單細胞測序技術在頭頸部惡性腫瘤中的研究與發(fā)展

范琳 田霖麗 綜述 劉鳴 審校

自2009年單細胞測序技術問世以來，研究人員通過對單個細胞的遺傳信息進行測序，檢測出個體細胞間的差異和他們在微環(huán)境中的相互作用機制及某一特定細胞的發(fā)生發(fā)展過程。目前，頭頸部惡性腫瘤已經成為癌癥相關疾病死亡的第六大病因，但基于免疫組化、解剖部位和腫瘤分期的腫瘤分類方法并沒有將腫瘤異質性的因素考慮在內，基于這種分類方式制定的臨床診療方案仍有待進一步探索。隨著單細胞測序技術的開展，推動研究人員對頭頸部惡性腫瘤的發(fā)生機制和個體化治療方案的制定進行更全面、精確的研究。本文就單細胞測序在頭頸部惡性腫瘤中的研究進展予以綜述，旨在探尋該技術在頭頸部惡性腫瘤的基礎研究及診治方面可能帶來的重要變革。

1 單細胞測序概述

單細胞測序技術是通過對分離的單個細胞進行基因組的擴增，從而進一步進行測序、分析和應用。單細胞測序技術包括單細胞單組學分析和單細胞多組學分析，其中單細胞單組學分析包括基因組測序、轉錄組測序、表觀遺傳組測序和蛋白質組測序[1]。單細胞基因組測序可以應用于檢測基因組的穩(wěn)定性和基因組的變異[2]，從而為人類理解細胞的生理和病理功能提供新見解。轉錄組測序技術為描述腫瘤細胞的克隆多樣性和探究罕見細胞在腫瘤發(fā)展中的作用提供了強有力的新途徑[3]。表觀遺傳是指基因組和轉錄組以外可遺傳的信息，如DNA甲基化、RNA甲基化、組蛋白修飾、染色質的重塑和三維空間構象等。單細胞表觀遺傳學測序技術的產生讓研究人員對表觀遺傳學的關鍵問題得以進一步研究，如細胞的轉錄異質性是否與表觀遺傳異質性有關。蛋白質組學技術的出現對了解單細胞中的蛋白質結構、定位和蛋白質-蛋白質相互作用十分重要。單細胞多組學測序技術的發(fā)明有助于探究基因組、轉錄組、表觀遺傳組的相互作用關系[4]。總之，單細胞測序技術使研究者能夠低成本、快速構建器官或者組織的大規(guī)模單細胞表達圖譜，了解組織或器官內細胞復雜的基因網絡，以及單細胞中的調控機制，進一步探究各細胞群體的協同方式。

2 單細胞測序在頭頸部惡性腫瘤中的研究進展

2.1 揭示頭頸部惡性腫瘤的異質性

頭頸部惡性腫瘤是全世界腫瘤死亡的重要原因。近年來，研究人員對頭頸部惡性腫瘤內細胞異質性的認識有了很大的提高，但對這種異質性如何影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的理解仍處于起步階段[5]，認識這一過程對設計有效的頭頸部惡性腫瘤治療策略有著重大意義。Song等[6]第一次利用單細胞測序技術繪制出喉鱗狀細胞癌的腫瘤內異質性的圖譜進一步理解了喉癌的發(fā)生發(fā)展過程。頭頸部惡性腫瘤細胞相關的的缺氧、應激、上皮分化和EMT表達程序在同一頭頸部惡性腫瘤內部和不同頭頸部惡性腫瘤間都存在異質性。Locasale等[7]三位研究人員在單細胞水平繪制頭頸部惡性腫瘤微環(huán)境中的細胞代謝基因表達譜，揭示了頭頸部惡性腫瘤的代謝異質性。Mroz等[8]認為等位基因腫瘤異質性評分可以作為頭頸部腫瘤異質性的評價標準。相關研究表明在頭頸部鱗狀細胞癌患者中，腫瘤內的異質性與預后相關[9]。隨著研究人員對頭頸部惡性腫瘤異質性認識的加深，免疫檢查點抑制劑的相關治療方案的制定也不斷的被質疑。Rasmussen等[10]用腫瘤比例評分和聯合陽性評分研究PD-L1表達在頭頸部惡性腫瘤中的腫瘤內異質性，結果發(fā)現用TPS評估PD-L1陽性率和CPS評估的PD-L1陽性率顯著不同[10]，這證明PD-L1作為免疫檢查點抑制劑治療效果的預測標記物不可靠。綜上所述，隨著對腫瘤異質性研究的愈加深入，加深理解了頭頸部惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制，推進了頭頸部惡性腫瘤的個體化治療方案的制定。

