IVF－ET反復(fù)種植失敗患者子宮內(nèi)膜HOXA－10基因的表達(dá)

楊海燕 倪吳花 滕依麗 孟綠荷

IVF－ET反復(fù)種植失敗患者子宮內(nèi)膜HOXA－10基因的表達(dá)

楊海燕 倪吳花 滕依麗 孟綠荷

目的研究同源框基因－10(HOXA－10)在人子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)，并探討其與體外受精－胚胎移植(IVFET)反復(fù)種植失敗的相關(guān)性。方法以40例IVF－ET治療反復(fù)種植失敗的患者為研究對(duì)象，以40例正常婦女及5例早孕人流患者作為對(duì)照，獲取患者各時(shí)期子宮內(nèi)膜及蛻膜組織，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HOXA－10蛋白在各時(shí)期子宮內(nèi)膜及蛻膜上的定位和表達(dá)，采用反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)(RT－PCR)方法和蛋白印跡法(Western blotting)測(cè)定HOXA－10 mRNA在各時(shí)期子宮內(nèi)膜及蛻膜上的表達(dá)及其蛋白水平。結(jié)果HOXA－10蛋白定位于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，其mRNA和蛋白在各期子宮內(nèi)膜及蛻膜組織中均有表達(dá)。在對(duì)照組中以分泌中期、晚期及蛻膜中的表達(dá)最強(qiáng)，明顯高于月經(jīng)期和增殖期(P＜0．05);而在反復(fù)種植失敗患者子宮內(nèi)膜中的表達(dá)水平基本一致，無(wú)明顯分泌中、晚期峰，并且分泌中、晚期的表達(dá)要顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。結(jié)論HOXA－10基因在分泌中、晚期子宮內(nèi)膜及早孕蛻膜組織中的高表達(dá)與胚胎種植及妊娠維持密切相關(guān);其表達(dá)下降可能是導(dǎo)致IVF－ET反復(fù)種植失敗的重要原因之一。

HOXA－10子宮內(nèi)膜體外受精－胚胎移植種植

體外受精－胚胎移植(IVF－ET)技術(shù)發(fā)展至今，促排卵刺激方案及實(shí)驗(yàn)室技術(shù)得到了長(zhǎng)足的進(jìn)步，使移植胚胎的質(zhì)量有了明顯提高，但種植率及最終的妊娠率仍然不是很理想，臨床上有很大一部分患者還存在反復(fù)種植失敗的問(wèn)題。目前認(rèn)為種植失敗中2/3是由子宮內(nèi)膜容受性異常引起的。研究表明，同源框基因－10(HOXA－10)屬于多基因家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因，是子宮內(nèi)膜容受性建立和胚胎種植成功的必需調(diào)節(jié)因子，本研究首次通過(guò)檢測(cè)HOXA－10基因在IVF－ET反復(fù)種植失敗患者子宮內(nèi)膜組織的表達(dá)以探討其與反復(fù)種植失敗的相關(guān)性。

