結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

陽 央，侯 歡，馮 智，李 慧，李芳芹*

(1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2.延安市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科； 3.延安大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；陜西 延安 716000)

目前，結(jié)核病仍是傳染病的頭號(hào)殺手，每年導(dǎo)致數(shù)百萬人的死亡。耐藥結(jié)核病診斷和治療的延遲是造成結(jié)核持續(xù)蔓延和治療失敗的一個(gè)重要因素，我國(guó)是僅次于印度的全球耐藥結(jié)核病第二大國(guó)，結(jié)核病疫情嚴(yán)峻。在我國(guó)結(jié)核病新疫情的背景下，傳統(tǒng)的結(jié)核病檢測(cè)方法已經(jīng)不能滿足當(dāng)前我國(guó)結(jié)核防控的要求，尤其是耐多藥、廣泛耐藥結(jié)核病的診斷和治療。近年隨著結(jié)核菌分子耐藥機(jī)制的闡明，耐藥相關(guān)靶基因突變的快速檢測(cè)系統(tǒng)也逐步應(yīng)用于臨床。我們對(duì)幾種結(jié)核耐藥基因檢測(cè)方法及研究進(jìn)展進(jìn)行概述。

1 結(jié)核分枝桿菌重要分子耐藥機(jī)制

世界衛(wèi)生組織將抗結(jié)核藥物從最有效、最常用的藥物(第1組)到很少使用和療效不明確的藥物(第5組)分類。結(jié)核分枝桿菌最重要的耐藥機(jī)制是由于染色體上基因突變，這些突變包括單核苷酸的改變，小的插入和缺失或更大的缺失，目前相關(guān)耐藥基因主要有inhA和katG(異煙肼)、rpoB(利福平)、EmbB(乙胺丁醇)、gyrA和gyrB(氟喹諾酮類)，eis(卡那霉素)，RpsL(鏈霉素)，rrs(鏈霉素，阿米卡星/卡那霉素/卷曲霉素)，pncA(吡嗪酰胺)[1]。

