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    電針對(duì)骶髓損傷后神經(jīng)源性膀胱尿潴留大鼠尿動(dòng)力學(xué)的影響和機(jī)制研究

    2021-11-29 06:58:40胡映秋王開陽扶流祥吳利東徐美玲
    中國當(dāng)代醫(yī)藥 2021年30期
    關(guān)鍵詞:差異模型

    胡映秋 王開陽 扶流祥 吳利東 徐美玲

    1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科,江西南昌 330000;2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科,江西南昌 330000

    骶髓損傷后神經(jīng)源性膀胱指的是骶段脊髓病變、腰椎病變引起脊髓損傷導(dǎo)致?lián)p傷骶髓初級(jí)排尿中樞,或者是由于臨近體神經(jīng)與副交感神經(jīng)病變導(dǎo)致的膀胱功能障礙,具體表現(xiàn)包括逼尿肌無反射,膀胱容量逐漸擴(kuò)大,尿液無法正常排出[1]。這一膀胱功能障礙使膀胱組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)出現(xiàn)病理層面的改變,可能繼發(fā)尿路反復(fù)性感染,嚴(yán)重情況下還可能出現(xiàn)腎衰,被認(rèn)為是脊髓損傷病死的主要原因[2]。因此針對(duì)骶髓損傷后神經(jīng)源性膀胱尿潴留,需要重視改善其尿動(dòng)力學(xué)狀況,提高膀胱功能。中醫(yī)將尿潴留納入“癃閉”范疇,針灸作為中醫(yī)傳統(tǒng)療法,被證實(shí)可對(duì)膀胱功能形成雙相調(diào)節(jié),還能有效抗泌尿系感染[3]。一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),對(duì)該病模型大鼠給予電針治療能增強(qiáng)其逼尿肌興奮程度,提高膀胱收縮張力,幫助膀胱排尿功能得以重建[4]。本研究選擇30 只雄性SD 大鼠,分為三組后分析電針治療的應(yīng)用價(jià)值。

    1 材料與方法

    1.1 主要儀器及試劑

    10%水合氯醛,手術(shù)臺(tái),微型蚊式鉗,眼科剪,慶大霉素(宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司,國藥準(zhǔn)字H42022058),電針治療儀(安陽市翔宇醫(yī)療設(shè)備有限責(zé)任公司,XYD-Ⅲ型,產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號(hào):YZB/豫0050-2009),F(xiàn)3 導(dǎo)管,微量灌注泵,多通道生理記錄儀[ADInstruments POWERLAB,藥(械)準(zhǔn) 字:20153212513],Primer-BLAST,TRIzol 試劑(上海恪敏生物科技有限公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒[金克?。ū本┥锛夹g(shù)有限公司,規(guī)格:50T RE0510],據(jù)蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA)[北京庫爾科技有限公司,批準(zhǔn)文號(hào):京藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2011 第2400737 號(hào)],5%脫脂奶粉 (石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司),Western 洗滌緩沖液(TBST)(上海聯(lián)邁生物工程有限公司,貨號(hào):LM-2925)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

    材料:選擇30 只健康成年雄性SD 大鼠作為本研究材料,大鼠均為無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)別,體重250~300 g,均采購于本地區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,有正規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證,許可證號(hào):SYXK(贛)2020-0016。本研究整個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程均與動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)相符合。

    分組:按照隨機(jī)數(shù)字表法選擇其中10 只作為對(duì)照組,另外20 只建立骶髓損傷后神經(jīng)源性膀胱尿潴留模型,建模成功后再將這20 只大鼠隨機(jī)分為模型組(10 只)和電針組(10 只)。

    1.3 方法

    1.3.1 建模 根據(jù)脊髓橫斷法進(jìn)行模型制備,具體操作如下。選擇10%水合氯醛行腹腔注射進(jìn)行麻醉處理,將大鼠放置為俯臥位固定在手術(shù)臺(tái)。骨性標(biāo)志選定為連接第13 浮肋的T13,向上以此類推,完成T10的定位,并進(jìn)行備皮處理,碘伏消毒后于后正中線從T8 到T12作縱向切口。將皮膚切開并逐層進(jìn)行鈍性分離處理,將T9到T11共3 個(gè)棘突以及橫突暴露出來。將橫突通過鑷子夾住并固定,選擇微型蚊式鉗T10椎板咬除,將2 mm 直徑的脊髓暴露出來,迅速通過眼科剪將脊髓剪斷,之后迅速能觀察到大鼠兩下肢有抽搐反應(yīng),尾巴會(huì)甩動(dòng),接著會(huì)徹底松弛。止血后將各層按順序關(guān)閉,選擇慶大霉素涂抹傷口。