材料與方法

1．研究對(duì)象:選取2009年3月～2010年8月在筆者醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行體外受精－胚胎移植(IVF－ET)或單精子卵泡漿內(nèi)注射(ICSI)治療，3次以上新鮮周期胚胎移植(均為D2或D3胚胎，每次移植至少有1個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎)均失敗的40例患者為研究對(duì)象;以同期因男性因素在本中心行ICSI治療，至少有1次妊娠史的40例正常婦女及在筆者醫(yī)院行人工流產(chǎn)的正常孕早期5例患者作為對(duì)照。研究組患者年齡30．7± 3.1歲，不育年限3．4±2．0年，對(duì)照組患者年齡30．9±3．0歲，不育年限3．0±1．7年，蛻膜取自孕45～60天患者。所有患者基礎(chǔ)內(nèi)分泌正常，月經(jīng)周期正常(21～35天)，既往無(wú)卵巢手術(shù)史，3個(gè)月內(nèi)無(wú)激素治療及宮腔操作史，無(wú)合并子宮內(nèi)膜異位癥、輸卵管積水、生殖器畸形、子宮肌瘤、子宮腺肌瘤或多囊卵巢綜合征及其他系統(tǒng)疾病，曾行宮腔鏡檢查或子宮輸卵管碘油造影，排除異常宮腔，B超監(jiān)測(cè)過(guò)程中未提示內(nèi)膜異常，移植日內(nèi)膜厚度均在7mm以上。所有患者均簽署知情同意書(shū)，并獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2．方法:(1)標(biāo)本的收集與處理:結(jié)合80例患者臨床表現(xiàn)及定期的超聲檢查(必要時(shí)結(jié)合血液相關(guān)指標(biāo)測(cè)定)確定子宮內(nèi)膜時(shí)期并獲取各時(shí)期子宮內(nèi)膜組織共80份(80例患者各時(shí)期單點(diǎn)取材)，同時(shí)獲取在本院行人工流產(chǎn)的正常孕早期5例患者的蛻膜組織5份。其中研究組中包括月經(jīng)期，增生早、中、晚期各5份，分泌早、中、晚期各5、10、5份;對(duì)照組中包括月經(jīng)期，增生早、中、晚期各5份，分泌早、中、晚期各5、10、5份，蛻膜5份。所有子宮內(nèi)膜組織均由專(zhuān)人獲取，取自子宮底部，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后石蠟包埋備用。(2)免疫組織化學(xué)檢測(cè):常規(guī)HE染色鏡檢，根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分期。采用鏈霉菌抗生物素蛋白－生物素復(fù)合物染色法(SABC法)檢測(cè)子宮內(nèi)膜HOXA－10蛋白的表達(dá)，操作方法按SABC試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。石蠟切片厚5μm，組織切片常規(guī)脫蠟、消化、封閉，滴加一抗(單克隆小鼠抗人HOXA－10)(武漢博士德生物工程有限公司)，稀釋濃度為1∶75，4℃孵育過(guò)夜，加入二抗，3－3'－二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色(武漢博士德生物工程有限公司)，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為空白對(duì)照。每份標(biāo)本觀察5張切片，每張切片觀察5個(gè)視野，采用美國(guó)MediaCybernetics公司計(jì)算機(jī)圖像信號(hào)采集與分析系統(tǒng)(image－pro plus6．0圖像分析軟件)測(cè)定陽(yáng)性部位的平均吸光度(MOD)值。(3)RT－PCR檢測(cè):TRIzol試劑(BioFlux公司)提取子宮內(nèi)膜組織中總RNA后，以O(shè)ligo(dT)18進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(Fermentas公司)，PCR擴(kuò)增引物(引物由上海生工合成)。HOXA－10引物序列上游為5'－CTTACATTGCCTGACTAA－3'，下游為5'－ACAACTTCACAAGATAGG－3'(基因編號(hào):NM018951)，擴(kuò)增產(chǎn)物180bp。同時(shí)以β－actin作為內(nèi)參照，其引物序列上游為5'－CCTGAGGCTTTTCCAGCC－3'，下游為5'－TAGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT－3'。PCR循環(huán)條件為:94℃預(yù)變性5min，94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸50 s，40個(gè)循環(huán);72℃再延伸10min。產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳后，讀膠儀讀取擴(kuò)增條帶的光密度值并進(jìn)行分析、照相，以HOXA－10和β－actin的比值表示HOXA－10 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。(4)Western blotting檢測(cè):從凍存組織中用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，采用Bradford比色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。每個(gè)樣本取總蛋白75μg。標(biāo)本經(jīng)8%十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PA GE)分離蛋白質(zhì)后，濕式法電轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，加一抗稀釋液(羊抗人HOXA－10多克隆抗體濃度為1∶150，羊抗人β－actin單克隆抗體濃度為1∶500，Santa Cruz，美國(guó))4℃孵育過(guò)夜，然后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊二抗(1∶2000稀釋?zhuān)琒anta Cruz，美國(guó))在室溫下孵育2h，TBS－T洗膜10min(3次，ECL顯色(Pierce，美國(guó))，Koda－X線膠片顯影。采用GDS－8000型全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(UVP，英國(guó))測(cè)定條帶積分光密度值(IOD)來(lái)表示HOXA－10蛋白的表達(dá)水平，并分析結(jié)果。

3．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS11．5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，各時(shí)期內(nèi)膜MOD值比較采用單因素方差分析，反復(fù)種植失敗患者和對(duì)照組間MOD值比較采用成組資料t檢驗(yàn)，P＜0．05為統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異有顯著性。