2.2 描述頭頸部惡性腫瘤的微環(huán)境

口腔鱗狀細胞癌的單細胞測序分析發(fā)現，非腫瘤細胞按照細胞類型分為8大類：T細胞、B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、肥大細胞、內皮細胞、成纖維細胞和肌細胞，在頭頸部惡性腫瘤中非腫瘤細胞盡管比例不同，但他們的表達狀態(tài)和細胞類型一致。這些發(fā)現表明，針對間質細胞或免疫細胞的治療(例如免疫檢查點抑制)可能適用于所有腫瘤，而針對惡性腫瘤細胞的靶向治療需要針對性策略。主要T細胞可分為四個亞群：調節(jié)性T細胞、常規(guī)CD4+T輔助細胞和兩個細胞毒性CD8+T細胞群[11]。同其他亞群相比，細胞毒性亞群在共抑制受體(如PD1、CTLA4)表達上存在差異，CD8+T細胞群在不同的患者中也存在著顯著差異。這些T細胞表達狀態(tài)可能為預測對檢查點免疫療法的反應提供信息。

除了免疫細胞，間質細胞如腫瘤相關成纖維細胞(CAFs)在腫瘤微環(huán)境中有著復雜的作用。腫瘤相關成纖維細胞與腫瘤發(fā)生、腫瘤存活、細胞外基質重塑、免疫系統抑制和腫瘤侵襲有關[12]。研究人員用單細胞測序的方法區(qū)分出結直腸癌患者中的兩個腫瘤相關成纖維細胞群體，稱為CAF-A和CAF-B[13]。這個發(fā)現同頭頸部惡性腫瘤中發(fā)現的腫瘤相關成纖維細胞群體相似，CAF-A細胞表達細胞外基質相關基因，CAF-B細胞表達肌成纖維細胞的標記物(例如ACTA2、PDGFA)。未來的單細胞研究將繼續(xù)對腫瘤相關成纖維細胞群體進行亞型劃分，確定其不同的表達狀態(tài)，進一步研究頭頸部惡性腫瘤中成纖維細胞的異質性對治療抵抗的影響。

單細胞測序技術還可以在研究某類細胞命運決定中得以運用。如Fillbin等[14]發(fā)現了在H3K2M突變型膠質瘤中惡性特征最明顯的少突膠質前體樣細胞亞群中的關鍵分子PDGFRA和BIM1(命運決定點)。這種發(fā)現對認識腫瘤的發(fā)生發(fā)展十分重要。目前尚無單細胞測序在頭頸惡性腫瘤細胞命運決定方面的研究，或許還可以根據這種突變基因研究出相關的靶向藥物，將腫瘤局限于早期，這些都是研究人員在未來期望看到的成果。

2.3 評估頭頸部惡性腫瘤的侵襲和轉移

腫瘤的侵襲和轉移是頭頸部惡性腫瘤患者死亡的重要原因。在之前的研究中，研究人員認為上皮性腫瘤的上皮-間質轉化是其淋巴結轉移的驅動因子[15]。在對頭頸部惡性腫瘤及其淋巴結進行單細胞測序時發(fā)現來自周圍腫瘤相關成纖維細胞表達的TGF-β誘導腫瘤細胞的p-EMT狀態(tài)，促進對周圍組織的侵襲[16]。通過基于TCGA數據評估頭頸部惡性腫瘤細胞的部分上皮-間質轉化，發(fā)現部分上皮-間質轉化與淋巴結轉移、淋巴血管侵襲和囊外浸潤有關，這表明惡性細胞和間質細胞一同向淋巴結擴散并形成淋巴結轉移，而不是單個惡性細胞外滲和植入淋巴結床，這個發(fā)現提示可以利用免疫組織化學分析原發(fā)性腫瘤中的部分上皮-間質轉化標記物，提高對隱匿性淋巴結或遠處轉移的預測。Puram等[11]對18例頭頸部惡性腫瘤患者的單細胞轉錄組分析，進一步證實部分EMT可以作為淋巴結轉移獨立預測因子，這種預測可以減少N0分期的頭頸部鱗癌中不必要的頸淋巴結清掃。同樣，轉錄組測序分析發(fā)現神經侵襲(Perineural invasion，PNI)中的基因表達與上皮間質轉化的功能狀態(tài)相關[17-18]，盡管核磁共振成像和F-氟脫氧葡萄糖正電子發(fā)射斷層掃描能夠評估頭頸部惡性腫瘤的PNI，但早期PNI很少被檢測到，這意味著上皮-間質轉化相關程序可能作為早期PNI的預測因子。目前研究發(fā)現長非編碼RNA是一種重要的生物標志物，許多研究證實長非編碼RNA同頭頸部惡性腫瘤的上皮-間質轉化表達相關。Kolenda等[19]發(fā)現ZFAS1基因的表達影響頭頸部惡性腫瘤的部分上皮-間質轉化過程。相關研究還發(fā)現LINC00460通過PRDX1進入細胞核而促進頭頸部惡性腫瘤細胞的部分上皮-間質轉化過程[20]。這些長非編碼RNA都可能成為頭頸部惡性腫瘤預測預后的指標和治療頭頸部惡性腫瘤的潛在靶點。

