內(nèi)分泌干擾物對魚類性腺干擾的分子作用機制

楊超超，潘鵬濤，譚 婷，楊 娜，雷 忻*

(1.延安大學 生命科學學院；2.延安市生態(tài)恢復重點實驗室，陜西 延安，716000)

內(nèi)分泌干擾物(Endocrine Disrupting Chemicals，EDCs)，是一類能夠通過對性激素的合成、分泌、運輸及代謝等途徑產(chǎn)生干擾從而影響動物正常生命活動的外源性化學物質(zhì)[1]。EDCs又稱環(huán)境激素，多數(shù)EDCs表現(xiàn)出雌激素活性，少數(shù)EDCs則表現(xiàn)出雄激素活性。部分EDCs可在水環(huán)境中長期存在，并可借助食物鏈的放大作用在魚體內(nèi)富集，對魚類性腺和生長繁殖產(chǎn)生較大影響[2-3]。本文就EDCs對魚類卵黃蛋白原、性類固醇激素、性腺相關(guān)基因的干擾作用研究現(xiàn)狀進行綜述，旨在為EDCs干擾魚類性腺發(fā)育和生殖活動的相關(guān)研究提供參考資料。

1 EDCs對魚類卵黃蛋白原的影響

卵黃蛋白原(Vitellogenin,Vtg)是大多數(shù)卵生動物卵黃蛋白的前體，主要由雌激素誘導、在動物肝臟中合成，但雌激素受體(Estrogen Receptor，ER)并非只存在于雌魚肝臟，其在幼魚和雄魚體內(nèi)也有存在，因此，雄魚和幼魚在外源雌激素或雌激素類似物誘導下，雌激素類似物與性類固醇激素結(jié)合球蛋白結(jié)合，繼而與肝臟內(nèi)的ER形成復合物，在二聚化后結(jié)合到位于Vtg基因啟動子附近的雌激素反應元件的基因組DNA序列上，之后經(jīng)二聚體化、脂化、磷酸化和糖基化，導致其肝臟也能分泌Vtg[4-5]。

大量研究表明，EDCs可以對魚類Vtg水平產(chǎn)生顯著影響，并可能導致雌魚卵巢增重等現(xiàn)象，這種效應在一定程度上受暴露時間及濃度等因素影響。通過對雄性羅非魚進行更新式水體暴露染毒試驗發(fā)現(xiàn)，滅多威使雄性羅非魚Vtg水平顯著上升[6]。對雄性金魚進行久效磷暴露可誘導Vtg在其肝臟中合成，并導致雌性金魚卵巢增重[7]。滴滴涕(Dichlorodiphenyltrichloroethane，DDT)暴露能夠誘導雄性唐魚產(chǎn)生Vtg[8]。菲(Phenanthrene，Phe)暴露可誘導雄性泥鰍Vtg的合成[9]。隨著辛基酚(Octylphenol，OP)暴露劑量增大和時間延長，雄性泥鰍Vtg合成有增強趨勢[10]。壬基酚(Nonyl Phenol，NP)處理能顯著誘導雄性幼齡泥鰍血清Vtg水平上升，且誘導效應與濃度在一定范圍內(nèi)成正比[11]。這說明以上幾種EDCs均表現(xiàn)出類雌激素性質(zhì)，可以誘導Vtg的合成。

而EDCs對Vtg水平的影響可能與Vtg基因有一定關(guān)系。Vtg基因上調(diào)可促進Vtg的生成，下調(diào)表達的結(jié)果則相反，而EDCs可以調(diào)控Vtg基因的表達，這種調(diào)控因EDCs種類及暴露濃度等因素出現(xiàn)不同結(jié)果。李棟[12]研究發(fā)現(xiàn)2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)暴露不僅提高了性分化期斑馬魚Vtg水平，也上調(diào)了Vtg基因表達。夏爽[13]研究發(fā)現(xiàn)草甘膦暴露能促進青鳉幼魚肝臟Vtg基因表達。而2種三唑類殺菌劑(己唑醇，苯醚甲環(huán)唑)暴露均能誘導雄性斑馬魚肝臟Vtg1和Vtg2基因表達水平顯著升高，且Vtg1比Vtg2更敏感[14]。但也有研究指出，隨三唑酮暴露濃度的升高，斑馬魚群體Vtg1基因表達量受到抑制[15]。而EDCs對Vtg水平的影響也可能與受試動物種類及性別有一定關(guān)系，研究表明，一定濃度的阿特拉津(atrazine，ATZ)暴露對雌性斑馬魚肝臟Vtg1和Vtg2基因的表達具有顯著誘導效應，但未顯著影響雄魚肝臟Vtg1和Vtg2基因的表達量[16]。而少量ATZ暴露可顯著誘導雄性斑馬魚肝臟Vtg基因的表達上調(diào)[17]。