    1.3.2 建模成功標(biāo)準(zhǔn) 建模24 h 之后能觸及膀胱隆起,且脊髓損傷的行為學(xué)評(píng)分(Basso-Beattie-Bresnahan,BBB)評(píng)分[5]結(jié)果為0 分,前肢可行走,后肢處于拖動(dòng)狀態(tài)。本研究20 只大鼠均成功建模。建模后大鼠均保持單籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)溫度恒定37℃,予其自由飲水、進(jìn)食,每天按壓其膀胱幫助其排尿以及排便,頻率2~3 次/d,另外每天選擇20 萬U 青霉素進(jìn)行腹腔注射進(jìn)行傷口感染預(yù)防,持續(xù)使用1 周。

    1.3.3 治療 對(duì)照組不給予治療,模型組不給予治療,電針組以次髎、三陰交以及中極為穴位進(jìn)行針刺治療,穴位定位:次髎穴處于第2 骶后孔部位直刺15 mm 左右,中極穴處于神闕穴與恥骨聯(lián)合上緣連線的上4/5 與下1/5 的交點(diǎn)平刺5 mm,三陰交穴位處于后肢內(nèi)踝尖直上方1 cm 部位直刺5 mm。電針刺激通過電針治療儀進(jìn)行,疏密波分別設(shè)置為10、50 Hz,相應(yīng)工作5、9 s,以大鼠肢體輕微顫動(dòng)為宜。針刺雙側(cè)次髎穴位時(shí)左側(cè)與正極連接,右側(cè)與負(fù)極連接,針刺中極穴位時(shí)與負(fù)極連接,針刺三陰交穴位時(shí)與正極保持連接,并且進(jìn)行三陰交針刺時(shí)應(yīng)該保持左右側(cè)交替取穴。每天治療1 次,每次治療時(shí)間持續(xù)20 min,持續(xù)治療1 周。

    1.4 觀察指標(biāo)

    采集及處理標(biāo)本:所有大鼠均在結(jié)束尿動(dòng)力學(xué)檢查后,通過水合氯醛實(shí)施腹腔麻醉,中心點(diǎn)選定為L(zhǎng)2~L3椎間隙,取其上、下分別1 cm 左右位置的脊髓組織,通過生理鹽水將取下的脊髓組織清洗干凈,置于-80℃溫度下保存待用。

    尿動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià):所有大鼠完成麻醉處理后,將膀胱排空,將F3 導(dǎo)管置入尿道,連接微量灌注泵、多通道生理記錄儀,保持0.1 ml/min 的恒定速度灌注恒溫生理鹽水,將各組大鼠膀胱最大容量、膀胱基礎(chǔ)壓、漏尿點(diǎn)壓力、膀胱順應(yīng)性記錄下來。

    PCR 試驗(yàn):根據(jù)基因庫(GenBank)中大鼠熱休克蛋白20(heat shock proteins-20,HSP-20)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因(Bcell lymphoma-2,Bcl-2)、BCL2-Associated X 蛋白質(zhì)(BCL2-Associated X protein,Bax)、半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)、磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)、叉頭框蛋白O1 (forkhead box protein O1,F(xiàn)OXO1)、β-actin 的mRNA 序列,通過Primer-BLAST 完成PCR 引物的設(shè)計(jì)。依據(jù)試劑說明書通過TRIzol 試劑相應(yīng)提取三組大鼠脊髓組織的總RNA,通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄將RNA 為互補(bǔ)cDNA,繼續(xù)依據(jù)說明書通過SYBR Green Ⅰ染料法完成定量PCR 試驗(yàn)。PCR 反應(yīng)程序:95℃下進(jìn)行0.5 min 預(yù)變性;94℃變性5 s,60℃退火0.5 min,72℃延伸0.5 min(上述3 個(gè)溫度擴(kuò)增40個(gè)循環(huán));最后72℃下進(jìn)行10 min 延伸。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行3次,以3 次平均值記錄為最終結(jié)果。

    Western blot 試驗(yàn):稱量50 mg 脊髓組織樣品,勻漿處理,留心處理后留取上層清液,根據(jù)BCA 法說明書測(cè)定蛋白濃度,5×Loading buffer 混合均勻,行持續(xù)5 min 的沸水浴。每泳道上樣蛋白40 μg,聚丙烯酰胺凝膠電泳,切膠、濕法轉(zhuǎn)膜,接著浸泡在5%脫脂奶粉中,室溫環(huán)境下靜置1 h 左右。之后把膜、一抗放在4℃冰箱中進(jìn)行過夜孵育,1×TBST 進(jìn)行3 次清洗,每次清洗持續(xù)10 min。接著選擇1×TBST 稀釋的二抗放在37℃環(huán)境下進(jìn)行1 h 孵育,繼續(xù)用1×TBST 進(jìn)行3次清洗,每次清洗持續(xù)15 min。顯色曝光后掃描底片,對(duì)蛋白灰度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    利用SPSS 23.0 分析所有數(shù)據(jù),計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,三組比較采用ANOVA 分析,組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn),以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 三組尿動(dòng)力學(xué)的比較

