佛山地區(qū)孕婦線(xiàn)粒體耳聾基因突變分析

宋春林 鄧璐莎 陳淑芬 周 成

廣東省佛山市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，廣東佛山 528000

聽(tīng)力損失是最常見(jiàn)的人類(lèi)健康問(wèn)題之一，全球約有3.6 億耳聾人口。每700～1000 名新生兒中就有1個(gè)受到影響，約50%的病例是由遺傳因素引起的，約70%的遺傳性聽(tīng)力障礙是非綜合征性聽(tīng)力損失[1]。間隙連接β2 蛋白（gap junction β2 protein，GJB2）、間隙連接β3 蛋白（gap junction β3 protein，GJB3）、溶質(zhì)載體家族26 成員4（solute carrier family 26 member 4，SLC26A4）和線(xiàn)粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）突變是非綜合征性聽(tīng)力損失最常見(jiàn)的遺傳原因[2]。遺傳性耳聾可根據(jù)遺傳方式分為常染色體顯性遺傳性耳聾和常染色體隱性遺傳性耳聾，此外還有伴性遺傳性耳聾以及母系遺傳性耳聾。其中，母系遺傳性耳聾由線(xiàn)粒體基因突變引起，是基因和環(huán)境等多方面的因素作用的結(jié)果，特別是在氨基糖甙類(lèi)藥物相關(guān)性耳聾中扮演著重要的角色，其比例占5%左右。然而，其性質(zhì)和頻率的可變性在不同人群中存在遺傳異質(zhì)性[3]。由于不同的遺傳背景，這些基因的突變譜在中國(guó)不同地區(qū)常見(jiàn)的致聾基因各不相同。本研究分析佛山地區(qū)人群耳聾基因突變譜，對(duì)線(xiàn)粒體常見(jiàn)突變位點(diǎn)進(jìn)行了擴(kuò)增并測(cè)序，為孕婦耳聾基因篩查的遺傳咨詢(xún)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月至2021年4月在佛山市婦幼保健院產(chǎn)科門(mén)診就診的孕婦作為研究對(duì)象，分析其常見(jiàn)耳聾易感基因突變比例并測(cè)序研究線(xiàn)粒體突變類(lèi)型。在接受耳聾知識(shí)宣教和遺傳咨詢(xún)后，最終納入研究20299 人，年齡19～43 歲。本研究通過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，參與研究的患者經(jīng)過(guò)充分地知情自愿選擇并簽署了知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：環(huán)境因素導(dǎo)致的耳聾、綜合征性耳聾、外傷導(dǎo)致的耳聾。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 使用ACD 抗凝管真空采血管采集孕婦外周血2 ml，混勻，采用自動(dòng)核酸提取儀（西安天隆科技有限公司，NP968-c）提取DNA，使用核酸定量?jī)x（賽默飛世爾科技公司，Nanodrop2000）檢測(cè)濃度和純度。

1.2.2 導(dǎo)流雜交 采用耳聾易感基因檢測(cè)試劑盒和導(dǎo)流雜交儀（廣東凱普生物科技有限公司，HB-2012A），按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)常見(jiàn)耳聾基因型突變，包括：GJB2 基因的176del16、235delC、299de lAT、155delTCTG、35delG五個(gè)位點(diǎn)；SLC26A4 基因的1229C＞T、2168A＞G、IVS7-2A＞G 位點(diǎn)；線(xiàn)粒體DNA中1555A＞G、1494C＞T、7445A＞G、12201T＞C 位點(diǎn)；以及GJB3 中的538C＞T 位點(diǎn)。

1.2.3 擴(kuò)增與純化 采用特異引物對(duì)線(xiàn)粒體基因的特定突變區(qū)域進(jìn)行特異性擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠DNA 純化試劑盒（天根生化科技有限公司，Cat NO.DP209-03）回收純化。引物（上海生工生物工程有限公司）序列為：mtD1555-F（5'-3'）：AGAACACT ACGAGCCACAGC；mtD1555-R（5'-3'）：CATCTTTCCCTTGCGGTACTA；mtD7445-F（5'-3'）：CTAACTTTC TTCCCACAACAC；mtD7445-R（5'-3'）：CTATTTCCTGAGCGTCTGAG；mtD12201-F （5'-3'）：CTAGTCACA GCCCTATACTCC；mtD12201-R（5'-3'）：CTGATAATA AAGGTGGATGCGA。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃變性9 min，（95℃30 s、57℃30 s、72℃60 s）×40 循環(huán)，72℃延伸5 min，16℃保存。

