循環(huán)游離DNA的生物特性及其在乳腺癌中的應(yīng)用

樊麗壯，王 博，徐愛蘭，劉艷佳

（佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，黑龍江 佳木斯 154003）

乳腺癌（breast cancer）是女性發(fā)病率最高的癌癥，也是癌癥死亡的主要原因[1]。目前，基因組測序已實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，基因芯片技術(shù)變得更加成熟，分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于乳腺癌已成為一種趨勢。循環(huán)游離DNA（circulating cell-free DNA，cf-DNA）是指血液或體液中游離于細(xì)胞之外的DNA。其檢測具有操作簡單、實(shí)時(shí)性、易于取樣（且可重復(fù)取樣）、靈敏度高、創(chuàng)傷性小等優(yōu)點(diǎn)，在乳腺癌臨床中具有明顯優(yōu)勢，可作為一種容易被人們接受的檢測手段進(jìn)行大范圍推廣。本主要報(bào)道關(guān)于cf-DNA的研究及其乳腺癌中的應(yīng)用進(jìn)展，期望其能夠在臨床中大范圍應(yīng)用，提高乳腺癌的診斷率。

1 循環(huán)游離DNA的生物學(xué)研究

1.1 cf-DNA的生物學(xué)行為 cf-DNA 以三種不同形式存在體液中：游離細(xì)胞DNA 片段、囊泡結(jié)合DNA和DNA 大分子復(fù)合物，可分為兩種主要類型：無細(xì)胞核（cf-nDNA）和線粒體DNA（cf-mtDNA）[2]。研究發(fā)現(xiàn)[3]，劇烈的體育鍛煉可提高循環(huán)細(xì)胞線粒體DNA（cf-mtDNA）的水平。慢性腎功能衰竭與低cf-DNA 攝取和低血漿cf-DNA 水平相關(guān)，表明腎臟參與了cf-DNA的清除[4]。由于癌癥患者cf-DNA 水平較高，確定其來源能夠幫助鑒定和定位疾病。cf-DNA的片段化譜可能揭示癌癥患者的組織起源[5]。然而，cf-DNA的水平在疾病的不同階段含量不同。在早期階段，它可能低至每5 ml 血漿中僅有一個(gè)基因組當(dāng)量[6，7]。大部分cf-DNA 片段在80～200 bp[8]。cf-DNA 濃度及其鏈完整性可作為鑒定結(jié)核病與非小細(xì)胞肺癌的指標(biāo)。此外，cf-DNA的完整性對區(qū)分非小細(xì)胞肺癌和結(jié)核病高于傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)記[9]。另外，cf-DNA 分析作為一種新興技術(shù)在器官移植檢測、無創(chuàng)產(chǎn)前檢查（NIPT）和腫瘤液體活檢等方面應(yīng)用廣泛[10-12]。

1.2 cf-DNA 中的特殊類型ct-DNA 腫瘤患者血漿內(nèi)循環(huán)腫瘤細(xì)胞或原位腫瘤細(xì)胞釋放進(jìn)入循環(huán)的cf-DNA 稱為循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ct-DNA）。ct-DNA 檢測是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。ct-DNA 屬于cf-DNA的一種類型，反映了不同腫瘤部位轉(zhuǎn)移的大小和活性的動(dòng)態(tài)變化[13]。其片段長度多小于160 bp[14，15]。ct-DNA 在循環(huán)中的半衰期短，一般為16 min～2.5 h，適用于腫瘤負(fù)荷的實(shí)時(shí)監(jiān)測[16]?？焖偕L的腫瘤在自身壞死和腫瘤體積收縮時(shí)產(chǎn)生ct-DNA 峰值，表明持續(xù)的ct-DNA 釋放可能需要活的腫瘤細(xì)胞[17]。ct-DNA 在乳腺癌中的應(yīng)用首先建立在轉(zhuǎn)移性疾病中，因?yàn)槟[瘤負(fù)荷與其總量有關(guān)[18]。通過序列分析可以監(jiān)測腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性和克隆進(jìn)化，從而改善疾病控制和指導(dǎo)治療決策[19]。在乳腺癌早期，腫瘤負(fù)荷有限，ct-DNA 在患者血液中的濃度可能很低，因此早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌仍然具有挑戰(zhàn)性[20]。有研究檢測到Ⅰ期或Ⅱ期乳腺癌患者血漿中的癌癥突變，分析顯示ct-DNA 濃度與患者腫瘤的變化高度一致，表明ct-DNA 分析有助于乳腺癌的篩查和管理[21]。

