天然生物堿抗菌活性及機(jī)理研究

李凡凡，鄭越超

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科，天津 300193）

細(xì)菌可引起破傷風(fēng)、傷寒、肺炎等多種疾病，對人類的健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅?？股氐膽?yīng)用挽救了許多患者的生命，然而抗生素的過度使用會導(dǎo)致細(xì)菌病原體產(chǎn)生耐藥性。據(jù)美國疾病控制和預(yù)防中心統(tǒng)計(jì)，美國每年至少有200 萬人感染耐藥細(xì)菌，造成至少2.3 萬人死亡[1]。耐藥性已成為醫(yī)療保健中的普遍問題，耐藥細(xì)菌的增加比批準(zhǔn)上市的新型抗生素要快得多。因此，開發(fā)新的抗菌藥物勢在必行。天然產(chǎn)品是新的高效抗菌藥物的重要來源，可用于對抗日益增長的細(xì)菌耐藥性，其中天然生物堿是一類具有重要生物活性的堿性含氮有機(jī)化合物，根據(jù)其不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可分為異喹啉、吡咯、吡啶、喹啉、吲哚等十余種[2]。王騰飛等[3]研究表明，生物堿具有抗癌、抗病毒、抗炎和抗菌等多種藥理作用。由于其應(yīng)用廣泛，許多生物堿藥物被開發(fā)上市，如麻醉鎮(zhèn)痛劑嗎啡、止咳藥可待因、抗癌藥物長春新堿、抗菌藥物鹽酸小檗堿等，在臨床實(shí)踐中獲得了較好的療效[4]。對天然生物堿抗菌機(jī)理的研究表明，生物堿能破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，影響DNA 功能，并抑制蛋白質(zhì)合成，對包括耐甲氧西林在內(nèi)的各種細(xì)菌均具有潛在活性[5]。本文主要對近年來報(bào)道的生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)、抗菌活性及其作用機(jī)理進(jìn)行概述。

1 不同類型天然生物堿的抗菌活性

1.1 異喹啉類生物堿 異喹啉又稱芐基異喹啉，是具有異喹啉骨架的植物特有的代謝產(chǎn)物，廣泛分布于罌粟科、小檗科、毛蘭科和半枝蓮科，具有悠久的研究與應(yīng)用歷史。異喹啉構(gòu)成最大的生物堿基團(tuán)，可進(jìn)一步分為亞基，包括簡單異喹啉、苯異喹啉、雙苯異喹啉、阿撲嗎啡和原小檗堿[6]，具有廣譜抗菌活性，特別是對金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用。

唐松草堿是從唐松草的根中分離出來的一種異喹啉生物堿，其核心是螺環(huán)四氫吡啶呋喃酮。在使用微量肉湯稀釋法進(jìn)行的抗菌活性試驗(yàn)中，唐松草堿在最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為3.12 μg/ml 時(shí)對枯草芽孢桿菌有顯著抑制作用，抗生素頭孢噻肟對枯草芽孢桿菌的MIC 為1.56 μg/ml，且唐松草堿的抑菌作用與頭孢噻肟相當(dāng)[7]。在尋找具有抗菌作用的天然產(chǎn)物的過程中，有研究[8]從青霉菌Em19的培養(yǎng)液中回收了雞血藤甲素和雞血藤乙素，這兩種化合物對包括陰溝腸桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌和金黃色葡萄球菌在內(nèi)的革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌均有抑制活性。另外，雞血藤乙素對所有被測細(xì)菌的抗菌效果均優(yōu)于雞血藤甲素，MIC 為1 g/ml，而對照組美羅培南和環(huán)丙沙星的MIC 僅為0.5 μg/ml和0.25 μg/ml。這些結(jié)果表明，雞血藤乙素具有很強(qiáng)的抗菌活性。另有研究[9]對從白屈菜中分離的異喹啉類生物堿白屈菜紅堿和白屈菜堿的抗菌活性進(jìn)行了評價(jià)，結(jié)果表明白屈菜紅堿對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌最有效，MIC 為1.9 μg/ml，白屈菜紅堿和白屈菜堿均對白色念珠菌有很強(qiáng)的抗真菌活性。這些生物堿在抑制革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和真菌過程中表現(xiàn)出良好的抗菌活性，它們的抗菌效果與常用的抗菌藥相似。