    三組的膀胱順應(yīng)性、漏尿點(diǎn)壓力、膀胱基礎(chǔ)壓、膀胱最大容量結(jié)果比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);模型組、電針組的上述指標(biāo)均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);電針組上述指標(biāo)結(jié)果均低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

    表1 三組大鼠尿動(dòng)力學(xué)的比較(±s)

    表1 三組大鼠尿動(dòng)力學(xué)的比較(±s)

    與對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;1 cmH2O=0.098 kPa

    對(duì)照組模型組電針組F 值P 值10 10 10 0.09±0.01 0.19±0.02a 0.13±0.01ab 5.462 0.000 38.89±2.21 52.16±4.17a 44.18±3.19ab 6.819 0.000 26.03±2.19 29.73±2.38a 27.15±2.47ab 5.378 0.000 1.18±0.13 4.40±0.36a 2.30±0.21ab 8.814 0.000組別 例數(shù) 膀胱順應(yīng)性(ml/cmH2O)漏尿點(diǎn)壓力(cmH2O)膀胱基礎(chǔ)壓(cmH2O)膀胱最大容量(ml)

    2.2 三組大鼠HSP20、PTEN 的mRNA 表達(dá)的比較

    三組HSP20、PTEN 的mRNA 水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);模型組、電針組大鼠脊髓組織HSP20 的mRNA 水平均低于對(duì)照組,PTEN 的mRNA水平均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);電針組大鼠脊髓組織HSP20 的mRNA 水平高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),電針組大鼠脊髓組織PTEN 的mRNA 水平低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

    表2 三組大鼠脊髓組織HSP20、PTEN 的mRNA 水平的比較(±s)

    表2 三組大鼠脊髓組織HSP20、PTEN 的mRNA 水平的比較(±s)

    與對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05

    對(duì)照組模型組電針組F 值P 值10 10 10 1.70±0.39 0.68±0.16a 1.22±0.30ab 7.182 0.000 0.86±0.21 2.33±0.56a 1.50±0.35ab 11.057 0.000組別 例數(shù) HSP20 mRNA PTEN mRNA

    2.3 三組大鼠Akt 活化及凋亡通路mRNA 表達(dá)的比較

    三組Bax、FOXO1、Bcl-2、Caspase-9、Akt 水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);模型組、電針組Bcl-2、Akt 水平均低于對(duì)照組,Bax、FOXO1、Caspase-9 均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05);電針組Bax、FOXO1、Caspase-9 水平均低于模型組,Bcl-2 高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),電針組、模型組Akt 比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

    表3 三組大鼠脊髓組織Akt 通路凋亡相關(guān)因子mRNA 水平(±s)

    表3 三組大鼠脊髓組織Akt 通路凋亡相關(guān)因子mRNA 水平(±s)

    與對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05

    對(duì)照組模型組電針組F 值P 值10 10 10 0.28±0.06 1.31±0.33a 0.94±0.22ab 7.593 0.000 0.92±0.21 2.56±0.63a 1.48±0.37ab 6.832 0.000 1.51±0.33 0.62±0.15a 1.12±0.27ab 7.924 0.000 0.85±0.21 1.67±0.41a 1.19±0.29ab 10.057 0.000 1.06±0.13 1.01±0.11a 1.00±0.10a 3.054 0.019組別 例數(shù) Bax FOXO1 Bcl-2 Caspase-9 Akt

    3 討論

    中醫(yī)將尿潴留納入“癃閉”范疇,認(rèn)為其發(fā)生是由于腎氣不足,膀胱氣化失司,三焦無法通調(diào)水道而起[6]。本研究電針組治療選擇的穴位為次髎、中極以及三陰交穴,其中次髎為膀胱經(jīng)穴位,不僅為局部取穴,也是膀胱病變治療的常用穴位。中醫(yī)典籍中有“次髎,主大小便不利”;三陰交穴是足三陰經(jīng)交會(huì)穴,足三陰經(jīng)循行少腹或陰器,有通調(diào)下焦氣機(jī)的作用,可對(duì)膀胱功能起到調(diào)節(jié)作用[7]。中極穴是膀胱募穴,屬于足三陰與任脈之會(huì),中醫(yī)中六腑病變?nèi)⊙ㄖ委煻嗳〈颂幯ㄎ唬袠O穴被認(rèn)為是膀胱病變治療的重要穴位[8]。

