炎調(diào)方抑制肺泡上皮細(xì)胞凋亡減輕肺水腫機(jī)制假說

歐陽洋，施 榮（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203）

膿毒癥易導(dǎo)致急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（acute lung injury/acute respiratory distress syndrome，ALI/ARDS），肺水腫是其主要病理生理表現(xiàn)，治療存難點(diǎn)。肺泡上皮細(xì)胞（alveolar epithelial cell，AEC）上的鈉水轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)維持肺泡內(nèi)外液體平衡。II型肺泡上皮細(xì)胞（type II alveolar epithelial cell，AECII）是I型肺泡上皮細(xì)胞（type I alveolar epithelial cell，AECI）的前體細(xì)胞，膿毒癥導(dǎo)致的AEC受損是肺水腫形成及加重的關(guān)鍵。AEC損傷的主要表現(xiàn)為AECII凋亡增加、向AECI分化減少、AECI受損等。研究顯示，以caspase-8為中心的死亡受體通路調(diào)控AECII凋亡。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，炎調(diào)方能減少脂多糖導(dǎo)致的AECII凋亡，減輕ALI/ARDS大鼠肺水腫。現(xiàn)結(jié)合以上研究基礎(chǔ)，擬探討炎調(diào)方抑制AEC凋亡、減輕膿毒癥致ALI/ARDS肺水腫的機(jī)制假說。

1 AEC凋亡與膿毒癥導(dǎo)致的肺水腫

膿毒癥易誘發(fā)膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）。膿毒癥導(dǎo)致的ARDS其60 d死亡率可達(dá)38.2%[1]，探索有效的治療方案是目前研究熱點(diǎn)。膿毒癥導(dǎo)致的ALI/ARDS發(fā)生涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，其主要病理是肺水腫，多種細(xì)胞參與ALI/ARDS病理生理過程[2-4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，AEC在ALI/ARDS發(fā)生發(fā)展中起重要作用，參與其主要病理生理肺水腫的整個(gè)過程[5-7]。膿毒癥導(dǎo)致的AEC受損、維持肺泡內(nèi)外液體平衡能力降低是肺水腫形成及加重的關(guān)鍵。

1.1 膿毒癥與肺水腫

ALI/ARDS發(fā)生的病理實(shí)質(zhì)是肺泡內(nèi)及肺間質(zhì)大量液體產(chǎn)生，最終形成高通透性水腫[8]。膿毒癥失控的炎癥反應(yīng)引起多種炎癥因子導(dǎo)致AEC受損，大量血管內(nèi)液滲透至肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)，導(dǎo)致液體在肺泡內(nèi)聚集，肺內(nèi)分流增加，形成嚴(yán)重通氣/血流比例失調(diào)[9]。中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)被激活或破壞，釋放彈性蛋白酶等，使彈性蛋白分解，破壞上皮細(xì)胞間的緊密連接，增加血管通透性，大量血漿蛋白和活性物質(zhì)滲透到肺間質(zhì)中，造成肺水腫[4]。肺泡巨噬細(xì)胞合成多種炎性因子，啟動(dòng)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，致肺泡及間質(zhì)中多形核細(xì)胞增加并激活，產(chǎn)生呼吸爆發(fā)，破壞AEC細(xì)胞膜完整性，使肺泡清除黏液能力下降，肺泡內(nèi)滲出大量組織間液以及細(xì)胞內(nèi)液，形成肺水腫[10]。在肺部聚集的多種炎性介質(zhì)可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，產(chǎn)生血小板活化因子，直接作用在肺血管的內(nèi)皮細(xì)胞膜，使內(nèi)皮細(xì)胞的連接松散、血管的通透性增加形成肺水腫[11]。

1.2 AEC與肺水腫

肺泡是氣體在肺進(jìn)行氣體交換的基本單位，肺有數(shù)百萬個(gè)肺泡組成，肺泡僅由兩種細(xì)胞組成，即AECI和AECII。成人約90%以上的AEC為AECI，其與肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密聯(lián)系。近年研究發(fā)現(xiàn)，雖然AECI具有潛在分化能力，但AECII仍然是AECI前體細(xì)胞，對(duì)AECI進(jìn)行補(bǔ)充，在肺泡損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。AECI主要功能有維持肺泡結(jié)構(gòu)，與基底膜、肺泡壁毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞共同組成血?dú)馄琳?，?fù)責(zé)氣體交換。同時(shí)，AECI還參與肺泡水、離子及蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，具有Na+、K+、Cl-等離子的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。研究顯示，AECI負(fù)責(zé)肺部約60%的液體轉(zhuǎn)運(yùn)[12]。AECII位于肺泡表面的凹陷處，覆蓋約5%的肺泡表面，占AEC總數(shù)的14%～16%。AECII重要功能為維持正常肺水轉(zhuǎn)運(yùn)，保障肺泡內(nèi)外液體平衡[13]。AECII還可以通過合成和分泌肺泡表面活性磷脂和蛋白，維持肺泡表面張力、防止肺泡塌陷。

