帕瑞昔布鈉對老年大鼠術后中樞炎癥反應、凋亡及認知功能的影響

劉 娜 徐悅利 武雅琦 彭俊旭 張 欣 林嘉欣 任從才▲

1.中山大學附屬第八醫(yī)院（深圳福田）麻醉科，廣東深圳 518000；2.深圳市婦幼保健院麻醉科，廣東深圳 518000

術后認知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）指患者在手術后數(shù)天或數(shù)月學習記憶或認知功能下降，好發(fā)于老年患者。但其發(fā)病機制仍不清楚[1-2]。環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX）是催化花生四烯酸合成前列腺素（prostaglandin，PG）的關鍵酶，炎癥介質環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）備受學者關注。研究顯示，中樞神經系統(tǒng)退行性疾病發(fā)病機制與腦內小膠質細胞激活、COX-2 上調和損傷性PG 的合成增加，凋亡反應啟動有關[3-4]。因此，本研究運用選擇性COX-2 抑制劑帕瑞昔布鈉（Parecoxib Sodium）干預老年大鼠POCD 模型，觀察機體創(chuàng)傷后小膠質細胞激活狀態(tài)、中樞炎癥反應及細胞凋亡與POCD 的關系，探討可能的病理基礎，旨在為臨床治療POCD 奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究獲中山大學附屬第八醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準后實施。選擇40 只雄性老年SD 大鼠，體重（500±50）g，15～16 周齡，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證編號：SCXK（京）2011-0009]。實驗動物飼養(yǎng)于清潔級動物房，光照時間為8:00～18:00，室溫為22～24℃，濕度為50%。

1.2 實驗用藥

帕瑞昔布鈉（江蘇輝瑞有限公司，批號CR3115）；戊巴比妥（Sigma 公司，USA，產品CAS57-33-0）

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

大鼠隨機分為四組（n=10）：等時間點給予大鼠腹腔注射等體積0.9%NaCl 作為對照組；等時間點給予大鼠腹腔注射等劑量帕瑞昔布鈉作為帕瑞昔布鈉組；大鼠行左腎切除術作為模型組；大鼠行左腎切除術并于術前連續(xù)3 d 給予腹腔注射帕瑞昔布鈉10 mg/（kg·d），左腎切除術后連續(xù)3 d 給予腹腔注射帕瑞昔布鈉2 mg/（kg·d）作為治療組。

1.3.2 動物模型制作

手術步驟參照文獻[5]的方法。腹腔注射0.3%戊巴比妥麻醉，手術步驟：無菌條件下左肋緣下，上腹部行切口約3 cm，游離左側腎臟，絲線結扎兩次腎動、靜脈后切除左側腎臟。

1.3.3 Morris 水迷宮實驗

術前大鼠連續(xù)5 d 進行定位航行訓練，即每天將大鼠從4 個不同入水點隨機放入池中4 次，系統(tǒng)記錄大鼠尋找到隱藏水下平臺所用時間，即逃避潛伏期（escape latency）。具體包括以下兩個方面。

1.3.3.1 空間探索實驗 將原有訓練平臺撤掉，讓大鼠在原平臺所在象限對側入水，測試60 s 內大鼠在目標象限停留時間、穿過原目標平臺位置的次數(shù)（即穿臺次數(shù)）。

1.3.3.2 工作記憶檢測 隨機將訓練平臺放于空間探索實驗所在平臺以外的任一個象限，大鼠入水后如60 s內爬上該平臺并停留15 s，如沒有找到該平臺，可將其引導到平臺停留15 s，間隔30 s 后從同一入水點入水，圖像采集系統(tǒng)記錄大鼠找到隱藏在水面下的平臺潛伏期。

1.4 免疫熒光實驗

術后第3 天完成水迷宮檢測后，取一側海馬和前額皮層組織，另一側海馬組織，保存于-80℃冰箱。石蠟切片制作，抗原修復液修復后滴加小膠質細胞激活狀態(tài)離子鈣接頭蛋白分子1（Iba1）（1∶100，美國Abcam 公司） 切片孵育，4℃冰箱過夜，PBS 漂洗3 次，每次5 min，二抗anti-rat FITC（1:200）室溫孵育2 h，PBS漂洗5 min，共3 次，切片經顯色，復染，脫水，二甲苯透明，封片后采用共聚焦熒光顯像系統(tǒng)（日本Olympus）觀察并采集，每只大鼠切片隨機取3 張（取5 個視野的平均值），Image pro-plus 6.0 圖像軟件分析，200倍鏡檢計數(shù)小膠質細胞陽性細胞數(shù)量。