1.2.4 Sanger 測(cè)序 采用BigDye Terminator 試劑盒進(jìn)行測(cè)序PCR，每管PCR 混合液只加單端引物，96℃1 min，（96℃10 s，50℃5 s，60℃4 min）×25 循環(huán)，純化上機(jī)在毛細(xì)管電泳儀（美國(guó)應(yīng)用生物公司；3500Dx）上測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 導(dǎo)流雜交結(jié)果

通過(guò)第一輪的導(dǎo)流雜交法檢測(cè)4 個(gè)耳聾基因13個(gè)位點(diǎn)，總陽(yáng)性率為3.64%（739/20299）。其中GJB2：35delG 雜合突變1 例；GJB2：176del16 雜合突變14例；GJB2：235delC 雜合突變349 例；GJB2：299delAT 雜合突變40 例；GJB2：155delTCTG突變未發(fā)現(xiàn)；PDS：2168A＞G 雜合突變26 例；PDS：IVS7-2A＞G 雜合突變180 例；PDS：1229C＞T 雜合突變50 例；mtDNA：1555A＞G 均質(zhì)突變36 例，異質(zhì)突變13 例，低比例異質(zhì)突變1例；mtDNA：1494C＞T 均質(zhì)突變3 例，異質(zhì)突變2 例，mtDNA：12201T＞C 突變未發(fā)現(xiàn)；mtDNA：7445A＞G 突變未發(fā)現(xiàn)；GJB3：538C＞T 雜合突變24 例（表1）。

2.2 線(xiàn)粒體基因測(cè)序結(jié)果

通過(guò)對(duì)線(xiàn)粒體基因擴(kuò)增特定位點(diǎn)并進(jìn)行Sanger法基因測(cè)序驗(yàn)證，檢測(cè)出24 種突變位點(diǎn)。根據(jù)測(cè)序峰值結(jié)果判斷是均質(zhì)突變或異質(zhì)突變，通過(guò)查詢(xún)線(xiàn)粒體基因數(shù)據(jù)庫(kù)判斷其突變性質(zhì)，分為5 種性質(zhì)：良性突變、疑似良性突變、致病性未明、疑似致病突變、致病突變。其中良性突變位點(diǎn)6 種，疑似良性突變位點(diǎn)1 種，致病性突變位點(diǎn)3 種，致病性未明突變位點(diǎn)14種。共檢測(cè)出線(xiàn)粒體突變陽(yáng)性130 例（表2）。

表2 Sanger 測(cè)序鑒定結(jié)果（n=130）

3 討論

聽(tīng)力障礙使得患者自幼無(wú)法接收語(yǔ)言信號(hào)而形成聾啞。在我國(guó)，每年出生聽(tīng)力缺陷兒童約3 萬(wàn)，2010年末聽(tīng)力殘疾人口達(dá)到了2054 萬(wàn)，占2010年全部殘疾人口的24%[4]。遺傳性耳聾中超過(guò)70%的患者為非綜合征型耳聾，大約5%由線(xiàn)粒體DNA 突變引起，屬于母系遺傳[5]。線(xiàn)粒體的功能損傷除了與耳聾相關(guān)，還與遺傳性糖尿病、衰老、腫瘤等多種疾病有關(guān)[6]。