肺泡和遠(yuǎn)端氣道上皮細(xì)胞的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制是肺泡內(nèi)液體的主要清除方式[14]。AEC鈉水轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)主要由上皮鈉通道（epithelial sodium channel，ENaC）、Na+-K+-ATP酶（NKA）、水通道蛋白（aquaporin，AQP）組成[15-16]。AEC主要通過跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)肺水轉(zhuǎn)運(yùn)（肺泡液的吸收和分泌），主要包括ENaC和NKA，過量肺泡液的吸收依賴于NKA和ENaC活性[17]。ENaC是一種跨膜蛋白，由α、β、γ三個(gè)同源亞基組成，是肺內(nèi)液體轉(zhuǎn)運(yùn)的重要通道，AECII上的鈉通道以ENaC-α為主[17]。AECI上也存在ENaC，其鈉通道數(shù)量是AECII的3倍。AECI覆蓋面占肺泡總面積的90%，在鈉水轉(zhuǎn)運(yùn)系中可能比AECII細(xì)胞占有更重要的地位[13]。ENaC、NKA和AQP共同使液體被動(dòng)從空氣間層向組織間隙移動(dòng)，這就是肺泡液體清除。這個(gè)過程是肺泡發(fā)生水腫后液體重吸收的關(guān)鍵，當(dāng)肺泡對(duì)液體和血漿蛋白的通透性增加時(shí)，正因?yàn)橛蠩NaC介導(dǎo)的肺泡液體清除，才能維持肺泡高效的氣體交換功能[14]。

1.3 膿毒癥與AEC

在ALI/ARDS病理生理中，雖然多種炎癥細(xì)胞及介質(zhì)參與肺水腫的形成，但AEC對(duì)液體重吸收能力是平衡肺部液體的關(guān)鍵，AEC受損與肺水腫的形成與加重密切相關(guān)[12,18]。研究顯示，AEC損傷貫穿ALI/ARDS滲出期、增殖期、纖維化期始終[3]。AEC受損，轉(zhuǎn)運(yùn)肺泡內(nèi)液體能力降低，氣體交換能力下降，肺泡表面活性物質(zhì)合成減少，消耗增加，活性降低以及呼吸膜破壞，最終導(dǎo)致肺泡閉陷，形成及加重肺水腫[19]。

1.3.1 AEC凋亡與膿毒癥在ALI/ARDS滲出期、增殖期、纖維化期過程中，AECII凋亡貫穿始終[3,20]。在20世紀(jì)90年代，研究者發(fā)現(xiàn) ARDS 患者AEC表現(xiàn)為DNA斷裂、染色質(zhì)濃縮等細(xì)胞凋亡特點(diǎn)，調(diào)控細(xì)胞凋亡的Bcl-2 家族蛋白表達(dá)明顯升高。隨后又發(fā)現(xiàn)，在ARDS患者支氣管肺泡灌洗液中，與凋亡相關(guān)的蛋白Fas/FasL明顯升高[21]。研究證實(shí)，與膿毒癥相關(guān)的腫瘤壞死因子α及脂多糖等均可引起AECII凋亡增加[22]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥致ARDS死亡患者肺組織中，凋亡相關(guān)標(biāo)記物較非ARDS 病死患者明顯升高。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，氣管內(nèi)注入脂多糖致ALI大鼠，6 h后即可檢測(cè)到AEC凋亡增加。抑制AECII凋亡可降低ALI/ARDS小鼠的死亡率[23]。AECII凋亡增加將減弱維持肺泡內(nèi)外液體平衡的能力，并導(dǎo)致AECII向AECI分化減少，進(jìn)一步加重肺水腫。抑制AECII凋亡可以減輕由膿毒癥誘發(fā)的ARDS，改善ARDS預(yù)后。

AECI對(duì)炎癥引起的損傷十分敏感，在膿毒癥致ALI/ARDS形成過程中，AECI廣泛受損是ALI/ARDS的常見形態(tài)學(xué)特征，且較AECII更早出現(xiàn)。觀察發(fā)現(xiàn)，受損的AECI主要表現(xiàn)為細(xì)胞頂端膜形成大皰樣，肺泡腔可見有殘膜及受損細(xì)胞脫落。研究顯示，當(dāng)AEC I暴露于與膿毒癥相關(guān)炎癥因子中約8～12 h即出現(xiàn)結(jié)構(gòu)損傷，48 h后絕大部分受損的AECI被AECII替代[24]。在AEC損傷過程中，AECI最早出現(xiàn)，受損的AECI可由AECII迅速進(jìn)行補(bǔ)充以維持正常功能。轉(zhuǎn)分化的特征在于AECII細(xì)胞標(biāo)記物的下調(diào)、AECI細(xì)胞標(biāo)記物的上調(diào)和細(xì)胞擴(kuò)散，導(dǎo)致形態(tài)從立方形變?yōu)轺[狀，從而恢復(fù)正常的肺泡結(jié)構(gòu)和功能[25]。AECI損傷直接導(dǎo)致鈉水轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)功能降低，AECI維持肺泡液體平衡能力下降，大量液體在肺泡內(nèi)聚集，加重肺水腫。