1.5 細胞凋亡蛋白及活化型caspase3、COX-2 蛋白表達及前列腺素E2 含量測定

蛋白濃度測定采用二喹琳甲酸法。蛋白樣本（50 μg） 在10% SDS-PAGE 膠上經電泳分離后轉印至硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉（5%）室溫封閉2 h，分別用兔抗鼠COX-2、細胞凋亡蛋白caspase3、活化型caspase3（cleaved-caspase3）（1∶1000 倍稀釋，美國Sigma 公司）一抗孵育，4℃搖床過夜，TBST 漂洗3 次，辣根過氧化酶標記的二抗孵育（1∶3000），室溫搖床孵育1 h，洗膜3 次，ECL 顯影劑顯影并用Gel-pro analyzer 4.0 版軟件分析灰度光密度值。前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）含量的測定，嚴格按照試劑盒說明書進行操作步驟。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 5.0 軟件系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用重復測量方差分析，組間比較采用2×2 ANOVA 雙因素方差分析聯(lián)合Dunnett post hoc test 檢驗；計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義，以P＜0.01 為差異有高度統(tǒng)計學意義，以P＜0.001 為有極其顯著的統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 術后第3 天各組大鼠Morris 水迷宮實驗結果的比較

定位航行訓練結果顯示，空間探索實驗中，各組間大鼠的游泳速度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1，圖1）；術后第3 天，治療組大鼠在目標象限停留時間長于模型組，模型組大鼠在目標象限停留時間短于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1，圖2）；術后第3 天，治療組大鼠在目標象限穿臺次數(shù)多于模型組，模型組大鼠在目標象限穿臺次數(shù)少于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1，圖3）；術后第3天，工作記憶測試實驗中，治療組大鼠在登臺的潛伏期短于模型組，模型組大鼠在登臺的潛伏期長于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1，圖4）。

表1 術后第3 天各組大鼠Morris 水迷宮實驗結果的比較（±s）

表1 術后第3 天各組大鼠Morris 水迷宮實驗結果的比較（±s）

與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

對照組帕瑞昔布鈉組模型組治療組10 10 10 10 183.56±20.81 178.79±22.71 170.90±22.47 178.79±22.71 19.11±1.83 18.78±1.88 17.49±1.51a 19.06±1.45b 2.45±0.92 2.50±0.87 1.70±0.73a 2.45±0.82b 20.21±2.44 20.67±2.48 22.65±2.77a 20.51±2.50b組別 數(shù)目 游泳速度（mm/s）目標象限停留時間（s）穿臺次數(shù)（次）登臺的潛伏期（s）

圖2 各組大鼠在Morris 水迷宮實驗中目標象限停留時間的比較

圖3 各組大鼠在Morris 水迷宮實驗中穿臺次數(shù)的比較

圖4 各組大鼠在Morris 水迷宮實驗中登臺潛伏期的比較

2.2 術后第3 天各組大鼠免疫熒光染色Iba1 蛋白標記腦內陽性小膠質細胞計數(shù)的比較

術后第3 天，模型組大鼠的海馬CA1 區(qū)和前額皮層區(qū)腦內小膠質細胞Iab1 蛋白標記陽性細胞數(shù)高于對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（表2，圖5～7），與對照組比較，模型組的小膠質細胞狀態(tài)顯著激活。

圖5 術后第3 天各組大鼠海馬CA1 區(qū)小膠質細胞Iba1 蛋白免疫熒光標記圖（見內文第30 頁）

術后第3 天，治療組大鼠的海馬CA1 區(qū)和前額皮層區(qū)腦內小膠質細胞Iab1 蛋白標記陽性細胞數(shù)低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）[表2，圖5（封三），圖6（封四），圖7～8]，與模型組比較，治療組給藥顯著減弱手術誘發(fā)的老年大鼠術后小膠質細胞激活狀態(tài)。

