后縱韌帶骨化癥發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展

賀中原 劉希哲 周治宇 劉少喻

后縱韌帶骨化癥(ossification of posterior longitudinal ligament,OPLL)是以脊柱韌帶異位骨化為特點(diǎn)的常見(jiàn)疾患[1]。亞洲人群較歐美常見(jiàn)，其中日本發(fā)病率最高，為1.9%～4.3%;中國(guó)人群發(fā)病率約為3.08%。發(fā)病以C5最為多見(jiàn)，其次為C4和C6。大多數(shù)OPLL發(fā)生在40歲以后，平均發(fā)病年齡50歲，男性發(fā)病幾乎是女性的兩倍[2-5]。隨著骨化的進(jìn)展，特別是骨化塊厚度的生長(zhǎng)導(dǎo)致頸椎管逐漸狹窄，脊髓和神經(jīng)組織受壓損傷，可導(dǎo)致不同程度四肢感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)、大小便障礙、植物神經(jīng)功能紊亂等臨床癥狀，甚至癱瘓[6-7]。目前對(duì)于后縱韌帶骨化癥機(jī)制的研究包括遺傳因素、內(nèi)分泌、生物力學(xué)因素、細(xì)胞內(nèi)外細(xì)胞因子作用、生活習(xí)慣等。

一、與OPLL相關(guān)的易感基因

研究提示OPLL并不遵循簡(jiǎn)單的單基因孟德?tīng)栠z傳模式。盡管遺傳模式不清楚，但在OPLL患者中似乎有很強(qiáng)的家族聯(lián)系，多個(gè)候選基因可能與遺傳有關(guān)。雖然這些研究對(duì)后縱韌帶骨化癥的病因和發(fā)病機(jī)制有一定解釋?zhuān)孕韪M(jìn)一步探索。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)產(chǎn)生疊加效應(yīng)增加對(duì)OPLL的易感性與OPLL發(fā)展密切相關(guān)。Kawaguchi等[8]證實(shí)BMP2基因在OPLL骨化韌帶中誘導(dǎo)軟骨和骨形成。Yan等[9]發(fā)現(xiàn)BMP2基因第2外顯子109T>G多態(tài)性與Smad4蛋白表達(dá)水平和ALP活性呈正相關(guān)，Smad介導(dǎo)的信號(hào)通路在BMP2基因SNPs誘導(dǎo)OPLL的病理過(guò)程中起重要作用，所以認(rèn)為BMP2是OPLL的易感基因；BMP4在中胚層誘導(dǎo)、牙齒發(fā)育、肢體形成和骨折修復(fù)中也有作用。研究為BMP4、BMP9基因多態(tài)性與OPLL的發(fā)生之間的聯(lián)系提供了證據(jù)，其證實(shí)單倍型不僅與患者OPLL的發(fā)生有關(guān)，而且與OPLL嚴(yán)重程度的增加有關(guān)[10-11]；BMP7基因影響骨骼和周?chē)|(zhì)礦化的通路[12]。BMP7功能缺陷可能同時(shí)導(dǎo)致成骨細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞分化減少，但與OPLL是否有關(guān)還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

TGF-β存在于OPLL軟骨細(xì)胞和鄰近軟骨區(qū)的骨化基質(zhì)中，但不存在于MSCs和非骨化韌帶中，提示它可能刺激異位骨化后期的骨形成。TGF-β基因，特別是TGF-β1，由于其在調(diào)節(jié)骨代謝中的重要性，它被認(rèn)為是增加個(gè)體對(duì)OPLL易感性的主要候選基因；其第1外顯子869T>C多態(tài)性在OPLL發(fā)病機(jī)制中的作用已被廣泛研究，但研究結(jié)果并不一致。Han等[12]認(rèn)為SNP 869T>C與OPLL的患病率沒(méi)有顯著關(guān)聯(lián)。但分層分析顯示，C等位基因?yàn)?69T>C的患者在頸椎、胸椎或腰椎中顯示OPLL的頻率更高[13]。