1.2 吡啶類生物堿 吡啶類生物堿是一種含氮雜環(huán)化合物，主要來源于吡啶或哌啶，可分為簡單吡啶、喹啉嗪和吲哚嗪，這些生物堿廣泛分布于棕櫚科、豆科、姜科、茄科等植物群中，其抑菌或殺菌活性已被廣泛研究[10]。

研究表明[11]，孤挺花寧堿對假絲酵母菌具有抗菌活性，MIC 為128 μg/ml，而對照組藥物四環(huán)素則對假絲酵母菌無抗菌活性，該研究發(fā)現(xiàn)孤挺花寧堿可成為新的潛在抗真菌藥物。梅雪偉[12]對從刺槐中分離得到的12 種喹啉糖苷生物堿的抗菌作用進(jìn)行研究，結(jié)果顯示上述成分均對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有不同程度的抑制活性，MIC 范圍為0.8～18.0 μg/ml。有學(xué)者利用1D、2dnmr 譜和MS 譜對從生姜中分離得到的生物堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定[13]，得到的化合物2-甲氧基-4-[2-（2-吡啶）-乙基] 苯酚對白念珠菌具有良好的生物活性，MIC 為1.0 mg/ml。上述研究均證實(shí)吡啶類生物堿對多種病原菌具有良好的抗菌活性，可作為潛在的廣譜抗菌藥使用。

1.3 吲哚類生物堿 吲哚類生物堿是色氨酸衍生物，具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和重要的生物活性。主要分布在龍蒿科、夾竹桃科、茜草科等植物群中。根據(jù)其核心結(jié)構(gòu)，主要分為單萜吲哚、色胺吲哚、單萜吲哚和雙吲哚[14]，其對大腸埃希菌、糞鏈球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用。

Ding CF 等[15]研究了從非洲馬鈴果果實(shí)中分離得到兩種單萜吲哚生物堿voacafricines A 和B，并對其抗菌活性進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)voacafricine A 對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的MIC 為3.12 μg/ml，另外voacafricine B的抗菌和抑菌活性均強(qiáng)于voacafricine A，其對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和傷寒沙門氏菌的MIC 分別為3.12 μg/ml 和0.78 μg/ml，而作為對照組的黃藤素對于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和傷寒沙門氏菌的MIC 分別為25 μg/ml 和3.12 μg/ml，小檗堿對MRSA 和傷寒沙門氏菌的MIC 分別為6.25 μg/ml 和3.12 μg/ml，可見voacafricines A 和B 這兩種單萜吲哚生物堿具有很強(qiáng)的抗菌活性，優(yōu)于小檗堿和黃藤素。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌對市面上的多種抗菌藥物具有耐藥性，但吲哚生物堿對該菌具有較強(qiáng)的抗菌活性，可作為抗這種耐藥菌感染的潛在治療藥物。

1.4 甾體類生物堿 甾體類生物堿是天然甾體的含氮衍生物，大部分氮原子位于其復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)中。此類生物堿存在于茄科、百合科、夾竹桃科和丁香科等植物中。甾體生物堿根據(jù)甾體骨架分為三類：孕烷、環(huán)孕烷和膽甾烷[16]，通常作為配糖生物堿分離，對傷寒桿菌、變形桿菌及大腸桿菌等具有抗菌作用。

Siriyong T 等[17]使用微量二倍稀釋法測定從風(fēng)車子種子中分離出的甾體化合物風(fēng)車子堿，對其的抗菌研究表明，風(fēng)車子堿對大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抗菌活性優(yōu)于對金黃色葡萄球菌的抗菌活性。Cheenpracha S 等[18]對從止瀉木中提取的三種甾體生物堿（mokluangin A、B 和C）的抗菌活性測試表明，mokluangin B 對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌具有中等抑制活性，MIC 為16 μg/ml，而mokluangin C 對大腸桿菌表現(xiàn)出選擇性中等抑制活性，MIC 為16 μg/ml，對照組萬古霉素和慶大霉素對上述細(xì)菌的MIC 值在0.125～0.25 μg/ml。近年來，越來越多的研究表明，甾體生物堿具有良好的抗菌活性。此外，甾體生物堿與抗生素聯(lián)合使用可以提高抗生素的活性，為抗生素的發(fā)展提供了新的思路。