由此可見，EDCs對魚類Vtg的調(diào)控因暴露濃度以及EDCs類型等而有所差異，大多數(shù)雌激素類EDCs都會使Vtg基因上調(diào)從而導致Vtg水平升高，雄激素類EDCs會下調(diào)Vtg基因的表達從而導致Vtg水平降低，這可能是因為雌激素類EDCs可以使ER復合物增加，并促進二聚體化、脂化、磷酸化和糖基化等過程，而雄激素類EDCs對其有抑制作用。而Vtg合成過程需要一定物質(zhì)以及能量，因此過早或過量的合成Vtg都會影響魚類的正常發(fā)育，甚至可能導致雄魚的雌性化。

2 EDCs對魚類性類固醇激素的影響

性類固醇激素對魚類性腺分化、發(fā)育等過程具有極其重要的影響，其合成以膽固醇為前體物質(zhì)，經(jīng)側(cè)鏈縮短，先形成孕酮或孕烯醇酮，再脫去一個側(cè)鏈變成雄激素，最后經(jīng)A環(huán)芳香化途徑生成雌激素，且雌激素與雄激素在魚類體內(nèi)可以相互轉(zhuǎn)換。目前，睪酮(Testosterone，T)、11-酮基睪酮(11-ketotestosterone，11-KT)、雌酮(Estrone，E1)、雌二醇(Estradiol，E2)和雌三醇(Estriol，E3)等性類固醇激素是魚類中研究較多的幾類[12]。而EDCs可能會通過對性類固醇激素的調(diào)控對魚類的生長發(fā)育產(chǎn)生一定的影響，這種調(diào)控在性類固醇激素受體及其相關(guān)基因方面也有一定的體現(xiàn)。

大量研究發(fā)現(xiàn)，EDCs會影響魚類雄激素水平及其受體基因表達水平，大多表現(xiàn)為對雄激素及其受體基因表達水平的抑制作用。高濃度ATZ暴露可導致斑馬魚體內(nèi)雄激素水平降低[17]。李棟[12]研究表明不同濃度2,4-DCP 暴露均導致斑馬魚體內(nèi)11-KT以及T水平下調(diào)。久效磷暴露也可使雄性金魚T合成受到抑制，而雄激素T含量的降低可能是由于久效磷對類固醇生成途徑的抑制所導致的效果[18]。又有研究證明一定濃度雙酚A(Bisphenol A，BPA)暴露可以抑制稀有鮈鯽雄激素受體(Androgen Receptor，AR)的表達從而擾亂性激素合成相關(guān)基因的表達[19]。且NP與BPA暴露均可顯著下調(diào)稀有鮈鯽幼魚AR基因的mRNA表達[20]。

EDCs對魚類雌激素水平及受體基因也具有一定調(diào)控作用，大多數(shù)表現(xiàn)為促進雌激素生成，上調(diào)雌激素受體基因的表達。研究表明，2種三唑類殺菌劑(己唑醇，苯醚甲環(huán)唑)暴露均能造成斑馬魚血漿E2含量增高；而在分子層面上，己唑醇和苯醚甲環(huán)唑暴露都可使斑馬魚肝臟ERα和ERβ1基因表達量顯著上調(diào)[14]。呋喃丹暴露可使斑馬魚E2含量顯著上升，上調(diào)斑馬魚ER基因表達[21]。但戊唑醇暴露導致斑馬魚雌魚ERβ基因的表達顯著下調(diào)，且通過抑制cyp19表達，進一步加劇E2水平的下調(diào)，從而體現(xiàn)其抗雌激素效應[22]。關(guān)于cyp19與ER的關(guān)系，有研究表明，BPA暴露可影響斑馬魚cyp1基因的表達，從而干擾ERs的響應和性腺E2合成[23]。戴奇的研究也證實了這種觀點，暗紋東方鲀雌魚體內(nèi)cyp19a的高度表達，產(chǎn)生大量的芳香化酶，催化雄烯二酮和T向 E1和E2轉(zhuǎn)化[24]。而三丁基錫(tri-n-butyltin hydride，TBT)暴露處理可顯著降低cyp19amRNA在孔雀魚卵巢中的表達水平，導致芳香化酶將T轉(zhuǎn)化為E2的效率下降，從而顯著降低雌魚E2水平[25]。而EDCs對魚類雌激素的影響也因EDCs的聯(lián)合暴露呈現(xiàn)不同的結(jié)果，TBT與NP聯(lián)合暴露使斑馬魚ERα的合成基因esr1基因的表達量較NP單獨暴露呈下調(diào)趨勢[26]。而esr1基因下調(diào)可導致魚類卵巢的退化，有研究表明，雌性斑馬魚esr1缺失導致卵巢功能的退化與mTOR信號通路相關(guān)[27]。