Nakamura等[14]發(fā)現(xiàn)NPPS基因中從內(nèi)含子20(IVS20-11delT)位點(diǎn)上游11個(gè)核苷酸位置的T缺失的個(gè)體更容易發(fā)生脊柱韌帶的異常骨化，這表明存在這種缺失與OPLL存在顯著關(guān)聯(lián)。研究OPLL最常見(jiàn)的動(dòng)物模型之一ttw(tiptoe walking)小鼠，表現(xiàn)出與人類(lèi)OPLL非常相似的韌帶骨化，它的表型也是由編碼核苷酸焦磷酸酶的Npps基因的無(wú)義突變(568甘氨酸變?yōu)榻K止密碼子)引起的，這種酶通過(guò)產(chǎn)生無(wú)機(jī)焦磷酸鹽調(diào)節(jié)軟組織鈣化和骨礦化[15-16]。

COL6A1已被鑒定為日本人OPLL的易感基因。Kong等[17]對(duì)338名中國(guó)漢族受試者進(jìn)行了COL6A1基因多態(tài)性的基因分型，認(rèn)為COL6A1多態(tài)性與中國(guó)漢族人群對(duì)黃韌帶骨化和OPLL的易感性有關(guān)。Wang等[18]也對(duì)30例中國(guó)漢族人群基因組測(cè)序，在白細(xì)胞介素17受體C(IL17RC)和膠原VIα1鏈(COL6A1)基因中發(fā)現(xiàn)了5個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)可能與縱韌帶骨化有關(guān)；COL11A2編碼的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白可能為成骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞提供支架，這些細(xì)胞隨后進(jìn)入膜性或軟骨內(nèi)成骨過(guò)程，提示COL11A2可能參與OPLL發(fā)病過(guò)程[19]。Wei等[20]對(duì)兩個(gè)不相關(guān)的中國(guó)南方城市OPLL患者進(jìn)行了全外顯子組測(cè)序(WES)，認(rèn)為COL17A1中的SNPs rs805698和rs4918079與OPLL顯著相關(guān)。

IL15RA、IL17RC基因多態(tài)性與骨量、肌肉力量和代謝綜合征等有遺傳關(guān)系。類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清和滑膜液中IL15水平明顯高于骨關(guān)節(jié)炎，與疾病活動(dòng)度相關(guān)。并且IL15通過(guò)IL15RA介導(dǎo)可促進(jìn)破骨細(xì)胞的發(fā)生。Kim[21]發(fā)現(xiàn)IL15RA的SNP(rs2228059,exon 4,Asn182Thr)與韓國(guó)人群OPLL易感性有關(guān)。同時(shí)Guo等[22]也發(fā)現(xiàn)IL15RA基因rs2228059的SNP與中國(guó)漢族人群(尤其是男性)OPLL易感性相關(guān)。IL17RC基因可能通過(guò)IL-17信號(hào)通路促進(jìn)成骨，可能參與OPLL的異位成骨過(guò)程。Wang等[23]發(fā)現(xiàn)IL17RC基因rs199772854A位點(diǎn)多態(tài)性是OPLL疾病的潛在致病突變。

成纖維生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor,FGF)介導(dǎo)骨形成的特征是間充質(zhì)細(xì)胞的復(fù)制和骨祖細(xì)胞向成熟成骨細(xì)胞的分化，并以成骨細(xì)胞凋亡結(jié)束。FGF通過(guò)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)控制多個(gè)與成骨細(xì)胞分化和凋亡相關(guān)的基因。Jun和Kim[24]研究發(fā)現(xiàn)FGFR1的SNP與OPLL顯著相關(guān)，F(xiàn)GF2中的SNP與OPLL 共病相關(guān)。

根據(jù)對(duì)OPLL雙生子和家族譜系的研究,Matsunaga等[25]報(bào)道了位于常染色體6上的易感人白細(xì)胞抗原(HLA),就此推斷OPLL遺傳因子位于常染色體6上。OPLL患者與正常人群相比某些調(diào)控骨、軟骨和韌帶代謝的多樣性基因出現(xiàn)的機(jī)率較高, 這些基因可能與OPLL的發(fā)生有關(guān)。除此之外還有許多與OPLL相關(guān)的易感基因，包括：VKORC1、BID、PTCH1、TLR5、ACE、AHSG、RXRB、IL-1β、VDR等。

