糖基磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)酰胺酶與肝癌

賀玲 綜述 姚克鋮 審校

根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，肝癌是世界第六大最常見(jiàn)的癌癥，每年新發(fā)病例約84萬(wàn)人，每年約78.2萬(wàn)人死于肝癌，已成為全球第四大癌癥死亡原因，其中男性的發(fā)病率及死亡率顯著高于女性[1]。而在中國(guó)，肝癌是第四大常見(jiàn)惡性腫瘤，死亡率僅次于肺癌，位居第二[2]。目前乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)仍然是全球肝癌最重要的危險(xiǎn)因素，隨著新生兒疫苗的接種及對(duì)HBV和HCV慢性感染的有效治療使它們的重要性逐漸下降，然而代謝綜合征、非酒精性脂肪性肝病、過(guò)量飲酒及某些地區(qū)糧食作物黃曲霉毒素污染等肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)的危險(xiǎn)因素正在增加。由于肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)異常復(fù)雜的過(guò)程，從癌前病變到原發(fā)性肝細(xì)胞癌是由多種因素如病毒感染、基因突變或表達(dá)異常、蛋白表達(dá)或修飾異常、信號(hào)通路異常等綜合作用的結(jié)果[3]。肝切除術(shù)是治愈肝細(xì)胞癌的主要方法，隨著化療方案的改進(jìn)、新藥的研發(fā)及支持治療的進(jìn)步，患者5年生存率明顯上升，但仍有相當(dāng)多的患者出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。糖基磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)酰胺酶(Glycosylphosphatidylinositol transamidase，GPI-T)是一種在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)現(xiàn)的膜結(jié)合的多亞基蛋白復(fù)合物，GPI-T包含五個(gè)亞基：PIGK、GAA1、PIGS、PIGT和PIGU，其中PIGK為催化亞基，GAA1、PIGT、PIGU可以形成一個(gè)與PIGS相關(guān)的核心復(fù)合體，這四個(gè)亞基可以穩(wěn)定PIGK，觸發(fā)GPI錨定反應(yīng)，缺少任何一個(gè)亞基可導(dǎo)致PIGK不穩(wěn)定，以此確保GPI的錨定僅由完全組裝的復(fù)合物催化[4]。GPI-T識(shí)別附著在GPI錨定化修飾的蛋白羧基端的信號(hào)肽，在ω和ω后面一個(gè)氨基酸之間進(jìn)行剪切，ω位上的氨基酸通過(guò)硫脂鍵與PIGK蛋白上的半胱氨酸結(jié)合，之后被核心糖結(jié)構(gòu)上的橋連磷酸乙醇胺攻擊，最終把蛋白質(zhì)連接到GPI錨上。隨著對(duì)GPI-T亞基越來(lái)越多的研究，發(fā)現(xiàn)它參與HCC的發(fā)生發(fā)展。

1 PIGK與HCC

PIGK為GPI-T的催化亞基，大小為47 kD，屬于C13半胱氨酸蛋白酶家族，PIGK有一個(gè)指向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔側(cè)的可溶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)單一的羧基端跨膜區(qū)域，可溶性結(jié)構(gòu)域與半胱氨酸蛋白酶序列相似，對(duì)保守的組氨酸和半胱氨酸殘基的分析表明，它含有全部或部分酶催化機(jī)制，組氨酸可使半胱氨酸脫質(zhì)子，而半胱氨酸親核性攻擊ω和ω后面的一個(gè)氨基酸之間的酰胺鍵生成硫酯中間體，該中間體隨后與GPI錨定物轉(zhuǎn)化為新的酰胺，另外它還通過(guò)二硫鍵與PIGT結(jié)合[5]。研究表明PIGK參與乳腺癌和卵巢癌等腫瘤的方式為過(guò)表達(dá)，但有研究者通過(guò)免疫組化等研究發(fā)現(xiàn)它在所有類型的肝癌中均表現(xiàn)出顯著的下調(diào)[6]，另外Santanu等[7]也通過(guò)對(duì)HCC患者和肝癌細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)PIGK在HCC中是低表達(dá)的，它通過(guò)怎樣的機(jī)制參與了HCC的發(fā)生發(fā)展目前尚需進(jìn)一步研究來(lái)證明，PIGK下調(diào)是HCC的原因還是結(jié)果目前不得而知。