結(jié)果

1．兩組患者各時(shí)期子宮內(nèi)膜HOXA－10的免疫組化檢測(cè):免疫組化結(jié)果顯示HOXA－10蛋白在子宮內(nèi)膜腔上皮、腺上皮、血管上皮和間質(zhì)細(xì)胞都有表達(dá)。對(duì)照組中各期子宮內(nèi)膜及蛻膜組織中均有表達(dá)，其中分泌中、晚期及蛻膜中的表達(dá)要明顯高于月經(jīng)期，增殖期和分泌早期(P＜0．05);研究組中各時(shí)期子宮內(nèi)膜上也均有HOXA－10蛋白的表達(dá)，但各時(shí)期間比較差異無(wú)顯著性(P＞0．05)。對(duì)兩組間分泌中期和晚期的表達(dá)進(jìn)行比較則發(fā)現(xiàn)，研究組HOXA－10的表達(dá)強(qiáng)度要顯著低于對(duì)照組(P＜0．05，表1、圖1～圖3)。

表1 兩組患者各月經(jīng)周期內(nèi)膜及蛻膜中HOXA－10的表達(dá)(MOD±s)

表1 兩組患者各月經(jīng)周期內(nèi)膜及蛻膜中HOXA－10的表達(dá)(MOD±s)

與月經(jīng)期、增生期及分泌早期相比，△P＜0．05;與月經(jīng)期、增生期及分泌各期相比，▲P＜0．05;與研究組相比，*P＜0．05

組別月經(jīng)期增殖期分泌期早中晚早中晚蛻膜對(duì)照組0．17±1．14×10－20．15±8．94×10－30．16±1．00×10－20．16±7．07×10－30．16±8．37×10－30．32±1．62×10－2△＊0．33±2．59×10－2△＊0．36±1．87×10－2▲研究組0．16±1．14×10－20．16±1．00×10－20．16±8．94×10－30．16±7．07×10－30．16±1．17×10－20．17±1．30×10－20．17±1．30×10－2

2．兩組患者各時(shí)期子宮內(nèi)膜HOXA－10mRNA的RT－PCR檢測(cè):兩組在180bp處均出現(xiàn)了特異性的HOXA－10基因條帶。電泳帶光密度掃描結(jié)果顯示，HOXA－10mRNA在各期子宮內(nèi)膜組織及蛻膜組織中均有表達(dá)。對(duì)照組中分泌中、晚期和蛻膜組織中表達(dá)最強(qiáng)，與其余各期相比差異有顯著性(P＜ 0.05)，而研究組中各時(shí)期子宮內(nèi)膜上的表達(dá)強(qiáng)度無(wú)顯著性變化(P＞0．05)，而且分泌中、晚期的表達(dá)要明顯弱于對(duì)照組(P＜0．05)(表2、圖4)。

表2 兩組患者各月經(jīng)周期內(nèi)膜及蛻膜中HOXA－10mRNA的相對(duì)表達(dá)水平(x±s)

圖4 對(duì)照組子宮內(nèi)膜組織及蛻膜中HOXA－10mRNA的表達(dá)

3．兩組患者各時(shí)期子宮內(nèi)膜HOXA－10蛋白的Western blotting檢測(cè):Western blotting分析結(jié)果顯示，在40kDa的位置上出現(xiàn)了HOXA－10蛋白的雜交帶。其在對(duì)照組中的表達(dá)量從月經(jīng)期、增生期到分泌期和蛻膜組織逐漸增加，其中分泌中、晚期和蛻膜組織中表達(dá)量最高，與其余各期相比差異有顯著性(P＜0.05);而其在研究組各時(shí)期子宮內(nèi)膜上的表達(dá)量則無(wú)顯著性變化(P＞0.05)，其中分泌中、晚期的表達(dá)量要顯著低于對(duì)照組(P＜0．05) (表3、圖5)。

表3 兩組患者各月經(jīng)周期內(nèi)膜及蛻膜中HOXA－10蛋白的表達(dá)(IOD，x±s)

討論

在著床過(guò)程中，囊胚的滋養(yǎng)細(xì)胞必須達(dá)到具有浸潤(rùn)狀態(tài)，子宮內(nèi)膜也要同時(shí)發(fā)育到接受狀態(tài)才能啟動(dòng)著床。在IVF－ET中妊娠率低的原因之一即是著床失敗，所以著床是生殖中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。胚胎著床過(guò)程受胚胎和母體器官一系列的調(diào)控，其中子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎容受性的建立是其中最關(guān)鍵的因素。而文獻(xiàn)報(bào)道，組織學(xué)正常的子宮內(nèi)膜，并不代表其功能正?；蚍磻?yīng)其容受性［1，2］。目前對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的探究已進(jìn)行到了基因?qū)W的層次，其中HOXA－10是極其重要且被研究最多的一個(gè)基因。