二、與OPLL相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)外因子

細(xì)胞外間質(zhì)及體液成分是維持細(xì)胞正常增殖、分化、代謝和功能活動(dòng)的微環(huán)境，細(xì)胞內(nèi)外微環(huán)境的變化可以導(dǎo)致骨贅形成，而環(huán)境中的分子之間的相互作用是復(fù)雜的。Matsunaga和Sakou[26]認(rèn)為骨形成和代謝異常與OPLL高度相關(guān)，在OPLL病程中，激素、細(xì)胞內(nèi)外因子被認(rèn)為參與了骨形成和代謝的調(diào)節(jié)。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)是骨形成的重要調(diào)控因子。重組BMP-2已被證明可誘導(dǎo)大鼠異位骨化形成，并且在OPLL鄰近的軟骨細(xì)胞以及在軟骨區(qū)附近的成纖維間充質(zhì)細(xì)胞中；BMP2也參與了OPLL的形成。Tanaka等[27]從OPLL患者及非OPLL的脊髓韌帶細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，用BMP-2處理脊髓韌帶細(xì)胞，檢測(cè)其堿性磷酸酶活性。發(fā)現(xiàn)外源性BMP-2可促進(jìn)脊柱韌帶細(xì)胞的成骨分化。BMP-2在脊柱韌帶中的表達(dá)可能為闡明韌帶組織中異位成骨的發(fā)生發(fā)展提供線索。

縫隙連接蛋白是跨膜通道，在細(xì)胞胞質(zhì)之間提供雙向通信，而在骨細(xì)胞中的最豐富的連接蛋白家族成員是連接蛋白43(Cx43)。在骨骼中，大量系統(tǒng)性和局部產(chǎn)生的信號(hào)被轉(zhuǎn)換成生物信號(hào)，并傳輸?shù)教囟ㄎ恢玫募?xì)胞，促進(jìn)骨骼形成。因此，Cx43可能在OPLL發(fā)育過(guò)程中的信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要作用[28]。Chen等[29]通過(guò)分比較OPLL與非OPLL患者體內(nèi)、外Cx43蛋白表達(dá)水平，證明了Cx43介導(dǎo)的NFkB(p65)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)不僅在機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的OPLL中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也引起韌帶成纖維細(xì)胞炎癥反應(yīng)的激活。

結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF)是半胱氨酸分泌蛋白，CTGF/Hcs24 mRNA在肥大軟骨細(xì)胞中表達(dá)最高。重組CTGF/Hcs24(rCTGF/Hcs24)促進(jìn)軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞在體內(nèi)外和血管生成中的增殖和分化。在小鼠模型中，CTGF/Hcs24在骨折愈合過(guò)程中表達(dá)上調(diào)，提示CTGF/Hcs24在體內(nèi)可能參與了軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨作用[30]。Yamamoto[31]對(duì)OPLL患者的骨化韌帶組織進(jìn)行CTGF/Hcs24特異性抗體免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)CTGF/Hcs24增強(qiáng)了OPLL患者韌帶細(xì)胞ALP的表達(dá)，而非OPLL細(xì)胞ALP的表達(dá)無(wú)明顯變化，說(shuō)明可能是啟動(dòng)脊柱韌帶細(xì)胞成骨的重要因素。

除ttw小鼠外Zucker脂肪大鼠(ZFR)是另一種后縱韌帶自發(fā)骨化模型，其瘦素受體功能異常。Yamamoto和Kosaka[32]利用攜帶瘦素受體基因(fa)突變的Zucker脂肪大鼠(fa/fa)和經(jīng)谷氨酸鈉處理的肥胖大鼠(MSG)(因下丘腦腹內(nèi)側(cè)核破壞而肥胖)研究了胰島素/IGF-1信號(hào)和瘦素信號(hào)在脊柱韌帶細(xì)胞中的作用。其結(jié)果表明, 胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)可以誘導(dǎo)成骨的OPLL細(xì)胞分化。

P2Y1基因是G蛋白倍增受體的超家族成員。據(jù)報(bào)道，成骨細(xì)胞在分化和增殖過(guò)程中通過(guò)P2Y1受體對(duì)細(xì)胞外核苷酸作出反應(yīng)。并且OPLL患者的韌帶細(xì)胞在機(jī)械應(yīng)力作用下，表現(xiàn)出高水平的P2Y1表達(dá)，并釋放出三磷酸腺苷(ATP)。Tanaka等[33]通過(guò)轉(zhuǎn)染P2Y1,發(fā)現(xiàn)BMP-2 mRNA水平的升高與OPLL細(xì)胞中P2Y1 mRNA表達(dá)水平顯著正相關(guān)，而非OPLL細(xì)胞中則呈負(fù)相關(guān)。表明P2Y1在OPLL和非OPLL細(xì)胞中的表達(dá)和對(duì)P2Y1刺激的某些反應(yīng)存在差異。

蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)在成骨細(xì)胞分化中起重要作用。人因蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(proteinkinaseR-likeERkinase,PERK)突變?nèi)笔Э蓪?dǎo)致Wolcott-Rallison綜合征(WRS)。這是一種常染色體隱性遺傳疾?。黄涮卣鳛镮型糖尿病的早期發(fā)病、生長(zhǎng)遲緩、多發(fā)性骨骼功能障礙，包括骨骺發(fā)育不良、骨折、晚期骨質(zhì)疏松。Chen等[34]證實(shí)與非OPLL患者相比，OPLL患者的細(xì)胞PERK顯著上調(diào)。特異性siRNA靶向PERK轉(zhuǎn)染72 h后，OPLL患者細(xì)胞中成骨相關(guān)基因(OCN、ALP、COL I)的mRNA表達(dá)明顯降低，提示PERK介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能參與了OPLL的發(fā)生發(fā)展。

肌節(jié)同源結(jié)構(gòu)域同源框基因轉(zhuǎn)錄因子(Msx)功能突變的喪失和獲得可導(dǎo)致顱骨發(fā)育的嚴(yán)重缺陷。Msx2可能直接與DNA結(jié)合促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，并可能通過(guò)蛋白-蛋白相互作用與Runx2結(jié)合抑制礦化。研究表明，穩(wěn)定下調(diào)PDL-L2細(xì)胞中Msx2的表達(dá)可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，從而導(dǎo)致基質(zhì)礦化[35]。相反，細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的Msx2阻止了成骨細(xì)胞的分化和基質(zhì)礦化。因此，Msx2在OPLL細(xì)胞系中呈負(fù)調(diào)控,在防止韌帶和肌腱礦化方面起著關(guān)鍵作用。

Runx2是成骨發(fā)生的主要調(diào)節(jié)因子，是間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵；而Runx2的強(qiáng)烈表達(dá)可將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成骨細(xì)胞。在OPLL中，Runx2在異位骨形成之前就已被誘導(dǎo)，而Runx2單倍性不足可以改善OPLL相關(guān)的異位鈣化。以ttw小鼠為研究對(duì)象，將其與雜合子Runx2小鼠雜交以降低Runx2的表達(dá)，并可利用3D-micro CT進(jìn)行組織學(xué)和定量放射學(xué)分析[36]。這表明Runx2表達(dá)增加是OPLL小鼠模型中形成完整的OPLL表型的先決條件。

三、與OPLL相關(guān)的生物力學(xué)

OPLL患者頸椎單開(kāi)門(mén)手術(shù)后，由于后柱不穩(wěn)導(dǎo)致骨化韌帶短期內(nèi)增厚。臨床證據(jù)支持這一假設(shè)，即機(jī)械應(yīng)力是OPLL進(jìn)展中起重要作用的局部因素之一。機(jī)械刺激激活信號(hào)通路，最終調(diào)節(jié)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成。近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者深入研究機(jī)械應(yīng)力與后縱韌帶骨化癥發(fā)展關(guān)系，影響機(jī)制尚不清楚[37]。

Chen等[38]發(fā)現(xiàn)，機(jī)械應(yīng)力可以上調(diào)韌帶成纖維細(xì)胞中Cx43的表達(dá)；該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)械信號(hào)以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化；并且證明機(jī)械應(yīng)力上調(diào)的Cx43可能部分通過(guò)激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)和細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶(P38)信號(hào)來(lái)促進(jìn)韌帶成纖維細(xì)胞的成骨分化。Shi等[39]比較OPLL和非OPLL患者韌帶成纖維細(xì)胞通過(guò)力學(xué)加載后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物在體內(nèi)的表達(dá)情況，研究了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的影響。他們?cè)贠PLL患者體內(nèi)外均觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活。機(jī)械應(yīng)力可激活后縱韌帶成纖維細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)離體OPLL的形成。在這個(gè)過(guò)程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能通過(guò)MAPK信號(hào)通路發(fā)揮作用。Chen等[40]采用瘦素刺激OPLL細(xì)胞，并通過(guò)柔性細(xì)胞張力系統(tǒng)施加機(jī)械應(yīng)力，并評(píng)價(jià)成骨分化，證明瘦素和LepR在OPLL組織中有差異表達(dá)，瘦素/LepR和機(jī)械應(yīng)力聯(lián)合作用通過(guò)MAPK、JAK2-STAT3和PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)PLL細(xì)胞成骨分化。綜上所述，機(jī)械應(yīng)力可激活后縱韌帶成纖維細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，通過(guò)信號(hào)通路發(fā)揮作用進(jìn)一步加速OPLL的進(jìn)展。