2 GAA1與HCC

GPAA1是在GPI-T復(fù)合物中最早發(fā)現(xiàn)的亞基，大小為67 kD，研究表明GPAA1是單一的鋅離子金屬肽酶[8]，它由一個(gè)氨基端跨膜結(jié)構(gòu)域、一個(gè)可溶的結(jié)構(gòu)域、五個(gè)羧基端跨膜結(jié)構(gòu)域組成，GPAA1與PIGK、PIGT、PIGS、PIGU相關(guān)，并對(duì)轉(zhuǎn)酰胺酶活性至關(guān)重要，它通過(guò)最后一個(gè)跨膜螺旋的保守609蛋白識(shí)別并穩(wěn)定多肽底物的羧基端信號(hào)序列。此外亦有假說(shuō)支持GPAA1與GPI-T蛋白底物相互作用，因此GAA1可能包含部分活性位點(diǎn)并參與肽結(jié)合和識(shí)別[9]。GAA1早在90年代就被發(fā)現(xiàn)為可能致癌，與PIGK不同，GPAA1基因在HCC患者中是被擴(kuò)增的，90%的HCC患者GPAA1蛋白上調(diào)，此外GPAA1表達(dá)升高與HCC細(xì)胞分化和預(yù)后呈正相關(guān)[10]。FOXC2的表達(dá)受GPAA1表達(dá)水平的調(diào)控[11]，HCC患者中的GPAA1水平的上調(diào)可導(dǎo)致FOXC2的水平上調(diào)，而目前已有較多證據(jù)表明FOXC2參與了肝癌的生長(zhǎng)和侵襲，并可作為肝癌預(yù)后預(yù)測(cè)因子[12]。此外，GPAA1過(guò)表達(dá)可使表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)被募集到GPI-T復(fù)合物中[13]，而EGFR可促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，并協(xié)助HCC細(xì)胞對(duì)化療藥物形成耐藥[14-15]，因此GAA1參與了肝癌的發(fā)展。

3 PIGS與HCC

PIGS是GPI轉(zhuǎn)酰胺酶復(fù)合物的一個(gè)亞基，大小為61 kD的蛋白，有兩個(gè)跨膜區(qū)域，跨膜區(qū)域之間有一個(gè)大的可溶性結(jié)構(gòu)域，催化預(yù)形成的GPI附著到含有羧基端GPI附著信號(hào)的蛋白質(zhì)上，敲除PIGS基因可消除PIGK和原蛋白底物之間硫酯中間體的形成，它是PIGK和蛋白質(zhì)底物之間形成硫酯中間體所必需的[5]。五個(gè)亞基中，目前對(duì)于PIGS與HCC的研究較少，現(xiàn)有證據(jù)表明它在甲狀腺癌、乳腺癌中顯著過(guò)表達(dá)，且與健康組織相比，在肝臟中擴(kuò)增了40%，Jatin等[6]的研究從mRNA水平指出PIGS在HCC中的表達(dá)是上調(diào)的，因此它參與HCC的機(jī)制有待研究。

4 PIGT與HCC

PIGT是一個(gè)69 kD的蛋白，具有較大的氨基端親水性區(qū)域和羧基端跨膜結(jié)構(gòu)域，在轉(zhuǎn)酰胺化過(guò)程中，PIGT對(duì)于GPAA1和蛋白質(zhì)底物之間羰基中間體的形成是必不可少的，PIGT穩(wěn)定了PIGK和GPAA1，當(dāng)PIGT被敲除時(shí)，其他GPI-T亞基的表達(dá)水平降低，PIGT通過(guò)兩個(gè)保守的半胱氨酸殘基與PIGK形成功能相關(guān)的二硫鍵，使其成為唯一與催化亞基共價(jià)連接的亞基，對(duì)GPI-T的活性是很重要[5]。目前已有大量研究表明PIGT參與了人類多項(xiàng)腫瘤的發(fā)生，前文提到GPAA1在HCC患者中是過(guò)表達(dá)的，而過(guò)表達(dá)的GAA1可將EGFR募集到GPI-T復(fù)合物中，導(dǎo)致EGFR、PIGT和PIGU通過(guò)EGFR酪氨酸激酶磷酸化，PIGT的磷酸化可誘導(dǎo)paxillin磷酸化[13]，而paxillin通路的激活導(dǎo)致HCC細(xì)胞基質(zhì)粘附并促進(jìn)肝癌的轉(zhuǎn)移。此外，PIGT的表達(dá)水平會(huì)使FOXC2轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平降低80%，而體外實(shí)驗(yàn)表明過(guò)表達(dá)PIGT可使FOXC2在mRNA和蛋白水平上增加[12]，而FOXC2參與了肝癌的生長(zhǎng)和侵襲。