2 Gene Xpert MTB/RIF技術(shù)(美國(guó)Cepheid)

Xpert MTB/RIF是一個(gè)集成的、自動(dòng)化的、基于墨盒的系統(tǒng)，與Gene Xpert儀器一起使用，用于快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥性相關(guān)突變，在兩個(gè)小時(shí)內(nèi)可獲得結(jié)果，其操作步驟非常簡(jiǎn)單，只需要對(duì)痰進(jìn)行一步前期處理即可，也不需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室分區(qū)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求及實(shí)驗(yàn)人員要求不高，是一種低風(fēng)險(xiǎn)的操作程序，其生物安全的防護(hù)級(jí)別與臨床上痰涂片抗酸染色鏡檢操作相當(dāng)，但儀器試劑費(fèi)用非常昂貴，因此，這種方法非常適用于大型三甲醫(yī)院對(duì)疑似結(jié)核患者的快速篩查。在全球Xpert MTB/RIF廣泛應(yīng)用于結(jié)核病快速檢測(cè)，快速檢測(cè)是否有結(jié)核分枝桿菌主要針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的IS6110靶點(diǎn)，可用于成人及兒童各種肺內(nèi)和肺外結(jié)核標(biāo)本的快速檢測(cè)(痰、肺泡灌洗液、腦脊液、胃液、胸水、淋巴組織等)，除對(duì)胸水檢測(cè)敏感度欠佳外，其余標(biāo)本檢測(cè)與培養(yǎng)法相當(dāng)。利福平耐藥性檢測(cè)主要覆蓋含81bp序列的rpoB基因，利福平耐藥菌株中，約有95%的菌株是由于rpoB基因突變導(dǎo)致的，因此，快速的應(yīng)用該方法檢測(cè)利福平耐藥性對(duì)發(fā)現(xiàn)耐多藥結(jié)核十分重要。該方法可同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)和利福平耐藥性，整個(gè)過程僅需2 h[2]，雖然利福平耐藥并不是耐多藥結(jié)核(MDR-TB)的完全替代標(biāo)記，但它被認(rèn)為是MDR-TB的最重要指標(biāo)，因?yàn)槌^90%的利福平耐藥菌株同時(shí)耐異煙肼[3-4]。Xpert MTB/RIF法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)痰涂陽標(biāo)本的臨床敏感性為96.8%～99.0%，對(duì)涂陰痰標(biāo)本的敏感性為65.4%～78.7%[2，5]，一項(xiàng)納入36項(xiàng)研究的Meta分析顯示Gene Xpert檢測(cè)肺外結(jié)核的綜合靈敏度77%，特異性97%[6]。Gene Xpert用于骨與關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷中，敏感性高于涂片、培養(yǎng)和線性探針(82%對(duì)26%、48%和72%)，特異性100%[7]。在泌尿系結(jié)核中敏感性也明顯高于涂片和培養(yǎng)(63%對(duì)18.5%和45.7%)[8]。Gene Xpert檢測(cè)RIF耐藥性的敏感性為87.10%～94.0%[9-10]，特異性為94%～98%[10-11]。然而對(duì)Gene Xpert來說，敏感細(xì)菌的存在會(huì)導(dǎo)致優(yōu)先擴(kuò)增曲線的出現(xiàn)，從而導(dǎo)致對(duì)耐藥菌含量少RIF異質(zhì)性耐藥的漏檢，該方法也不適用于抗結(jié)核治療的療效監(jiān)測(cè)[12]，最近有研究說明Gene Xpert快速檢測(cè)雖然使結(jié)核患者得到了及時(shí)的治療，但患者的預(yù)后和死亡率方面并沒有明顯改善，同時(shí)昂貴的價(jià)格在經(jīng)濟(jì)落后地區(qū)造成患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)加重，在一方面該方法目前存在局限性，僅能檢測(cè)MTBC和利福平耐藥性[13-15]。世衛(wèi)組織建議使用Xpert MTB/RIF法作為MDR-TB風(fēng)險(xiǎn)人群的初步測(cè)試，其依據(jù)是與傳統(tǒng)培養(yǎng)和利福平耐藥DST相似的準(zhǔn)確性[16]，Xpert MTB/RIF的優(yōu)點(diǎn)是，對(duì)于使用液體介質(zhì)和固體介質(zhì)需要幾個(gè)月才能提供結(jié)果的檢測(cè)，該檢測(cè)方法可以在24 h內(nèi)提供結(jié)果，而不是在幾周內(nèi)提供結(jié)果。Gene Xpert目前只能對(duì)利福平耐藥性進(jìn)行檢測(cè)，在檢測(cè)異質(zhì)性耐藥方面仍然存在差距，突變體在50%以上才能發(fā)現(xiàn)，因此，對(duì)于存在低頻異質(zhì)性耐藥標(biāo)本可能存在檢測(cè)假陰性，同時(shí)該檢測(cè)方法忽視了INHR-TB患者，這可能導(dǎo)致MDR-TB進(jìn)一步產(chǎn)生。Xpert MTB/RIF檢測(cè)是一種自動(dòng)化的分子檢測(cè)方法，提高了結(jié)核菌和利福平耐藥的檢測(cè)水平，但其敏感性在含菌量少的患者或HIV患者中是不夠的，因此，近來開發(fā)了新一代的Xpert MTB/RIFUltra(Xpert Ultra)系統(tǒng)，該方法使用了2個(gè)不同的多拷貝結(jié)核分枝桿菌靶標(biāo)，包括IS6110和IS1081，PCR體系也由原來的25 μL擴(kuò)大至50 μL。研究發(fā)現(xiàn)在137例痰涂陰培養(yǎng)陽性標(biāo)本，Xpert Ultra和Xpert的敏感度分別為63%和46%，115名HIV陽性者的培養(yǎng)陽性痰的敏感度分別為90%和77%，在所有462名痰培養(yǎng)陽性者中，敏感度分別為88%和83%，Xpert Ultra和Xpert對(duì)新發(fā)結(jié)核病病例檢測(cè)的特異性分別為96%和98%，對(duì)有結(jié)核病病史的患者特異性分別為93%和98%，然而Xpert Ultrat在檢測(cè)利福平耐藥性方面與Xpert相比并沒有表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)，兩者利福平耐藥性檢測(cè)性能表現(xiàn)相似[17]。