2 天然生物堿的抗菌機(jī)理

2.1 抑制細(xì)菌核酸與蛋白質(zhì)合成 細(xì)菌的核酸由DNA 和RNA 組成。DNA 分子的作用是儲存、復(fù)制和傳遞遺傳信息，RNA 分子則是充當(dāng)信使分子，確保蛋白質(zhì)的合成。DNA/RNA 分子的損傷或DNA 復(fù)制的抑制能夠降低細(xì)菌毒力的表達(dá)，并影響微生物的性狀及其生長繁殖。絲狀溫度敏感蛋白Z（filamentous temperature-sensitive protein Z，F(xiàn)tsZ）在細(xì)菌細(xì)胞分裂過程中起著重要作用，能夠參與隔膜的形成，并在分裂部位形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，最終控制細(xì)菌細(xì)胞的分裂過程[19]。因此，F(xiàn)tsZ 也是新抗菌藥物的作用靶點(diǎn)之一。

研究顯示，白屈菜紅堿對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抑制作用機(jī)制是通過抑制胞質(zhì)分裂而阻止細(xì)菌分裂。白屈菜紅堿還能在體外抑制純化的FtsZ的合成，而FtsZ 在大腸桿菌的細(xì)胞分裂過程中起著至關(guān)重要的作用[20]?？鄥A也能夠抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌中與細(xì)胞生長和分裂相關(guān)的蛋白質(zhì)的合成，還能與細(xì)胞中的蛋白質(zhì)結(jié)合，形成聚集體，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)分解，最終殺死細(xì)菌。苦參堿對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC 分別為2.5 mg/ml 和10 mg/ml。此外，小檗堿、吲哚類生物堿等也可通過負(fù)調(diào)節(jié)FtsZ 來抑制大腸桿菌和MRSA[21]。

2.2 對細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的影響 細(xì)菌細(xì)胞膜為細(xì)菌的生命活動提供了穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，在細(xì)胞識別和電子傳遞中起著重要的作用。細(xì)菌形成細(xì)胞膜的能力是其在惡劣環(huán)境條件下生存的基礎(chǔ)，細(xì)菌細(xì)胞膜的嚴(yán)重破壞可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)泄漏、信息傳遞功能阻斷和細(xì)胞壁的防御功能喪失。電解質(zhì)泄漏增加了培養(yǎng)基的電導(dǎo)率，因此培養(yǎng)上清液電導(dǎo)率的變化可以反映細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的變化。堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）主要存在于細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間，細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性增加時(shí)AKP 從細(xì)胞中漏出，因此AKP 活性測定可間接反映細(xì)菌細(xì)胞壁的完整性[22]。Zhang Q 等[23]通過瓊脂稀釋法測定白屈菜紅堿對變形桿菌的MIC 為7.8 mg/ml。激光聚焦顯微鏡、場發(fā)射掃描電子顯微鏡和結(jié)晶紫染色結(jié)果表明，白屈菜紅堿可通過阻斷細(xì)胞膜物質(zhì)的表達(dá)和形成，抑制變形桿菌的生長并破壞其細(xì)胞膜的完整性。Luo ZH 等[24]研究證實(shí)由紅茂草中提取的生物堿對肺炎克雷伯菌具有顯著的抗菌作用，其MIC 為3.0 mg/ml。通過改變?nèi)后w感應(yīng)系統(tǒng)，可觀察到紅茂草生物堿處理的培養(yǎng)基電導(dǎo)率顯著高于對照組，且隨著作用時(shí)間的延長，培養(yǎng)基的電導(dǎo)率呈現(xiàn)先增加后穩(wěn)定的趨勢，證實(shí)了該生物堿對細(xì)胞膜的破壞作用。

目前，生物堿對細(xì)胞膜損傷機(jī)制的研究主要集中在尋找更多的膜定位靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)可能與質(zhì)子動力、電子流、養(yǎng)分吸收或其他相關(guān)的酶活性等過程有關(guān)。目標(biāo)篩選效率的提高也為研究生物堿的抗菌機(jī)制提供了一種高度集中的方法，王曙光等[25]在使用博落回提取物的藥物-靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)對異喹啉類生物堿進(jìn)行的研究中，使用反向藥效團(tuán)數(shù)據(jù)庫篩選技術(shù)成功的擬合了二氫白屈菜紅堿的23 個靶標(biāo)和其他化合物的多個靶標(biāo)。