而EDCs也可通過調(diào)節(jié)性類固醇激素相關(guān)基因的表達來調(diào)控影響性類固醇激素。研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度BPA暴露可以抑制雌性稀有鮈鯽性類固醇激素合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄因子表達[19]。而NP暴露可干擾類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(Steroidogenic acute regulatory protein，StAR)及膽固醇側(cè)鏈裂解酶(cholesterol side chain cleavage enzyme，P450scc)表達，從而對魚類卵巢激素的合成產(chǎn)生影響，且P450scc和StAR基因的表達模式與11-KT水平也存在伴隨濃度特異性的直接關(guān)系[28]。這可能是因為高濃度的雌激素類EDCs會抑制類固醇激素相關(guān)基因的表達，從而降低了膽固醇向孕酮以及雄激素的轉(zhuǎn)化，最終影響了卵巢激素的合成。

由此可見，芳香化酶、固醇酶與ER、esr1等在性類固醇激素的產(chǎn)生中發(fā)揮著重要作用，而mTOR等信號通路也是其變化的因素之一。一定濃度的雌激素類EDCs通過促進相應的性類固醇生成途徑或降低AR的表達量從而促使了雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化，最終導致雄激素含量降低；且雌激素類EDCs可以通過促進ER及cyp19a、esr1等基因的表達，加速雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化，而雄激素類EDCs在這個過程中起相反作用。但某些EDCs可能具有兩重性，表現(xiàn)為低濃度促進，高濃度抑制，這可能是因為過高濃度的EDCs對魚體的內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生了嚴重損傷。

3 EDCs對魚類性腺發(fā)育相關(guān)基因表達的影響

對大多數(shù)魚類來說，性腺是生殖內(nèi)分泌調(diào)控過程中重要的靶器官，性腺相關(guān)基因mRNA具有高度不穩(wěn)定性，不同環(huán)境脅迫下，基因表達水平會出現(xiàn)一定差異，而轉(zhuǎn)錄組可以在一定程度上反映出這些變化特點。目前，在轉(zhuǎn)錄組學研究中應用較多的是RNA高通量測序技術(shù)(RNA high-throughput Sequencing，RNA-seq)，RNA-seq有助于從轉(zhuǎn)錄組水平了解EDCs對上調(diào)基因、下調(diào)基因等的影響[29]。

3.1 EDCs對精巢發(fā)育相關(guān)基因的影響

一些基因?qū)τ诰驳男纬梢约鞍l(fā)育具有重要作用。Sox9基因?qū)π坌詡€體的正常發(fā)育具有誘導效應，當Sox9基因異常表達時可致使動物發(fā)生性反轉(zhuǎn)現(xiàn)象(Double-sex and Mab-3 related transcription factor,dmrt)基因可能與精巢足細胞發(fā)育有關(guān)，gsdf基因能夠誘導精巢組織的分化，抗苗勒氏管激素基因(AMH)的過表達會抑制勒氏管分化，刺激中腎管分化成雄性生殖器[30-33]。不僅如此，主要在卵巢中表達的cyp19a1a對于精巢的形成以及發(fā)育也有一定作用。由此猜測，魚類精巢的異常發(fā)育可能是由于EDCs對精巢相關(guān)基因的影響，這種影響可能表現(xiàn)為抑制或促進Sox9、cyp19a1a等基因的表達。