圖5 對(duì)照組子宮內(nèi)膜組織及蛻膜中HOXA－10蛋白的表達(dá)

1．HOXA－10在正常子宮內(nèi)膜組織的表達(dá): HOXA基因通過(guò)和DNA結(jié)合，激活或抑制目標(biāo)基因，調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育，決定細(xì)胞的定向分化和增殖。HOXA－10是該家族的重要成員，參與子宮內(nèi)膜正常形態(tài)的維持、內(nèi)膜的增殖與分化、容受性的建立、胚胎的定位和黏附，胞飲突的形成、蛻膜化和血管通透性的增加等［3，4］。其mRNA在人類(lèi)子宮內(nèi)膜上皮和基質(zhì)中均有表達(dá)，而且隨月經(jīng)周期呈現(xiàn)周期性變化，在分泌中、晚期的表達(dá)明顯高于增生期及分泌早期，峰值出現(xiàn)與子宮內(nèi)膜接受窗口及血清孕酮值升高一致［5］。正常人類(lèi)輸卵管僅表達(dá)微量HOXA－10 mRNA，然而輸卵管妊娠時(shí)其表達(dá)在輸卵管妊娠的著床部位顯著增加，水平接近正常妊娠時(shí)的內(nèi)膜水平，表明其與著床密切相關(guān)［6］。周建生等［7］發(fā)現(xiàn)，早孕小鼠子宮內(nèi)膜HOXA－10 mRNA的表達(dá)大于非妊娠的子宮內(nèi)膜，且隨著妊娠天數(shù)的增加呈逐漸上升趨勢(shì)，與子宮內(nèi)膜的容受性變化一致。同時(shí)發(fā)現(xiàn)其表達(dá)從孕5天開(kāi)始下降，孕7天時(shí)接近未孕水平，與胚胎著床時(shí)子宮內(nèi)膜的蛻膜化過(guò)程完全一致。他們還發(fā)現(xiàn)，用HOXA－10DNA質(zhì)粒/脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染孕2天小鼠子宮角后，小鼠的胚胎著床數(shù)明顯增加;相反，用HOXA－10反義寡脫氧核糖核酸/脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后，著床數(shù)明顯下降，因而認(rèn)為其可能參與調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的周期性增殖與分化，最終使子宮內(nèi)膜進(jìn)入容受狀態(tài)，并在蛻膜化過(guò)程中起重要作用。李雪梅等［8］通過(guò)研究證實(shí)雌、孕激素顯著提高高分化子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中HOXA－10基因的表達(dá)，推測(cè)HOXA－10基因增加是子宮內(nèi)膜容受性增強(qiáng)的重要表現(xiàn)。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，母體喪失表達(dá)HOXA－10將導(dǎo)致生育能力下降，HOXA－10基因缺陷小鼠的子宮體積縮小，管徑變細(xì)、內(nèi)膜變薄，腺體數(shù)量顯著減少，部分內(nèi)膜變異為輸卵管黏膜;HOXA－10點(diǎn)突變的小鼠不能著床而導(dǎo)致不孕，而把這些不孕小鼠的受精卵移植到有正常HOXA－10表達(dá)的野生鼠體內(nèi)則能夠著床并妊娠;不明原因不孕患者HOXA－10基因mRNA在月經(jīng)周期不同時(shí)期子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)中表達(dá)基本一致，無(wú)明顯的分泌中、晚期峰，在腺體和間質(zhì)的表達(dá)均低于正常生育婦女，均進(jìn)一步說(shuō)明了HOXA－10在子宮內(nèi)膜發(fā)生和發(fā)育過(guò)程中起著重要的調(diào)控中的作用［9］。

本研究獲取正常婦女各時(shí)期的子宮內(nèi)膜及蛻膜組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)HOXA－10在月經(jīng)期、增殖期及分泌期子宮內(nèi)膜上均有表達(dá)，但分泌中期、晚期表達(dá)明顯增加，蛻膜中表達(dá)最強(qiáng)，與既往研究結(jié)果相一致，進(jìn)一步肯定了其在評(píng)價(jià)著床期子宮內(nèi)膜容受性方面的特異性。