線(xiàn)粒體DNA 包含37 個(gè)基因，涉及rRNA、tRNA和多種參與氧化磷酸化的酶復(fù)合物。線(xiàn)粒體12SrRNA突變與非綜合征性聽(tīng)力損失有關(guān)。但單獨(dú)的mtRNR1突變不足以產(chǎn)生臨床表型。還需要修飾因子、氨基糖苷類(lèi)抗生素和線(xiàn)粒體單倍型的參與。線(xiàn)粒體基因點(diǎn)突變導(dǎo)致tRNA 的修飾，rRNA 結(jié)構(gòu)的改變從而影響到ATP 的生產(chǎn)。比如A1555G 的突變影響了rRNA 基因氨?；?tRNA 受體位點(diǎn)。突變的12SrRNA 的結(jié)構(gòu)類(lèi)似于細(xì)菌大腸桿菌的16SrRNA，因此中斷了RNA 轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成。受影響的內(nèi)毛細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致漸進(jìn)的感音神經(jīng)聽(tīng)力損失，從而出現(xiàn)了一針致聾的現(xiàn)象[7]。線(xiàn)粒體DNA 的突變率是核DNA 的10 倍左右。因此線(xiàn)粒體DNA 的突變呈現(xiàn)出更大的異質(zhì)性。如3243 腺嘌呤到鳥(niǎo)嘌呤的突變，根據(jù)異質(zhì)性比例不同，可導(dǎo)致線(xiàn)粒體腦肌病MELAS 或糖尿病伴聽(tīng)力障礙。由于線(xiàn)粒體DNA 基本來(lái)源于卵母細(xì)胞，所以患者表現(xiàn)為母系遺傳，mtDNA 拷貝數(shù)變化在不同疾病或疾病發(fā)展的不同階段變化有所不同[8]。因此本研究對(duì)來(lái)產(chǎn)檢的孕婦進(jìn)行了充分的遺傳咨詢(xún)和耳聾宣教，在知情同意后對(duì)孕婦進(jìn)行了線(xiàn)粒體耳聾基因的篩查。并對(duì)于部分篩查可疑的孕婦進(jìn)行了線(xiàn)粒體特定片段的基因測(cè)序。

本研究采用導(dǎo)流雜交術(shù)檢測(cè)4 個(gè)耳聾基因13 個(gè)常見(jiàn)位點(diǎn)突變，共檢出有突變的孕婦739 例，陽(yáng)性率為3.64%。其中突變頻率最高的是GJB2 的235delC位點(diǎn)突變，共349 例，占所有突變的47.22%，其次是PDS 的IVS7-2A＞G 突變，共180 例，占所有突變比例的24.36%。該研究除了線(xiàn)粒體外的三大基因的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的中國(guó)客家新生兒篩查結(jié)果基本一致[9]。

線(xiàn)粒體A1555G 基因突變導(dǎo)致的氨基糖甙類(lèi)藥物性耳聾是迄今為止研究得最深入、最廣泛的mtDNA突變。氨基糖甙類(lèi)抗生素和線(xiàn)粒體12SrRNA 的基因突變后的堿基結(jié)合，干擾了rRNA 的蛋白合成，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，從而發(fā)生耳聾[10]。1494C＞T 突變導(dǎo)致了線(xiàn)粒體編碼的12SrRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，并極容易與氨基糖甙類(lèi)藥物結(jié)合。同時(shí)影響了線(xiàn)粒體的功能，細(xì)胞出現(xiàn)ATP 的合成障礙[11]。而線(xiàn)粒體tRNA Ser7445A＞G 突變會(huì)導(dǎo)致COI 基因的終止密碼子發(fā)生改變和線(xiàn)粒體穩(wěn)定性下降，導(dǎo)致了線(xiàn)粒體的氧化呼吸功能缺陷的發(fā)生。T12201C 突變下調(diào)了tRNA 的表達(dá)，從而影響了線(xiàn)粒體蛋白的合成、降低了氧氣消耗，進(jìn)一步引起了細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體功能障礙[12]。本研究檢測(cè)出mtDNA：1555A＞G 均質(zhì)突變36 例，mtDNA：1555A＞G 異質(zhì)突變13 例，mtDNA：1555A＞G 低比例異質(zhì)突變1 例，mtDNA：1494C＞T 均質(zhì)突變3 例，mtDNA：1494C＞T 異質(zhì)突變2 例，都與氨基糖甙類(lèi)藥物性耳聾相關(guān)。在異質(zhì)突變的情況下，由于隨著年齡的增長(zhǎng)，線(xiàn)粒體突變的改變，以及不同組織中線(xiàn)粒體的異質(zhì)性，臨床仍然建議一般情況下不使用耳毒性藥物。mtDNA：12201T＞C 突變和mtDNA：7445A＞G 突變?cè)谶@次研究中都沒(méi)有檢測(cè)到。比較相關(guān)文獻(xiàn)，這可能與本研究的樣本群體有關(guān)，提示線(xiàn)粒體基因存在異質(zhì)性，也提示線(xiàn)粒體基因測(cè)序的必要性[13]。

