛋白(sclerostin)為標(biāo)志物的晚期骨細(xì)胞。在骨細(xì)胞表型變化進(jìn)程中,細(xì)胞體積瘦身、漸狹長、變小,細(xì)胞骨架重排、膜突起數(shù)量進(jìn)行性增加(平均可多達(dá)80個左右的樹狀突起)。盡管僅10%~20%的成熟成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化為骨細(xì)胞,但與成骨細(xì)胞(數(shù)周)和破骨細(xì)胞(數(shù)天)的相對短暫存活和局限于分布骨表面所不同的是,骨細(xì)胞生存期可達(dá)25年或更久,廣泛分布于骨組織中。因此,成人骨組織中90%~95%為骨細(xì)胞。骨細(xì)胞胞體被埋于骨陷窩內(nèi),通過與骨陷窩連通的骨小管中的細(xì)胞突起,建立起骨細(xì)胞間、骨細(xì)胞與骨表面貼附的細(xì)胞間,以及骨細(xì)胞與骨微血管間廣泛的立體網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系,以保障骨細(xì)胞的活性及其功能發(fā)揮[15]。骨細(xì)胞作為膜性和可溶性RANKL、骨硬化蛋白的最主要來源而調(diào)節(jié)骨塑建/骨改建過程;這依賴于骨細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及其功能完整性、生物學(xué)信息的傳遞與應(yīng)答的準(zhǔn)確性[16]。
伴隨Vhl基因缺失而持續(xù)、高表達(dá)HIF-1α,顯示成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞演變、骨細(xì)胞的分化進(jìn)程延緩或受阻,骨組織欠成熟的現(xiàn)象。主要表現(xiàn)為成骨細(xì)胞多層排列(甚至堆積)于骨組織表面;在新生的大量骨基質(zhì)中,多角形、橢圓形骨細(xì)胞密度增加,胞體較飽滿、軸向性排列不明顯,甚至出現(xiàn)膜內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Osterix(Osx)陽性的幼稚成骨細(xì)胞;中、晚期骨細(xì)胞數(shù)量明顯降低,細(xì)胞突起短、少,缺乏典型的樹突狀突起及突起間網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系的特征;骨基質(zhì)中排列紊亂的膠原基質(zhì)堆積、鈣化不均或不完全,骨微生物力學(xué)性能下降[17]。鑒于骨細(xì)胞可調(diào)控其周圍類骨質(zhì)重塑與礦化,通過RANKL信號軸刺激破骨細(xì)胞吸收活性、骨硬化蛋白信號軸抑制成骨細(xì)胞生成及其成骨性能,進(jìn)而調(diào)控骨改建過程的獨(dú)特“樞紐”地位,骨細(xì)胞生成、發(fā)育、成熟的有序進(jìn)程延遲,可能是造成骨塑建/骨改建過程偏向骨形成"過度"增加,但并不成熟的組織學(xué)表現(xiàn)的主要原因之一。
骨組織細(xì)胞HIF-α通路的準(zhǔn)確應(yīng)答機(jī)制關(guān)乎骨穩(wěn)態(tài)及骨骼健康[18]。激活低氧/HIF-α通路可促進(jìn)骨形成的有益作用,正在引導(dǎo)藥用低氧模擬化合物的研發(fā)及骨病損的防治,并呈熱點(diǎn)研究內(nèi)容的發(fā)展趨勢[19-20]。針對隨增齡骨組織進(jìn)行性血供不足,基質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量減少及其成骨性分化潛能低下、破骨細(xì)胞骨吸收活性增強(qiáng)等特點(diǎn),應(yīng)用低氧模擬化合物以激活細(xì)胞HIF-1α通路,通過誘導(dǎo)血管新生、促進(jìn)基質(zhì)干細(xì)胞成骨性分化、抑制破骨細(xì)胞生成及其骨吸收活性等功效,可呈現(xiàn)促進(jìn)骨修復(fù)和防治骨退變的優(yōu)勢效果;但應(yīng)以低氧模擬化合物適量及其適時、適度刺激細(xì)胞表達(dá)HIF-1α為前提,以避免可能發(fā)生的新生骨組織“過度”形成、骨質(zhì)量欠佳的后果。
綜上所述, 低氧/低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1 通路對骨組織細(xì)胞生物學(xué)特性的調(diào)節(jié)作用,日趨受到關(guān)注。激活成骨細(xì)胞HIF-1 通路可通過誘導(dǎo)骨組織血管新生、介導(dǎo)基質(zhì)干細(xì)胞成骨性分化、阻抑破骨細(xì)胞生成及其骨吸收活性,以及延緩成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞演變及骨細(xì)胞分化進(jìn)程等,促進(jìn)骨形成和參與調(diào)節(jié)骨塑建/骨改建過程。但在藥用低氧模擬化合物的研發(fā)及其防治骨病損的應(yīng)用中,應(yīng)以適量、適時、適度調(diào)節(jié)細(xì)胞表達(dá)HIF-1α為前提,以規(guī)避可能發(fā)生的新生骨組織“過度”形成、骨質(zhì)量欠佳的后果。