2．HOXA－10與IVF－ET反復(fù)種植失敗的相關(guān)性:Cermik等［10］發(fā)現(xiàn)，因著床失敗而導(dǎo)致的不孕(多囊卵巢綜合征，子宮內(nèi)膜異位癥及輸卵管積水)的患者子宮內(nèi)膜中均存在的HOXA－10表達(dá)缺陷。輸卵管積水的濃度越高，HOXA－10 mRNA表達(dá)越少，切除輸卵管后，子宮內(nèi)膜HOXA－10 mRNA表達(dá)明顯升高［11，12］。7．23%的子宮內(nèi)膜異位癥患者有HOXA－10基因的突變，其在子宮腔上皮、腺上皮和內(nèi)皮的表達(dá)正常，但在基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)明顯下降，在分泌中期子宮內(nèi)膜的表達(dá)水平遠(yuǎn)低于正常生育婦女，在黃體期的表達(dá)并不增加［13，14］。子宮肌瘤尤其是黏膜下子宮肌瘤也會(huì)影響HOXA－10基因在子宮內(nèi)膜的表達(dá)，從而擾亂種植窗口期［15］。但到目前為止尚未見(jiàn)其在IVF－ET反復(fù)種植失敗患者子宮內(nèi)膜中變化的報(bào)道。本研究首次對(duì)這部分患者的子宮內(nèi)膜進(jìn)行相關(guān)研究，因考慮到上述常見(jiàn)不孕因素對(duì)結(jié)果的影響，所有患者排除了子宮內(nèi)膜異位癥、輸卵管積水、生殖器畸形、子宮肌瘤、子宮腺肌瘤或多囊卵巢綜合征等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HOXA－10在反復(fù)種植失敗患者子宮內(nèi)膜中的表達(dá)周期性變化不明顯，表達(dá)水平基本一致，無(wú)明顯分泌中晚期峰，而且在種植窗期的表達(dá)要明顯弱于對(duì)照組，認(rèn)為是降低子宮內(nèi)膜容受性，使胚胎與子宮內(nèi)膜黏附下降，致使胚胎種植受阻的原因之一。

綜上所述，HOXA－10在人類(lèi)子宮內(nèi)膜組織上的表達(dá)呈周期特征性，參與了子宮內(nèi)膜容受性的建立。而在IVF－ET反復(fù)種植失敗患者中，其在種植窗期內(nèi)膜上的表達(dá)存在缺陷，從而影響了子宮內(nèi)膜容受性，導(dǎo)致種植失敗，成為這些患者不孕的內(nèi)在機(jī)制。

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(收稿:2011－10－10)

(修回:2012－02－28)

Expression of HOXA－10 in the Endometria of Patients with Recurrent Implantation Failure in IVF－ET．

Yang Haiyan，Ni Wuhua，Teng Yili，Meng Lvhe．Department of Reproductive Medicine，The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Zhejiang 325000，China

ObjectiveTo investigate the expression of HOXA－10 in the endometria of patients with recurrent implantation failure in in vitro fertilization and embryo transfer(IVF－ET)and explore its correlation with recurrent implantation failure．Methods40 patients with recurrent implantation failure in IVF－ET treatment were analyzed as study group，and other 40 normal women and 5 normal pregnant patients as control group．The samples of endometrium throughout the menstrual cycle and deciduas were obtained in patients．Expression of HOXA－10 mRNA and protein was evaluated by using RT－PCR and Western blotting，and the location of HOXA－10 protein was evaluated by immunohistochemistry in all samples．ResultsHOXA－10 protein was located in both glandular epithelial cells and stromal cells of endometrium，and mRNA and protein was expressed in endometrium throughout the menstrual cycle．The levels of expression were obviously increased in mid，later secretory phase and was highest in deciduas in control group(P＜0．05)．But in study group，the levels of expression remained roughly constant and the expression in mid－and late－secretory phase was lower than that of control group(P＜0．05)．ConclusionThe higher expression of HOXA－10 protein in mid－，late－secretory endometria and deciduas is associated with implantation，decidualization and pregnancy．It，s defective expression may be one of the reason that cause implantation failure．

HOXA－10;Endometrium;IVF－ET;Implantation