2.3 對細(xì)菌代謝的抑制 生物堿還可以通過干擾細(xì)菌的初級代謝和能量代謝來抑制細(xì)菌生長，從而發(fā)揮抗菌作用。三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）是能量代謝的潛在靶點(diǎn)之一，ATP 不僅在呼吸和初級代謝中起著重要的作用，也是一些酶反應(yīng)的能量來源。因此，ATP 合成酶的抑制會影響微生物的許多正常代謝過程，從而導(dǎo)致微生物死亡。小檗堿可通過增加碳水化合物的轉(zhuǎn)化和吸收，減少碳水化合物的消耗影響A 族乙型溶血性鏈球菌的代謝。此外，小檗堿還能上調(diào)與碳水化合物攝取有關(guān)的ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體和磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，并抑制糖酵解、嘌呤代謝、嘧啶代謝、果糖和甘露糖代謝、脂肪酸合成途徑以減少碳水化合物的消耗。由于碳水化合物代謝紊亂，細(xì)菌內(nèi)部的氧化還原和能量物質(zhì)代謝將變得不平衡，最終使得A 族乙型溶血性鏈球菌的增殖和活動受到抑制[26]。另外，紅茂草生物堿可以通過浸潤細(xì)胞，抑制細(xì)胞內(nèi)酶的活性，干擾細(xì)胞的正常代謝活動，最終達(dá)到抑制肺炎克雷伯菌的作用[27]。烏頭生物堿液和石斛生物堿液對金黃色葡萄球菌的代謝也有抑制作用[28]。

3 總結(jié)與展望

在天然產(chǎn)品中，人們普遍認(rèn)為植物化學(xué)物質(zhì)的抗感染效果不如微生物源的抗生素。然而，隨著細(xì)菌耐藥性的增加，出現(xiàn)了如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、鮑曼不動桿菌等多重耐藥細(xì)菌，目前亟需積極篩選新的抗生素，或者尋找可替代的干預(yù)策略來消除細(xì)菌的耐藥性。

天然生物堿具有廣譜抗生素的特點(diǎn)，且不良反應(yīng)較少，耐藥傾向較低。生物堿提取技術(shù)的逐步成熟也是這些化合物進(jìn)一步發(fā)展的主要原因。如多組分分析被用于微波輔助提取生物堿，高通量的篩選和計(jì)算方法可提高生物堿的提取率。生物堿的生物利用度也是人們普遍關(guān)注的問題，一般來說，生物堿的堿基是親脂性的，能夠與酸形成鹽并溶于水，通過易化擴(kuò)散由胃腸道吸收，不同生物堿的平均生物利用度在0.27%～64.6%。由生物堿、磷脂、疏水組分和表面活性劑組成的制劑在體內(nèi)可自發(fā)形成微乳和亞微乳，從而提高了生物堿的口服吸收，但該方式的生物利用度較低。因此，根據(jù)生物堿抗菌活性的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，開發(fā)臨床抗菌藥物時(shí)應(yīng)考慮幾個方面。首先，目前的研究大多是在體外進(jìn)行的，而在體內(nèi)進(jìn)行的研究相對較少，一些生物堿的抗菌機(jī)理尚未完全闡明。未來的臨床研究應(yīng)采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，為抗菌藥物提供重要的創(chuàng)新方法。其次，在今后的研究中，應(yīng)重點(diǎn)研究生物堿的抗菌活性與其結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，并通過結(jié)構(gòu)變化對生物堿進(jìn)行優(yōu)化。第三，由于天然生物堿含量較低及化合物的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在較長的時(shí)期內(nèi)合成天然生物堿藥物是非常困難和昂貴的，新的生物堿類藥物的開發(fā)也將受到影響。最后，新抗菌藥物的研制應(yīng)考慮細(xì)菌感染的多因素、多部位、多環(huán)節(jié)、多機(jī)制的特點(diǎn)，并對其進(jìn)行優(yōu)化，使其在可接受的毒性水平上達(dá)到適當(dāng)?shù)膭┝?。因此，充分了解結(jié)構(gòu)復(fù)雜的藥物與宿主之間的相互作用，并確定新的潛在靶點(diǎn)，是研究相關(guān)機(jī)制的關(guān)鍵。

綜上所述，生物堿抗菌活性的研究對植物源抗菌劑的研發(fā)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，但目前仍需廣泛開展基礎(chǔ)和臨床研究，以確定和驗(yàn)證新藥療效。深入分析生物堿的抗菌作用及機(jī)制，有望對高效、廣譜、低毒性、低耐藥的新型抗菌藥物的研究和開發(fā)提供幫助。