基于癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)分析芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)體樣2在肺腺癌中的表達(dá)及其預(yù)后意義

陳金花 趙秋榮 尤劍彬 陳發(fā)林

福建省立醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建福州 350001

肺癌是目前全球最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年全球新發(fā)肺癌患者數(shù)約為220 萬(wàn)，占所有腫瘤診斷數(shù)的11.4%左右，因肺癌致死的病例數(shù)約為180 萬(wàn)，占所有腫瘤死亡人數(shù)的18.0%左右[1]。肺腺癌是一種惡性上皮腫瘤，有腺樣分化和黏液分泌兩種類型，目前已成為最常見的肺癌病理類型[2-3]。

有研究[4]結(jié)果顯示，時(shí)鐘基因與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在亞細(xì)胞和分子水平上，中樞和外周生物鐘由晝夜節(jié)律基因的芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)體樣2（aryl hydrocarbon receptor nuclear transporter-like 2，ARNTL2） 基因、Cry1 基因、Cry2 基因等共同組成。ARNTL2 是一種螺旋-環(huán)-螺旋（helix-loop-helix，HLH）轉(zhuǎn)錄因子并且已經(jīng)被證明與多種轉(zhuǎn)錄因子具有協(xié)同作用，其中包括缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor 1 subunit α，HIF-1α） 和核心晝夜節(jié)律轉(zhuǎn)錄因子[5-6]。近年來(lái)研究表明，時(shí)鐘基因ARNTL2 與腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移有關(guān)[7]，在乳腺癌[8]、肝癌[9]和結(jié)腸癌[10]細(xì)胞中呈高表達(dá)，且與患者預(yù)后有關(guān)。但是，ARNTL2 在肺腺癌中是否發(fā)揮作用和腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。因此，本研究通過(guò)癌癥基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)下載肺腺癌組織及癌旁組織RNA seq 數(shù)據(jù)及對(duì)應(yīng)的肺腺癌患者臨床數(shù)據(jù)，旨在探究ARNTL2 在肺腺癌中的表達(dá)及其與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，為進(jìn)一步研究ARNTL2 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1 TCGA 數(shù)據(jù)下載

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//cancergenome.nih.gov/）下載2021年3月前肺腺癌相關(guān)的RNA seq 數(shù)據(jù)及對(duì)應(yīng)的肺腺癌患者臨床資料，共納入337 例肺腺癌組織（肺腺癌組）與59 例癌旁組織（癌旁對(duì)照組）。

1.2 研究方法與觀察指標(biāo)

采用R 軟件3.6.2 版本將基因表達(dá)數(shù)據(jù)歸一化處理后進(jìn)行l(wèi)og2 轉(zhuǎn)化，提取肺腺癌組與癌旁對(duì)照組的ARNTL2 表達(dá)量用于后續(xù)分析。通過(guò)R 軟件的“survival”軟件包進(jìn)行生存分析，使用“survminer”軟件包繪制生存曲線。

①比較肺腺癌組與癌旁對(duì)照組的ARNTL2 表達(dá)量。②根據(jù)ARNTL2 表達(dá)量中位值將肺腺癌患者分為高表達(dá)組（＞8.59，91 例）和低表達(dá)組（≤8.59，246 例），單因素分析ARNTL2 表達(dá)量與肺腺癌患者臨床特征（年齡、性別、Stage 分期以及TNM 分期）的相關(guān)性。③分析肺腺癌患者的生存預(yù)后關(guān)系。④單因素分析ARNTL2 表達(dá)量及臨床特征（年齡、性別、Stage 分期以及TNM 分期）與肺腺癌患者預(yù)后（中位生存時(shí)間）的相關(guān)性。⑤通過(guò)Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析，判斷影響肺腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)分析ARNTL2 在分析肺腺癌組織與癌旁組織樣本中的表達(dá)；生存分析采用Kaplan-Meier 生存曲線評(píng)估；通過(guò)Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌組與癌旁對(duì)照組ARNTL2 表達(dá)量的比較

ARNTL2 在肺腺癌組中的表達(dá)高于癌旁對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1 肺腺癌組與癌旁對(duì)照組ARNTL2 表達(dá)量的比較

2.2 ARNTL2 表達(dá)量與肺腺癌患者臨床特征的單因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，肺腺癌患者的年齡、Stage分期和N 分期是影響ARNTL2 表達(dá)的相關(guān)因素（P＜0.05）（表1）。

表1 ARNTL2 表達(dá)量與肺腺癌患者臨床特征的單因素分析[n（%）]