表2 術后第3 天各組大鼠免疫熒光染色Iba1 蛋白標記腦內陽性小膠質細胞計數(shù)的比較（個，±s）

表2 術后第3 天各組大鼠免疫熒光染色Iba1 蛋白標記腦內陽性小膠質細胞計數(shù)的比較（個，±s）

與對照組比較，aaP＜0.01，aaaP＜0.001；與模型組比較，bP＜0.05

對照組帕瑞昔布鈉組模型組治療組10 10 10 10 186.76±23.35 188.12±18.05 209.78±13.42aa 191.38±20.54b 125.51±17.61 129.85±17.22 164.09±19.91aaa 148.37±19.62b組別 數(shù)目 海馬CA1 區(qū)細胞 前額皮層區(qū)細胞

圖7 術后第3 天各組大鼠海馬CA1 區(qū)Iba1 蛋白標記陽性小膠質細胞計數(shù)免疫熒光染色的比較

圖8 術后第3 天各組大鼠前額皮層區(qū)Iba1 蛋白標記陽性小膠質細胞計數(shù)免疫熒光染色的比較

2.3 術后第3 天各組大鼠海馬CA1 區(qū)COX-2/β-actin、cleaved caspase-3/caspase-3 水平及PGE2 含量的比較

術后第3 天，模型組大鼠海馬CA1 區(qū)COX-2/βactin、cleaved caspase-3/caspase-3 水平及PGE2含量高于對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（表3，圖9～13）。

表3 術后第3 天各組大鼠海馬CA1 區(qū)COX-2/β-actin、cleaved caspase-3/caspase-3 水平及PGE2 含量的比較（±s）

與對照組比較，aaP＜0.01，aaaP＜0.001；與模型組比較，bP＜0.05

對照組帕瑞昔布鈉組模型組治療組10 10 10 10 0.98±0.19 0.91±0.17 1.29±0.15aa 1.06±0.13b 0.13±0.06 0.12±0.05 0.19±0.06aaa 0.14±0.03b 228.68±51.48 233.35±55.21 297.58±64.47aa 248.17±40.60b組別 數(shù)目 COX-2/β-actin cleaved-caspase3/caspase3 PGE2（pg/ml）

術后第3 天，治療組大鼠海馬CA1 區(qū)COX-2/βactin、cleaved caspase-3/caspase-3 水平及PGE2含量低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2，圖9～13），與模型組比較，治療組明顯改善手術創(chuàng)傷觸發(fā)的術后第3 天大鼠海馬CA1 區(qū)COX-2 蛋白水平高表達、其產物PGE2含量的增加及cleaved-caspase3/caspase3蛋白表達量比值的增高。

圖9 術后第3 天各組大鼠海馬CA1 區(qū)COX-2 蛋白及相應內參蛋白條帶

圖10 術后第3 天各組大鼠海馬CA1 區(qū)COX-2/β-actin 比值變化的比較

圖11 術后第3 天各組大鼠海馬CA1 區(qū)PGE2 含量變化的比較

圖12 術后第3 天各組大鼠海馬CA1 區(qū)cleaved-caspase3、caspase3 蛋白條帶及相應內參蛋白條帶

圖13 術后第3 天各組大鼠海馬CA1 區(qū)cleaved-caspase3/caspase3 比值變化的比較

3 討論

與海馬功能密切相關的Morris 水迷宮實驗是評價嚙齒類動物空間學習記憶能力的經典實驗[6]，其觀察指標是動物發(fā)現(xiàn)隱匿平臺的時間（即潛伏期）和空間探索實驗時的穿臺次數(shù)和目標象限停留時間。本研究結果顯示，術后第3 天，模型組大鼠在工作記憶測試實驗中登臺的潛伏期長于對照組，在目標象限停留時間短于對照組，在目標象限穿臺次數(shù)少于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示手術創(chuàng)傷誘導大鼠術后學習記憶能力減弱，認知功能下降。有研究證實，在術后3 天老年大鼠空間學習記憶能力下降，逐漸恢復[7]，An 等[8]也發(fā)現(xiàn)了同樣的實驗結果。本研究結果與以上研究[7-8]發(fā)現(xiàn)一致，且本研究實驗結果恰好說明了POCD 是可逆的。本研究結果還顯示，術后第3天，治療組大鼠在目標象限停留時間長于模型組，在目標象限穿臺次數(shù)多于模型組，在工作記憶測試實驗中登臺的潛伏期短于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示帕瑞昔布鈉可改善大鼠的學習記憶功能。本研究結果顯示，空間探索實驗中，各組間大鼠的游泳速度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明大鼠自身活動能力及注射藥物等非相關因素未影響上述行為學測試結果。