本研究對(duì)線(xiàn)粒體特定片段位置進(jìn)行擴(kuò)增并采用Sanger 測(cè)序檢測(cè)突變，結(jié)果顯示發(fā)生130 例線(xiàn)粒體陽(yáng)性突變，其中包括24 種突變位點(diǎn)，6 種為良性突變，但是其中的m.7444G＞A 以前認(rèn)為有風(fēng)險(xiǎn)。研究[14]表明，tRNASer7444 位點(diǎn)的鳥(niǎo)嘌呤到腺嘌呤的突變會(huì)引起線(xiàn)粒體COI 基因翻譯后的多肽鏈在C 端增加了3 個(gè)氨基酸（賴(lài)氨酸-谷酰胺-賴(lài)氨酸），從而導(dǎo)致折疊后的蛋白結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，進(jìn)而影響復(fù)合物的功能。研究還發(fā)現(xiàn)了線(xiàn)粒體DNA7444 位點(diǎn)的G＞A 突變也會(huì)加重1555A＞G 突變引起的線(xiàn)粒體氧化呼吸功能的缺陷從而加重了臨床表型[14]。但，后來(lái)基于數(shù)據(jù)庫(kù)的更新，根據(jù)ACMG 指南分級(jí)，該突變被判定為致病性存在爭(zhēng)議。該位點(diǎn)所在密碼子為終止密碼子，突變后變?yōu)榫幋a亮氨酸，提醒可能存在風(fēng)險(xiǎn)，是否一定出現(xiàn)臨床癥狀則無(wú)法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)。檢測(cè)出致病性未明的突變14 種。m.12196C＞T 之前也是致病性未明，基于更新后的CMG 指南，該突變被判定為一個(gè)疑似良性突變[15]。因此線(xiàn)粒體基因測(cè)序可以豐富突變譜，隨著數(shù)據(jù)的增加，對(duì)于突變位點(diǎn)的致病性的認(rèn)識(shí)也可能改變。本研究檢測(cè)出3 種致病性位點(diǎn)。m.12192G＞A 在Leber 視神經(jīng)病有見(jiàn)報(bào)道，且提到與心肌病相關(guān)；m.7443A＞G與非綜合征型耳聾相關(guān)，患者聽(tīng)力損失程度從正常到嚴(yán)重均有可能；m.7445A＞T 與非綜合征型耳聾相關(guān)，患者聽(tīng)力損失程度從正常到嚴(yán)重均有可能。其作用機(jī)制可能與mtDNA：7445A>G 突變相似[16]。隨著基因測(cè)序更多數(shù)據(jù)的更新，線(xiàn)粒體基因的遺傳咨詢(xún)也會(huì)隨著改變。這也提示了線(xiàn)粒體基因測(cè)序具有重要價(jià)值。

綜上所述，單一的導(dǎo)流雜交術(shù)只能檢測(cè)常見(jiàn)耳聾基因位點(diǎn)，由于線(xiàn)粒體基因突變的異質(zhì)性，孕婦線(xiàn)粒體的篩查和測(cè)序可以豐富線(xiàn)粒體基因突變的數(shù)據(jù)庫(kù)。孕婦若檢測(cè)出突變，則會(huì)遺傳給下一代，且母系家族成員應(yīng)為同樣突變，臨床應(yīng)建議提示風(fēng)險(xiǎn)。因此，導(dǎo)流雜交術(shù)結(jié)合Sanger 測(cè)序法在孕婦耳聾篩查的應(yīng)用，能夠更好地為孕婦提供遺傳咨詢(xún)，在耳聾防控中有重要的價(jià)值。