1.3 cf-DNA 與腫瘤體積的相關(guān)性 隨著對cf-DNA的深入研究，cf-DNA 與腫瘤體積之間有相關(guān)性逐漸顯露。腫瘤體積大、肝轉(zhuǎn)移的患者的ct-DNA 檢測率較高[22]；總代謝腫瘤體積和cf-DNA 高的患者無進(jìn)展存活期較短[23]。ct-DNA 可作為癌癥治療期間的監(jiān)測工具[24]。同時(shí)，cf-DNA 顯示出在癌癥治療后成為反應(yīng)評估的新生物標(biāo)志物的潛力，可作為腫瘤體積的評估工具。

2 cf-DNA的檢測

2.1 血液樣本采集 血漿樣品分析前處理的變化會(huì)影響cf-DNA 分析的結(jié)果[25]。晝夜循環(huán)和膳食消耗不會(huì)顯著影響總cf-DNA，供體間血漿cf-DNA 濃度差異歸因于人身體差異[26]。Madsen AT 等[27]的研究證明，當(dāng)間隔3 h 進(jìn)行5 次抽檢時(shí)，血漿cf-DNA 濃度在最后抽檢時(shí)下降。變異等位基因頻率僅在96 h的EDTA 管中受cf-DNA 濃度波動(dòng)的影響。BCT 和Cell Save 管均在96 h 時(shí)保持了最佳cf-DNA/ct-DNA 質(zhì)量，且使用的防腐劑不影響dPCR的下游cf-DNA/ct-DNA 分析[28]。高容量等離子體收集裝置收集的等離子體中存在高質(zhì)量的cf-DNA。能夠從單個(gè)個(gè)體收集大量的cf-DNA，將有助于臨床操作、最小疾病監(jiān)測和癌癥的早期發(fā)現(xiàn)[29]。

2.2 血漿cf-DNA的提取 CANCER-ID 聯(lián)盟使用人工插入血漿對實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行了多中心評估，結(jié)果差異顯著，因此謹(jǐn)慎選擇cf-DNA 提取方法具有重要意義。Qiagen CNA 和MaxweⅡRSC 試劑盒相比，擴(kuò)增的短尺寸片段和腫瘤特異性突變具有相似的完整性和水平。然而，Qiagen CNA 試劑盒始終顯示出最高的cf-DNA 和短片段，而MaxweⅡRSC 和QIAamp MinElute cf-DNA 試劑盒顯示出更高的變體等位基因頻率[30]。有研究[31]比較了11 種提取cf-DNA的方法、3 種定量方法和2 種建立DNA 完整性的測定方法，發(fā)現(xiàn)QIAamp CNA kit 和the Norgen Plasma/Serum Circulating DNA kit 可作為更好的選擇。另外研究[32]對七種市售的cf-DNA 提取試劑盒進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)QIAamp CNA kit 可提供最高的cf-DNA 產(chǎn)量和部分低分子量。

2.3 血漿cf-DNA的檢測方法 目前cf-DNA 檢測方法有甲基化特異性PCR 法、聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法（PCR）、TaqMan 探針法、DNA 序列測序法、微滴式數(shù)字（ddPCR)等。cf-DNA 分析的進(jìn)展高度依賴于技術(shù)進(jìn)步，因?yàn)樾枰酶叨让舾械募夹g(shù)將樣品中突變或甲基化等位基因的檢測出來。在檢測cf-DNA 中EGFR 突變的ddPCR 似乎比ARMS-PCR 有更高的敏感性，特別是在早期[33]。ddPCR 技術(shù)檢測ct-DNA 具有高靈敏度和特異性，該檢測可用于準(zhǔn)確的疾病監(jiān)測，耐藥性突變的鑒定以及實(shí)體瘤患者前期治療的評估[34]。隨著ddPCR 技術(shù)的發(fā)展和優(yōu)化，目前ct-DNA的檢出限可低至0.001%，準(zhǔn)確度高，為ct-DNA的臨床應(yīng)用開辟了廣闊的空間[35]。