3 Geno Type MTBDRplus

Geno MDRTBplus(Hain，德國(guó))，它可以在一次試驗(yàn)中同時(shí)檢測(cè)RIF和INH的耐藥突變，通過檢測(cè)rpoB基因突變確定利福平耐藥性，同時(shí)檢測(cè)KatG和inhA基因突變確定異煙肼耐藥性，只需1～2 h，并且已得到了廣泛的驗(yàn)證[18]。然而，這種基于反向雜交的檢測(cè)需要多次PCR后操作，而顏色讀數(shù)則需要目測(cè)。此外，由于可在膜上動(dòng)員的探針數(shù)量有限，因此只涉及有限數(shù)量的頻繁突變[19]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)Geno MDRTBplus檢測(cè)性能評(píng)估顯示：Geno MDRTBplus檢測(cè)利福平耐藥性的靈敏度82.8%～97.5%，特異度99.3%～100%，檢測(cè)異煙肼耐藥性的靈敏度80.4%～88.2%，特異度94.9%～100%[20-23]。近年Geno MDRTBplus也開發(fā)了新一代的Geno MDRTBsl，增加了對(duì)乙胺丁醇、喹諾酮類和氨基糖苷類藥物的耐藥性，但因其價(jià)格因素和操作繁瑣，限制了在我國(guó)的廣泛使用。

4 熒光探針PCR熔解曲線法(MeltPro中國(guó)致善)

熒光探針PCR熔解曲線法是一種基于閉合管、雙色、熔解曲線分析的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法。該技術(shù)是基于雙標(biāo)記自淬探針的PCR后熔解曲線分析的一種定性診斷方法[24]，它檢索了MTBC從野生型轉(zhuǎn)變?yōu)榛蛲蛔冃偷牡娜劢鉁囟?Tm)，該方法的內(nèi)在特點(diǎn)使其能夠在一次試驗(yàn)中覆蓋與耐藥性相關(guān)的兩個(gè)片段(每個(gè)片段超過20個(gè)連續(xù)核苷酸)，它也很容易完成，而不需要繁瑣的雜交[25-26]。目前試劑盒能同時(shí)檢測(cè)五種藥物耐藥性包括：利福平、異煙肼、喹諾酮類、乙胺丁醇和鏈霉素。對(duì)利福平和異煙肼耐藥性檢測(cè)表現(xiàn)良好，通過檢測(cè)結(jié)核菌的rpoB基因突變來確定利福平耐藥性，通過檢測(cè)KatG315密碼子、inhA啟動(dòng)子區(qū)(-17～-8位點(diǎn))、inhA94密碼子、以及ahpC啟動(dòng)子區(qū)(-44～-30位點(diǎn)及-15～3位點(diǎn))是否存在突變來確定異煙肼的耐藥性。喹諾酮類、乙胺丁醇和鏈霉素耐藥突變的檢測(cè)性能不如利福平、異煙肼，目前國(guó)內(nèi)對(duì)其研究評(píng)價(jià)的報(bào)道也較少。由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心趙雁林團(tuán)隊(duì)率領(lǐng)的一個(gè)研究組近日在Scientific Report發(fā)表文章，報(bào)道了該方法檢測(cè)痰樣本的臨床評(píng)價(jià)結(jié)果，以MGIT 960藥敏試驗(yàn)系統(tǒng)比例法為參考標(biāo)準(zhǔn)，該方法對(duì)利福平耐藥性檢測(cè)的靈敏度為94.2%，對(duì)異煙肼耐藥性檢測(cè)的靈敏度為84.9%，特異度分別為97.5%、98.0%，對(duì)二線藥的靈敏度為：氧氟沙星83.3%，阿米卡星75.0%，卡那霉素63.5%[27]。此外，該方法可以識(shí)別出野生型種群中20%的突變樣本，這與sanger測(cè)序所能檢測(cè)到的突變率接近[26]。混合細(xì)菌樣本的可探測(cè)性將使人們能夠密切監(jiān)測(cè)疾病狀況，并及時(shí)采取替代治療戰(zhàn)略。重要的是，該方法檢測(cè)顯示與普通非結(jié)核分枝桿菌菌株無交叉反應(yīng)，這一特性不僅保證了該方法的特異性，而且還可將其應(yīng)用于各種臨床標(biāo)本。跨平臺(tái)兼容性研究表明，該檢測(cè)系統(tǒng)可以在六種實(shí)時(shí)PCR機(jī)上進(jìn)行，從而使它成為市場(chǎng)上幾乎所有主流的實(shí)時(shí)PCR儀器的一種開放的檢測(cè)方法，但該檢測(cè)技術(shù)對(duì)前期結(jié)核DNA的提純要求較高，同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)各種復(fù)雜的熔解曲線，這不僅需要有一定技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室人員也需要有較全面的耐藥機(jī)制知識(shí)的儲(chǔ)備，因此，本文作者認(rèn)為這種方法更適用于結(jié)核病專科醫(yī)院對(duì)結(jié)核菌耐藥性檢測(cè)多種方法的相互驗(yàn)證。