    從排尿反射神經(jīng)通路這一層面來看,排尿中樞處在骶叢神經(jīng),次髎穴下有支配盆腔臟器的骶神經(jīng),對(duì)這一穴位進(jìn)行針刺治療能將與排尿相關(guān)的傳入與傳出神經(jīng)激活,還能經(jīng)傳入神經(jīng)元向高級(jí)中樞傳導(dǎo)刺激,激發(fā)逼尿肌、膀胱內(nèi)括約肌節(jié)律性收舒運(yùn)動(dòng),最終建立并完成排尿反射[9]。三陰交穴位下通過著L4~S3神經(jīng)根的脛神經(jīng),且深層有L5、S1神經(jīng)節(jié)段,淺層有屬于L4神經(jīng)節(jié)段的隱神經(jīng),通過對(duì)這一穴位進(jìn)行刺激治療能經(jīng)反射弧傳至脊髓后根,對(duì)腰骶部排尿中樞有激發(fā)作用,可促進(jìn)反射性排尿[10]。研究對(duì)三陰交、次髎等穴位進(jìn)行針刺治療,顯示患者尿道括約肌舒縮功能、膀胱運(yùn)動(dòng)功能均有明顯改善,同時(shí)膀胱最大容量明顯下降,殘余尿量明顯減少[11-12]。中極穴處在膀胱局部,是支配膀胱、直腸的神經(jīng)分支-髂腹下神經(jīng),對(duì)這一穴位進(jìn)行針刺治療能對(duì)膀胱產(chǎn)生刺激,促使膀胱逼尿肌收縮,幫助膀胱皺襞能再次皺縮,促進(jìn)排尿反射,生成尿意[13]。研究對(duì)關(guān)元與中極穴進(jìn)行電針治療,顯示電針可經(jīng)自主神經(jīng)刺激傳入神經(jīng),對(duì)膀胱活動(dòng)形成調(diào)節(jié),并能幫助恢復(fù)膀胱功能[14-15]。

    本研究電針組治療后膀胱最大容量、漏尿點(diǎn)壓力、膀胱順應(yīng)性均較模型組明顯下降,接近對(duì)照組水平,提示電針治療能改善脊髓損傷尿潴留患者的排尿中樞功能,促使膀胱逼尿肌彈性提升,能幫助逼尿肌反射逐漸恢復(fù),并維持正常收縮功能,減低膀胱最大容量,減少殘余尿量,進(jìn)而使膀胱功能得到改善。本研究電針組大鼠脊髓組織HSP20 的mRNA 水平高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),電針組大鼠脊髓組織PTEN 的mRNA 水平低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),證實(shí)HSP20 上升、PTEN 下降能提高Akt 活性,表明電針治療對(duì)脊髓損傷尿潴留的作用機(jī)制可能與HSP20、PTEN 水平具有緊密聯(lián)系。另外本研究顯示模型組、電針組Bcl-2、Akt 水平均低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),模型組、電針組Bax、FOXO1、Caspase-9 均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);電針組Bax、FOXO1、Caspase-9 水平均低于模型組,Bcl-2 高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),電針組、模型組Akt 比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示接受電針治療能提升Akt 活性,并會(huì)對(duì)下游Bcl-2、Bax、Caspase-9、FOXO1 的表達(dá)產(chǎn)生影響,對(duì)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑制作用。上述結(jié)果表明,骶髓損傷后神經(jīng)源性膀胱尿潴留會(huì)加快細(xì)胞凋亡,神經(jīng)細(xì)胞受損,因此脊髓、膀胱功能會(huì)受到影響,膀胱排尿功能變得異常,最終引發(fā)尿潴留[16]。通過實(shí)施電針治療,能加快HSP20表達(dá),促進(jìn)其磷酸化轉(zhuǎn)變,對(duì)PTEN 表達(dá)產(chǎn)生抑制,并提升Akt 活性,提升下游Bcl-2 水平,對(duì)凋亡因子包括Bax、Caspase-9、FOXO1 的表達(dá)產(chǎn)生抑制,形成對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用,最終幫助恢復(fù)部分脊髓神經(jīng)功能,并使神經(jīng)中樞對(duì)膀胱組織的調(diào)控得以提升,使逼尿肌、括約肌的功能以及膀胱內(nèi)壓維持在正常水平,使膀胱排尿功能、收縮功能得以改善,最終能使尿潴留癥狀逐漸減輕[17-18]。

    綜上所述,電針治療骶髓損傷后神經(jīng)源性膀胱尿潴留大鼠能改善其尿動(dòng)力學(xué),具體作用機(jī)制考慮與抑制PTEN 表達(dá)、促進(jìn)HSP20 磷酸化與表達(dá),并進(jìn)一步抑制凋亡通路、提高Akt 活性相關(guān)。

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