2.4 探究循環(huán)腫瘤細胞的作用

循環(huán)腫瘤細胞已經成為臨床上有效的檢測腫瘤進展和預后的新工具。與原發(fā)性腫瘤相比，轉移性和復發(fā)性癌細胞有新的體細胞變異，這增強了治療過程中癌細胞的逃逸性。在臨床中，通常很難對轉移性或復發(fā)性腫瘤進行活檢，而對循環(huán)腫瘤細胞進行單細胞測序可以在沒有活檢測序的情況下觀察到腫瘤譜中體細胞的變化。循環(huán)腫瘤細胞可以檢測腫瘤的異質性和推測腫瘤的進化形態(tài)[21]。對循環(huán)腫瘤細胞進行單細胞測序可以幫助研究人員更全面的了解腫瘤內異質性。而通過檢測到的循環(huán)腫瘤細胞核苷酸突變而繪制出的腫瘤演化的早期突變圖譜具有巨大的臨床應用價值。目前循環(huán)腫瘤細胞在腫瘤中的研究結果仍富有爭議，因為在大量研究中存在循環(huán)腫瘤細胞的檢測技術的原理、方法不同和研究方法缺乏統一標準的問題，導致判斷標準及檢測結果存在較大差異，缺乏可比性[22]。在頭頸部惡性腫瘤中對于循環(huán)腫瘤細胞的研究剛剛處于起步階段，單細胞測序在這方面將有巨大的應用潛力。期望在未來看到更多相關研究成果的出現。

2.5 評價治療效果和評估治療抵抗

盡管采用積極的多模式治療，仍有30%的頭頸部惡性腫瘤患者會出現復發(fā)，60%的頭頸部惡性腫瘤患者會出現局部轉移[23]。對于難治性腫瘤，問題在于腫瘤細胞是否獲得了能夠生存的突變，或者是否始終存在一個通過選擇性治療壓力存活下來的細胞亞群。Kim等[24]應用單細胞測序分析接受新輔助治療的三陰性乳腺癌患者，發(fā)現在治療耐藥的患者中存在治療耐藥基因型，而且這種基因型是在新輔助治療選擇下發(fā)生的。在整個治療過程中，基因組和轉錄組一直發(fā)生著變化，提示治療抵抗的適應性和獲得性機制同時發(fā)生，目前尚無頭頸部惡性腫瘤在這方面的研究。利用單細胞測序技術進行頭頸惡性腫瘤治療抵抗相關方面的研究，將對頭頸惡性腫瘤治療產生深遠影響。

3 小結與展望

單細胞測序對于頭頸部惡性腫瘤的研究意義重大。腫瘤異質性的發(fā)現使研究人員不再將腫瘤的發(fā)生發(fā)展看作一個整體，而是不同成分之間的共表達的結果。對于微環(huán)境的研究揭示了病理和生理狀態(tài)下不同的細胞亞群和某類細胞中的細胞亞群。上皮-間質轉化作用的發(fā)現提供了潛在的預測指標和治療靶點，為臨床醫(yī)生對頭頸部惡性腫瘤患者做出早期有效的治療提供支持。單細胞測序在評價頭頸部惡性腫瘤治療效果和治療抵抗方面的應用可能對頭頸部惡性腫瘤的治療帶來革命式的改變。單細胞測序更是促進了循環(huán)腫瘤細胞研究發(fā)展，使研究人員能在提取的細胞數目有限的情況下全面的進行遺傳信息分析。單細胞測序技術近期蓬勃發(fā)展，但其在頭頸部惡性腫瘤中的研究仍存在許多挑戰(zhàn)?；颉⒉±砗团R床表現三者之間的確定關系仍有待于進一步研究。另外許多單細胞測序的數據具有患者特異性，這些數據是否適用于所有個體，這都是未來需要探究的問題。