5 全基因組測(cè)序技術(shù)(Whole-genomesequencing，WGS)

由于檢測(cè)速度快，通量高，WGS已逐漸用于臨床的輔助診斷中。由牛津大學(xué)領(lǐng)銜的全球多中心合作計(jì)劃資助的一項(xiàng)研究，收集了臨床分離的10290株結(jié)核分枝桿菌，遍及6大洲，16個(gè)國(guó)家[28]，隨后針對(duì)這些菌株進(jìn)行了4種一線抗結(jié)核藥物(異煙肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺)表型藥敏檢測(cè)和WGS分析?；谌蚪M序列的藥敏分析主要聚焦于9個(gè)基因以及上游調(diào)控區(qū)，這些基因區(qū)域包括：ahpC、inhA、fabG1和katG、rpoB、embA、embB和embC以及pncA。對(duì)于異煙肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺的WGS耐藥性預(yù)測(cè)的靈敏度分別為97.1%、97.5%、94.6%和91.3%，特異度分別為99.0%、98.8%、93.6%和96.8%[31]。從已有的結(jié)核分枝桿菌臨床菌株全基因組序列數(shù)據(jù)出發(fā)分析WHO推薦的分子檢測(cè)技術(shù)(如Xpert MTB/RIF、MTBDRplus和MTBDRsl等)的檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這些分子檢測(cè)方法檢測(cè)異煙肼、利福平和乙胺丁醇的敏感度顯著低于基于WGS的預(yù)測(cè)(P<0.001)，但對(duì)于異煙肼和乙胺丁醇的檢測(cè)，WHO推薦的分子檢測(cè)技術(shù)特異性明顯高于WGS的預(yù)測(cè)(P<0.001)。對(duì)于所有的4種一線藥物，WGS藥敏分析的陰性預(yù)測(cè)值都在98.5%以上。近年也發(fā)展了二代測(cè)序技術(shù)(NGS)，可以更全面分析抗結(jié)核藥物耐藥性，在一次分析中不但能獲得全面的耐藥信息，還可進(jìn)行菌種的鑒定、致病性預(yù)測(cè)和傳播方式等。NGS是被認(rèn)為檢測(cè)結(jié)核菌耐藥性最有前途的技術(shù)，可檢測(cè)敏感和耐藥結(jié)核菌的混合感染，并且可以檢測(cè)到1%異質(zhì)性耐藥。雖然NGS在各方面都表現(xiàn)得十分優(yōu)越，但商品化在臨床上的應(yīng)用仍存在許多挑戰(zhàn)，目前，基于純培養(yǎng)物的二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)耐藥性結(jié)果可靠性較高，而對(duì)臨床痰標(biāo)本的直接測(cè)序還面臨挑戰(zhàn)，主要是直接從痰標(biāo)本中提取結(jié)核DNA純度要求高，目前基于痰標(biāo)本處理后的直接測(cè)序結(jié)果不可靠。與現(xiàn)有的基于PCR技術(shù)的分子藥敏檢測(cè)方法相比，基于WGS和NGS的藥敏預(yù)測(cè)具有更高的表現(xiàn)性能，而且WGS、NGS能檢測(cè)所有的耐藥相關(guān)性突變，而每一個(gè)少見突變都可能有未知的耐藥表型，這為更詳盡的了解結(jié)核的耐藥性提供了數(shù)據(jù)。

綜上所述，各種快速結(jié)核耐藥性檢測(cè)的分子學(xué)方法各有優(yōu)勢(shì)，同時(shí)存在一定局限性。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)法及表型藥敏試驗(yàn)仍是結(jié)核病必需的，單一的快速分子學(xué)方法具有一定限制性，需多種不同分子學(xué)方法檢測(cè)工具進(jìn)行相互驗(yàn)證，只有聯(lián)合應(yīng)用綜合分析，可能是目前我們依靠分子學(xué)方法進(jìn)行結(jié)核快速診斷和治療的可靠依據(jù)。