1.3.2 caspase-8與AEC凋亡細(xì)胞凋亡指機(jī)體為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主且有序的死亡。有三種細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑，分別為外源性（死亡受體介導(dǎo)凋亡）信號(hào)通路、內(nèi)源性（細(xì)胞線粒體介導(dǎo)凋亡）信號(hào)通路以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)途徑。死亡受體通路是比較成熟的通路，目前有5種死亡受體被發(fā)現(xiàn)，分別為腫瘤壞死因子受體1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）、凋亡相關(guān)因子Fas、死亡受體3（death receptor 3，DR3），腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體-1（TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 1，TRAIL-R1）或DR4，TRAIL-R2或DR5。caspase是一種促使細(xì)胞凋亡的蛋白酶[26]，在細(xì)胞凋亡機(jī)制網(wǎng)絡(luò)中處于核心地位[27]。研究顯示，死亡受體通路與AECII凋亡密切相關(guān)，F(xiàn)as、TNFαR、DR3等死亡受體均可被各自的配體激活后，最終活化caspsae-8，誘發(fā)凋亡[28-29]。死亡受體通路主要通過三條途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡：TNFR途徑、TRAIL途徑、Fas/FasL途徑。caspase-8參與三條途徑發(fā)揮作用。①TNFR途徑。TNF-α通過TNFR-I和TNFR-II介導(dǎo)其生物學(xué)活性，最終激活caspase，caspase發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而激活死亡受體通路。②TRAIL途徑。公認(rèn)的TRAIL受體至少 有5種：TRAIL-R1（DR4）、TRAIL-R2（DR5）、TRAIL-R3（LIT，DcR1）、FRAIL-R4（TRUNDD，DcR2）、可溶性的護(hù)骨素。DR4和DR5的配體使細(xì)胞發(fā)生凋亡，TRAIL通過黏附于DR4或DR5使受體發(fā)生三聚化，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（death-inducing signaling complex，DISC）。caspase-8可被DISC激活。激活的caspase-8通過兩條凋亡信號(hào)途徑發(fā)揮作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其一是caspase-8直接激活caspase-3、caspase-6、caspase-7，經(jīng)外源性途徑誘導(dǎo)凋亡。其二是caspase-8通過激活Bid與線粒體連接，激活內(nèi)源途徑誘導(dǎo)凋亡。③Fas/FasL途徑。Fas/FasL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是由細(xì)胞表面的Fas受體與FasL三聚體結(jié)合，通過一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終形成DISC。procaspase-8被激活分解成有活性的caspase-8，有活性的caspase-8和caspase-l0片段可以繼續(xù)激活其下游的caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而使細(xì)胞發(fā)生凋亡。

2 炎調(diào)方抑制AEC凋亡減輕肺水腫假說

2.1 炎調(diào)方立方依據(jù)

ALI/ARDS以進(jìn)行性低氧血癥和呼吸窘迫為特征，其主要中醫(yī)臨床證候?yàn)榇?、高熱、便秘、舌絳、脈滑數(shù)等，可歸屬于中醫(yī)“喘證”“結(jié)胸”“暴喘”“喘脫”等范疇。當(dāng)前中醫(yī)治法多以清熱化痰、瀉肺通腑、解毒祛瘀、補(bǔ)虛固脫、益氣利水等法[30]。綜合研究發(fā)現(xiàn)，中西醫(yī)結(jié)合治療本病優(yōu)勢(shì)明顯。

近年來，我們一直從事中西醫(yī)治療ALI/ARDS，通過總結(jié)分析，綜合各醫(yī)家所長(zhǎng)，認(rèn)為膿毒癥所致ALI/ARDS患者，雖癥狀各異，然其病機(jī)相同，皆由外感熱毒傳里，熱毒積聚，毒陷入腑，容于營血所致，腑實(shí)營熱乃其病機(jī)。基于以上理論，通腑清營法切中該病病機(jī)。并自擬炎調(diào)方（生大黃、芒硝、桃仁、赤芍、玄參、當(dāng)歸、銀花、連翹、麥冬）應(yīng)用于臨床治療膿毒癥所致ALI/ARDS。方中生大黃、芒硝、桃仁具有釜底抽薪、通腑存陰之功，共為君藥；赤芍、玄參清營瀉火、涼血滋陰，為臣藥；銀花、連翹清熱解毒，輕清透泄，使?fàn)I分熱邪有外達(dá)之機(jī)，促其透出氣分而解，此即“入營猶可透熱轉(zhuǎn)氣”之具體應(yīng)用；佐以麥冬補(bǔ)其耗傷之津，當(dāng)歸活血通便，全方配伍共奏通腑清營之功。