5 PIGU與HCC

PIGU是第五個(gè)被鑒定為GPI-T組成成分的亞基，它是一個(gè)高度疏水的38 kD蛋白，有8到10個(gè)跨膜區(qū)域，它的缺失會(huì)抑制細(xì)胞表面GPI錨定蛋白的形成。盡管PIGU在GPI-T復(fù)合物中的作用未知，但它與脂肪酸延長(zhǎng)酶的弱序列相似性表明它可能參與了GPI錨定脂質(zhì)部分的識(shí)別，它對(duì)GPI-T的穩(wěn)定性至關(guān)重要，PIGU與PIGT、GAA1形成與PIGS相關(guān)的核心復(fù)合物，從而穩(wěn)定PIGK，觸發(fā)GPI錨定反應(yīng)，同時(shí)PIGU是在人類癌癥中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)GPI-T亞基[16]。研究表明PIGU的缺陷導(dǎo)致了智力殘疾、癲癇、大腦異常[17]。

通過(guò)對(duì)腫瘤組織的癌癥基因譜的RNA序列分析，發(fā)現(xiàn)PIGU在HCC中高表達(dá)[18]，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明PIGU蛋白在HCC組織中的表達(dá)比癌旁及正常肝組織明顯增加，并證明肝癌組織中PIGU不論在RNA還是蛋白水平上都是GPI-T亞基中表達(dá)最顯著的，PIGU表達(dá)水平越高，HCC患者的生存時(shí)間越短，同時(shí)結(jié)合PIGU表達(dá)水平和標(biāo)準(zhǔn)TNM分期系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分方法表明其在預(yù)測(cè)HCC患者5年生存率方面均優(yōu)于TNM分期[19]，它可作為獨(dú)立的預(yù)后預(yù)測(cè)因子。

對(duì)PIGU在HCC中的作用機(jī)制進(jìn)行了深一步的研究，PIGU過(guò)表達(dá)可通過(guò)激活NF-κB通路活化STAT3，而STAT3在肝癌中是高表達(dá)的[20-21]，活化的STAT3與NF-κB形成復(fù)合物結(jié)合到端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子區(qū)域促進(jìn)癌細(xì)胞永生，活化的STAT3還可促進(jìn)細(xì)胞因子(IL-6、IL-10)和生長(zhǎng)因子(VEGF)的合成，這些細(xì)胞因子抑制樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)的成熟并抑制它們刺激CD8+T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(NK)的抗腫瘤作用[20，22-23]，從而促進(jìn)HCC進(jìn)展。PIGU下調(diào)可降低NF-κB活性來(lái)下調(diào)侵襲相關(guān)分子MMP-2和MMP-9的表達(dá)[24]，抑制MMP-2和MMP-9可降低肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[25-27]，還可通過(guò)下調(diào)MMP-9抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[28]。此外PIGU下調(diào)還可降低c-Myc蛋白水平，高水平的c-Myc蛋白可激活Yes相關(guān)蛋白-1(Yes-associated protein-1，YAP-1)從而激活未折疊蛋白應(yīng)答反應(yīng)(Unfold protein reaction，UPR)[29]，細(xì)胞通過(guò)UPR下游信號(hào)激活從而對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，另外高水平的c-Myc蛋白可促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展，縮短肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[30-31]，因此，PIGU通過(guò)下調(diào)c-Myc蛋白抑制腫瘤的生長(zhǎng)。PIGU下調(diào)還可直接增加肝癌細(xì)胞對(duì)NK-92細(xì)胞溶解的敏感性。

6 小結(jié)與展望

GPI-T作為GPI錨定蛋白合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，它的改變可導(dǎo)致GPI蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的重大改變，因此GPI-T是維持細(xì)胞正常功能必不可少的酶，長(zhǎng)期炎癥刺激激活一系列信號(hào)通路導(dǎo)致該酶或其不同亞基的表達(dá)水平的變化可能對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生重大的生理影響，從而以新的方式解除對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控，因此是潛在的診斷及治療的良好靶點(diǎn)。然而，目前對(duì)GPI-T亞基的研究?jī)H大部分為肝癌組織與正常組織的表達(dá)差異上，其作用的分子機(jī)制及信號(hào)通路目前尚未完全明了，進(jìn)一步的研究需明確各個(gè)亞基參與肝癌的具體機(jī)制，同時(shí)明確它是否影響GPI錨定蛋白的合成從而在血清中提供特異性的檢測(cè)物，為GPI-T作為臨床診斷提供依據(jù)，因此基于GPI-T作為臨床免疫治療還需要大量的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)來(lái)支持。