3 cf-DNA 在乳腺癌中的應(yīng)用

3.1 早期診斷和篩查 cf-DNA 檢測是一種快速、實(shí)時(shí)、低成本、非侵入性的腫瘤基因檢測方法，可以在乳腺癌基因水平進(jìn)行早期診斷、篩查、鑒別診斷。腫瘤是由癌基因、腫瘤抑制基因和/或DNA 穩(wěn)定性基因的遺傳和表觀遺傳變化的積累引起的，DNA 甲基化是早期癌變的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記物，可成為篩查和早期診斷癌癥的標(biāo)志物[36]。DNA 甲基化是由DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（dnmts）催化，甲基（-CH3）共價(jià)轉(zhuǎn)移到CpG 二核苷酸中胞嘧啶環(huán)的第五個(gè)碳，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）[37]。高甲基化的啟動(dòng)子造成抑癌基因失活是腫瘤發(fā)生的共同特征，腫瘤中低甲基化發(fā)生在基因組中是一種常見現(xiàn)象[38]。在乳癌患者的血漿樣本中，可檢測到BRCA1、RASSF1A 和GSTP1 基因中至少有一個(gè)基因的啟動(dòng)子甲基化[39]。DNA 甲基化特征、遺傳風(fēng)險(xiǎn)評分、環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評分的聯(lián)合應(yīng)用可以準(zhǔn)確地預(yù)測乳腺癌的發(fā)生率，可用于高風(fēng)險(xiǎn)人群的篩查[40]。乳腺組織中含有豐富的5-羥甲基胞嘧啶基因組位點(diǎn)，并提供了正常乳腺組織中核苷酸水平5-羥甲基胞嘧啶的全基因組圖譜[41]。RARB2、DAPK、hMLHI、p14 和p15的高甲基化均會(huì)增加乳腺癌的易感性[42，43]。在雌激素受體陽性乳腺癌的發(fā)展過程中，miR-190b的上調(diào)可能通過啟動(dòng)子DNA 甲基化的缺失而發(fā)生，miR-190b的低甲基化導(dǎo)致LuminalA 亞型乳腺癌特異性生存率的增加[44，45]。BRCA1 和BRCA2 突變攜帶者cf-DNA 水平明顯高于非攜帶者，這一發(fā)現(xiàn)有助于高危婦女早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌/卵巢癌[46]。乳腺導(dǎo)管癌組的FHIT 基因ct-DNA 甲基化水平非常高，有助于乳腺導(dǎo)管癌的早期診斷[47]。cfDNA的甲基化評估可以同時(shí)篩查乳腺癌、直腸癌和肺癌[48]。以上這些研究為乳腺癌的cf-DNA 檢測提供了靶點(diǎn)，未來的研究可以用這些靶點(diǎn)對乳腺癌進(jìn)行早期診斷和篩查及鑒別診斷。但cf-DNA 在乳腺癌的早期診斷和篩查也存在不足。作為一種生物化學(xué)檢測方式，cf-DNA 在乳腺癌檢測中如何優(yōu)化最佳靶點(diǎn)、提升特異度和敏感度、提高準(zhǔn)確率等都是需要解決的問題。

3.2 療效和預(yù)后評估 病理檢查是診斷腫瘤“金標(biāo)準(zhǔn)”。但病理檢查是一種高侵襲性、昂貴且耗時(shí)的方法，不適用于少量的腫瘤組織或療效檢測以及腫瘤的預(yù)后評估。血清cf-DNA 水平及其完整性可作為乳腺癌的輔助診斷、腫瘤分級(jí)和預(yù)后評估的生物標(biāo)志物[49，50]。測序技術(shù)對乳腺癌患者血清cf-DNA的檢測具有足夠的穩(wěn)定性和特異性[51]。另外血清樣本可長期保存，在監(jiān)測乳腺癌預(yù)后方面具有重要作用。檢測總cf-DNA 水平是評估轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者總生存率和無進(jìn)展生存率的良好預(yù)測指標(biāo)[52]。在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中，接受治療后患者的cf-DNA 濃度降低，cf-DNA 完整性增加。cf-DNA 變量組合可以作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者在基線和第一個(gè)系統(tǒng)治療周期后的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物[53]。cf-DNA 腫瘤率閾值≥10%與三陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移患者生存率顯著降低相關(guān)[54，55]。高cf-DNA 突變負(fù)荷與較低的無復(fù)發(fā)生存率相關(guān)，cf-DNA 中腫瘤特異性體細(xì)胞變體的存在與較差的無復(fù)發(fā)生存率相關(guān)[56，57]?？傊?，cf-DNA檢測可以反復(fù)進(jìn)行，在監(jiān)測乳腺癌分子進(jìn)化、治療效果及預(yù)后評估方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢。

4 總結(jié)

乳腺癌是世界范圍內(nèi)女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，早期無創(chuàng)診斷對降低癌癥相關(guān)死亡至關(guān)重要。cf-DNA 在乳腺癌早期診斷和篩查、療效檢測、預(yù)后評估等方面的應(yīng)用還面臨著諸多問題，需要進(jìn)一步深入研究。作為一個(gè)具有潛在價(jià)值的生物標(biāo)志，相信隨著研究的不斷深入，cf-DNA 在乳腺癌中的作用會(huì)逐漸被揭示并最終應(yīng)用到臨床。