2.3 肺腺癌患者的生存預(yù)后分析

肺腺癌患者的生存預(yù)后分析結(jié)果顯示，ARNTL2表達(dá)與肺腺癌患者總生存期存在相關(guān)性（P=0.001）（圖2）。

圖2 肺腺癌患者的生存預(yù)后分析

2.4 ARNTL2 表達(dá)量及臨床特征與肺腺癌患者預(yù)后的單因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，Stage 分期和ARNTL2 表達(dá)是影響肺腺癌患者總生存期的相關(guān)因素（P＜0.05）（表2）。

表2 ARNTL2 表達(dá)量及臨床特征與肺腺癌患者預(yù)后的單因素分析

2.5 ARNTL2 表達(dá)量及臨床特征與肺腺癌患者預(yù)后的多因素分析

Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型結(jié)果顯示，Stage 分期和ARNTL2表達(dá)是肺腺癌患者總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）（表3）。

表3 ARNTL2 表達(dá)量及臨床特征與肺腺癌患者預(yù)后的多因素分析

3 討論

截至目前，TCGA 中總共收集33 種腫瘤約20 000個(gè)患者樣本數(shù)據(jù)，包括了基因組，轉(zhuǎn)錄組，表觀遺傳等各個(gè)組學(xué)數(shù)據(jù)[11-12]。基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的各類癌癥相關(guān)高質(zhì)量研究論文已有近3000 篇[13]。TCGA 是使用大規(guī)模測(cè)序?yàn)橹鞯幕蚪M分析技術(shù)，通過(guò)與其他單位廣泛的合作，分析癌癥的形成機(jī)制，從而提高人們對(duì)癌癥發(fā)病分子機(jī)制的科學(xué)認(rèn)識(shí)，以及提高臨床醫(yī)生診斷、治療和預(yù)防癌癥的能力[14-15]。

肺癌是全球范圍內(nèi)癌癥死亡的主要原因，嚴(yán)重危害人類健康。其中肺腺癌是目前最常見的肺癌組織學(xué)類型，所以尋找早期診斷和預(yù)后指標(biāo)對(duì)肺癌的治療具有重要的意義。有研究[4]表明，時(shí)鐘基因與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，可以直接或間接參與改變細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡和腫瘤免疫等過(guò)程。ARNTL2 在多種腫瘤中呈高表達(dá)，與結(jié)腸癌的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特征密切相關(guān)[7]。Polo 等[9]發(fā)現(xiàn)ARNTL2 表達(dá)增加與肝癌的高風(fēng)險(xiǎn)臨床病理因素之間的關(guān)聯(lián)。Wendeu-Foyet等[10]發(fā)現(xiàn)ARNTL2 表達(dá)增加和乳腺癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Wang 等[16]在ARNTL2 在胰腺導(dǎo)管腺癌PDAC 組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，與患者預(yù)后不良呈正相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)[6-7，16]表明ARNTL2 促進(jìn)PDAC 細(xì)胞增殖和侵襲能力。最新生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)ARNTL2 在結(jié)直腸癌組織高表達(dá)，與預(yù)后相關(guān)[17]。體外研究[18-20]發(fā)現(xiàn)ARNTL2通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路，進(jìn)一步調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的活性，從而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移。目前，關(guān)于ARNTL2 在肺腺癌中的表達(dá)模式及其作用還未明確[21]。本研究結(jié)果顯示，ARNTL2 在肺腺癌組中的表達(dá)高于癌旁對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；單因素分析結(jié)果顯示，肺腺癌患者的年齡、Stage 分期和N 分期是影響ARNTL2 表達(dá)的相關(guān)因素（P＜0.05）；生存預(yù)后分析結(jié)果顯示，ARNTL2 表達(dá)與肺腺癌患者總生存期存在相關(guān)性（P＜0.05）；單因素分析結(jié)果顯示，Stage 分期和ARNTL2 表達(dá)是影響肺腺癌患者總生存期的相關(guān)因素（P＜0.05）；Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型結(jié)果顯示，Stage 分期和ARNTL2 表達(dá)是肺腺癌患者總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。上述結(jié)果提示ARNTL2 可能是肺腺癌的潛在生物標(biāo)志物，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，通過(guò)分析TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中肺腺癌的數(shù)據(jù)，可知ARNTL2 在肺腺癌中高表達(dá)且與臨床特征具有相關(guān)性，可以推測(cè)ARNTL2 在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，進(jìn)一步影響肺腺癌患者的預(yù)后。因此，ARNTL2 可作為肺腺癌潛在預(yù)后標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)，接下來(lái)可以進(jìn)一步收集臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證，為研究肺腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供參考。