四、干細(xì)胞與OPLL

異位骨化(heterotopic ossification,HO)是軟組織中骨形成的過(guò)程。這通常發(fā)生在最初的軟骨形成，然后是軟骨內(nèi)成骨。近年來(lái)關(guān)于異位骨化的研究表明異位軟骨和骨來(lái)源于內(nèi)皮細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞。血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的間質(zhì)干細(xì)胞中間體向骨骼細(xì)胞分化[41]。Liu[42]通過(guò)比較ttw小鼠和未發(fā)生骨質(zhì)增生的野生型小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨潛能和行為特征，證明ttw小鼠肌肉脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有較高的成骨潛能。Asari等[43]證明了間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)存在于人類(lèi)脊柱韌帶中，將其分離并原位定位。Chin等[44]也發(fā)現(xiàn)MSCs在人脊髓韌帶血管周?chē)湍z原基質(zhì)中的存在。此外，還觀察到MSC和周細(xì)胞標(biāo)記物在血管周?chē)鷧^(qū)域的共同表達(dá)。韌帶異位骨化前軟骨細(xì)胞MSC標(biāo)記表達(dá)陽(yáng)性，異位骨化韌帶中MSCs的檢出率明顯高于膠原基質(zhì)中非異位骨化韌帶的檢出率。所以MSCs在OPLL骨化過(guò)程中可能起關(guān)鍵作用。

五、其他非遺傳因素

OPLL的非遺傳因素包括年齡、糖尿病、肥胖、飲食、運(yùn)動(dòng)和機(jī)械刺激等，與血漿戊糖苷水平、股骨頸骨密度(BMD)和彌漫性特發(fā)性骨質(zhì)增生(DISH)也與OPLL相關(guān)。OPLL也可能是其他疾病的繼發(fā)性并發(fā)癥，如低磷性佝僂病/骨軟化癥、甲狀旁腺功能減退癥和肢端肥大癥、巨人癥，這些疾病常導(dǎo)致早發(fā)和嚴(yán)重OPLL。而大多數(shù)OPLL病例是原發(fā)性的(特發(fā)性的)。

后縱韌帶骨化癥是一種涉及脊柱韌帶異位骨形成的多因素疾病。近幾十年來(lái)對(duì)OPLL發(fā)病機(jī)制的研究揭示了許多遺傳和非遺傳因素參與了OPLL的發(fā)生和發(fā)展。雖然在OPLL標(biāo)本中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多具有特異SNP的OPLL易感基因，但大多數(shù)研究都是基于小樣本量和少量經(jīng)檢測(cè)的序列變異。此外，由于這些SNPs缺乏進(jìn)一步的功能特性，與OPLL相關(guān)的SNP是否是OPLL發(fā)生和發(fā)展的功能性后果尚待確定；在生物力學(xué)上許多學(xué)者也發(fā)現(xiàn)力學(xué)刺激能激活多種信號(hào)通路從而促進(jìn)體外OPLL成纖維細(xì)胞具有成骨分化的功能，但大部分都是在體外單一力學(xué)加載作用下完成。通過(guò)在體外進(jìn)行的細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)，不能完全模擬頸椎屈伸及旋轉(zhuǎn)力量的影響。近年來(lái)也發(fā)現(xiàn)脊柱韌帶及周?chē)g充質(zhì)干細(xì)胞這一系列干細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的新證據(jù)。這為OPLL的分子機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。然而，異常信號(hào)如何從周細(xì)胞中招募MSCs并將其轉(zhuǎn)化為異位骨化仍是有待解決的關(guān)鍵問(wèn)題，應(yīng)該是未來(lái)研究的方向和重點(diǎn)之一?？傊?OPLL是一種多基因與遺傳有關(guān)，在體內(nèi)外多種理化及生物因素作用下導(dǎo)致的疾病，其發(fā)病機(jī)制還需進(jìn)一步研究。