研究表明，POCD 的發(fā)生發(fā)展過程與中樞神經系統(tǒng)炎癥反應關系密切，手術應激創(chuàng)傷引起的機體炎癥反應是圍術期重要的病理生理學改變[9]。小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)內主要的巨噬細胞，呈靜息狀態(tài)，病理狀態(tài)下被激活的小膠質細胞釋放多種炎癥因子及氧自由基，啟動凋亡反應導致中樞神經系統(tǒng)損傷。臨床上，帕瑞昔布鈉是一種選擇性COX-2 抑制劑，發(fā)揮抗炎與解熱鎮(zhèn)痛雙重作用[10]。文獻報道，COX-2 選擇性抑制劑在中樞神經系統(tǒng)相關性疾病中發(fā)揮神經保護作用[11-13]。美洛昔康降低AD 小鼠模型的腦內氧化應激反應，改善記憶與認知功能的下降[11]。同樣，美洛昔康抑制小鼠脾切除術后腦內星型膠質細胞的激活，改善學習記憶功能的降低[12]。腦缺血模型大鼠中，帕瑞昔布鈉能降低大鼠腦內氧化應激反應程度及神經元細胞的凋亡，改善腦缺血后的腦損傷[13]。帕瑞昔布鈉還能降低老年人POCD 的發(fā)生率[14]。因此，本研究選取帕瑞昔布鈉為研究藥物，研究中帕瑞昔布鈉的使用劑量參考文獻[15]。

本研究結果顯示，術后第3 天模型組腦內小膠質細胞被激活，Iab1 蛋白標記小膠質細胞陽性細胞數(shù)高于對照組，同時COX-2/β-actin、cleaved caspase-3/caspase-3 水平及PGE2含量高于對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明手術創(chuàng)傷導致短暫的老年大鼠中樞神經系統(tǒng)小膠質細胞激活，引起炎癥因子釋放，降低動物認知功能。Wan 等[16]證實，大鼠術后中樞神經膠質細胞顯著激活，炎癥介質及凋亡因子水平明顯增加，導致大鼠認知功能障礙，與本實驗結果相似。本研究結果顯示，術后第3 天，治療組大鼠的海馬CA1 區(qū)和前額皮層區(qū)腦內小膠質細胞Iab1 蛋白標記陽性細胞數(shù)低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；術后第3 天，治療組大鼠海馬CA1 區(qū)COX-2/β-actin及PGE2含量低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示帕瑞昔布鈉抑制手術創(chuàng)傷誘發(fā)的小膠質細胞激活及COX-2、PGE2等炎癥因子的釋放。該實驗結果與前期評價認知功能的行為學檢測結果是一致的，即模型組大鼠學習記憶能力的降低伴隨著大鼠腦內小膠質細胞的激活，炎癥介質釋放與凋亡反應啟動，而治療組大鼠學習記憶能力的改善與小膠質細胞的免疫反應激活程度減輕、炎癥介質釋放減少與減弱凋亡反應有關。

認知損傷的過程與細胞凋亡密切相關[17]。本研究結果顯示，模型組大鼠cleaved caspase-3/caspase-3水平高于對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；治療組大鼠cleaved caspase-3/caspase-3 水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。分析推斷帕瑞昔布鈉的神經保護效應與抑制中樞炎癥反應和細胞凋亡均有關。

綜上所述，手術創(chuàng)傷引起老年大鼠短暫性認知功能下降，伴隨著小膠質細胞激活，炎癥因子水平升高，細胞凋亡反應啟動。然而，帕瑞昔布鈉通過減弱海馬神經組織炎癥反應、凋亡等進程而改善認知功能。盡管確切的機制仍需進一步探討，帕瑞昔布鈉可能為預防POCD 提供了新的方向。