2.2 炎調(diào)方與膿毒癥致ALI/ARDS

膿毒癥的始發(fā)因素是感染，感染所引起失控的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致大量炎癥介質(zhì)及細(xì)菌毒素入血，在肺部聚集，是形成ALI/ARDS的關(guān)鍵。因此，治療的焦點(diǎn)除積極抗感染外，也聚焦在清除爆發(fā)的炎癥介質(zhì)，緩解失控的炎癥反應(yīng)方面，以期減輕肺水腫，糾正低氧血癥。近年來，我們前期研究從炎癥反應(yīng)入手，通過臨床觀察，我們發(fā)現(xiàn)炎調(diào)方能有效降低膿毒癥患者血清多種炎癥介質(zhì)如IL-2、TNF-α、IL-6等的水平，提高ALI/ARDS患者氧合指數(shù)水平，縮短機(jī)械通氣治療時(shí)間[31-33]。以上結(jié)果說明，炎調(diào)方能有效治療膿毒癥致ALI/ARDS患者。

2.3 炎調(diào)方-AEC凋亡-肺水腫

同樣，我們開展了基礎(chǔ)研究，通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)對(duì)大鼠進(jìn)行ALI/ARDS造模，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，電鏡下可見模型組大鼠肺組織肺泡壁充血、增厚，肺泡內(nèi)及肺間質(zhì)水腫范圍擴(kuò)大，肺組織明顯實(shí)變。與模型組相比，炎調(diào)方組可見病變范圍較小，肺實(shí)變較輕。以上結(jié)果提示炎調(diào)方能減輕ALI/ARDS大鼠肺水腫，保護(hù)大鼠肺組織[34-35]。為進(jìn)一步明確其減輕肺水腫的機(jī)制，我們從細(xì)胞水平也進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，我們?cè)蛛x并培養(yǎng)AECII細(xì)胞，通過加入脂多糖模擬ALI/ARDS體外模型，炎調(diào)方能明顯減少脂多糖導(dǎo)致的AECII細(xì)胞凋亡。同時(shí)結(jié)果還顯示，脂多糖能明顯激活A(yù)ECII細(xì)胞caspase-8和caspase-3活性，提高Fas和FasL的水平；當(dāng)加入炎調(diào)方藥物血清后，以上凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平能被炎調(diào)方明顯抑制，提示炎調(diào)方能抑制AECII凋亡可能與抑制caspase-8活性以及Fas和FasL的表達(dá)有關(guān)。但炎調(diào)方減輕肺水腫的具體機(jī)制仍待進(jìn)一步明確。為深入探索炎調(diào)方減輕膿毒癥致ALI/ARDS肺水腫的機(jī)制，我們提出以下假說：炎調(diào)方通過死亡受體通路及caspase-8抑制AECII凋亡，并促進(jìn)AECII向AECI轉(zhuǎn)化，防止AECI受損，維持肺泡內(nèi)外液體平衡，從而達(dá)到減輕肺水腫，保護(hù)肺組織的作用。

3 結(jié)語

綜上所述，AECI和AECII共同維持肺泡內(nèi)外液體平衡，AECII是AECI的前體細(xì)胞，對(duì)AECI進(jìn)行補(bǔ)充。肺水腫是膿毒癥致ALI/ARDS的核心病理，膿毒癥導(dǎo)致AECI受損和AECII凋亡增加引起肺泡液體代謝失衡是肺水腫形成及加重的關(guān)鍵；死亡受體通路及caspase-8調(diào)控AECII凋亡。我們前期研究顯示，炎調(diào)方能減輕膿毒癥致ALI/ARDS肺水腫，抑制脂多糖誘導(dǎo)的AECII凋亡。但有關(guān)炎調(diào)方抑制AECII凋亡的機(jī)制，炎調(diào)方是否對(duì)AECI有保護(hù)作用，對(duì)AEC鈉水轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是否有調(diào)控作用等仍有待進(jìn)一步明確。結(jié)合以上研究進(jìn)展，為深入探索炎調(diào)方減輕膿毒癥致ALI/ARDS肺水腫的機(jī)制，我們提出以上假說。今后工作中擬從體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，進(jìn)一步證實(shí)以上假說，為中醫(yī)藥治療膿毒癥致ALI/ARDS提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。