EDCs可以影響魚類Sox9 、dmrt1等精巢相關(guān)基因的表達，這種影響與cyp19a1a等基因存在一定關(guān)系，且濃度、溫度、魚種類及EDCs種類等因素也會對精巢相關(guān)基因的表達產(chǎn)生不同影響。研究發(fā)現(xiàn)，不同EDCs對魚類相同基因具有不同的影響效果，來曲唑(Letrozole，LET)暴露使金錢魚幼魚Sox9基因表達量顯著上升[34]。而ATZ暴露可下調(diào)雄性斑馬魚Sox9a基因表達，并減少精原細胞數(shù)量，增加精小管管間間隙[17，35]。除Sox9基因外，氯咪巴唑暴露導致雄性斑馬魚精巢中cyp19a1a等基因的轉(zhuǎn)錄表達上調(diào)[36]。溫度可能也是影響EDCs對基因調(diào)控的因素之一，高溫和甲基睪酮(MT)暴露聯(lián)合處理，可顯著上調(diào)尼羅羅非魚幼魚dmrt1基因表達水平，并顯著下調(diào)cyp19a1a基因表達水平[37]。此外，王偉偉[38]也通過高通量測序法證實了尼羅羅非魚中dmrt1基因與cypl9a1a基因的表達成負相關(guān)。這說明，雄激素類EDCs可能上調(diào)精巢相關(guān)基因的表達，而雌激素類EDCs對其有抑制作用；而精巢內(nèi)cyp19a1a基因的上調(diào)表達可促進芳香化途徑從而對精巢產(chǎn)生損傷，進而抑制其基因表達。BPA對暗紋東方鲀雄魚暴露發(fā)現(xiàn)，dmrt1和cyp19a基因先下調(diào)后上調(diào)[39]。這可能是因為雌激素類EDCs可以抑制雄魚體內(nèi)雄激素水平，從而致使短時間內(nèi)雌激素水平的下降，進而導致dmrt1和cyp19a基因下調(diào)，但一段時間后，雌激素類EDCs誘導雌激素含量上升，這在一定程度上加速了雄激素的合成，最終上調(diào)了dmrt1和cyp19a基因的表達。BPA暴露可促進cyp19a等相關(guān)基因在斑馬魚精巢中表達，且濃度升高時基因mRNA表達量顯著上調(diào)[40]。由此可見，濃度是影響精巢發(fā)育相關(guān)基因表達的重要因素，而cyp19a因魚種類的不同而產(chǎn)生的差異性表達，可能是因為不同魚類內(nèi)分泌系統(tǒng)具有不同的調(diào)節(jié)閾，這也間接說明了EDCs對不同魚類體內(nèi)精巢相關(guān)基因的影響存在一定程度上的差異，但大部分表現(xiàn)為抑制效應。

上述研究報道表明，EDCs可能導致精巢相關(guān)基因的表達上調(diào)，也可能下調(diào)其表達。EDCs性質(zhì)以及魚的種類是影響調(diào)控的重要因素，暴露濃度以及溫度等條件可能是其制約條件，且cyp19a1a等基因與精巢相關(guān)基因之間存在一定關(guān)系。

3.2 EDCs對卵巢發(fā)育相關(guān)基因的影響

卵巢相關(guān)基因是動物卵巢產(chǎn)生及生長、發(fā)育的重要因素。foxl2基因是卵巢分化和維持過程中的關(guān)鍵基因，cyp19a1a基因可能參與了卵巢發(fā)育、雌性特征維持等過程，Sox9等基因在此過程也起到一定作用[41-43]。

cyp19a等卵巢發(fā)育相關(guān)基因可隨EDCs種類等因素的不同呈現(xiàn)不同的表達結(jié)果，與芳香化酶抑制劑作用相似的EDCs對卵巢發(fā)育相關(guān)基因的影響具有相似性，其在一定程度上可以抑制卵巢發(fā)育相關(guān)基因表達，這可能是通過促進dmrt1等基因表達或影響基因甲基化水平等信號通路來實現(xiàn)的。在EDCs對雌魚基因的研究中發(fā)現(xiàn)，屬于雌激素類EDCs的ATZ暴露對斑馬魚卵巢中cyp19a基因的上調(diào)表達產(chǎn)生了誘導效應[16]。長期及高濃度雄激素類EDCs來曲唑(Letrozole，LET)暴露使黃河鯉雌性相關(guān)基因的表達下調(diào)，而ATZ的影響則相反[44]。關(guān)于ATZ和LET對生物性腺發(fā)育相關(guān)基因的影響，王菊等[45]的研究中也出現(xiàn)了類似結(jié)果。這恰恰說明不同性質(zhì)的EDCs具有不同的效果，但一定濃度的雌激素類EDCs(BPA和NP)可能與LET具有相似的性質(zhì)，BPA能夠通過調(diào)整斑馬魚cyp19ala基因DNA甲基化水平影響其表達，趙飛[23]研究發(fā)現(xiàn)一定濃度BPA暴露使斑馬魚卵巢cyp19alamRNA水平顯著降低。同樣，暴露于NP環(huán)境3 d后，鯽魚卵巢中控制芳香化酶mRNA表達的cyp19ala基因也明顯受到抑制[46]。這與前文中BPA與NP對性類固醇激素相關(guān)基因的影響結(jié)果相同，這提示我們某些雌激素類EDCs可在一定濃度時抑制cyp19ala的表達。又有文獻表明，17α-MT暴露導致cyp19a1a基因在黃姑魚雌魚中的表達受抑制，而增強dmrt1基因表達，使Sox9a、Sox9b基因在雌性大黃魚性腺中的表達顯著上調(diào)，并誘導Sox9和amh基因表達，使其在偽雄性虹鱒魚性腺中的表達量顯著高于雌性虹鱒[30，47，48]。這在一定程度上說明LET等性質(zhì)相似的EDCs與17α-MT具有相近的毒性作用，其通過促進dmrt1等基因表達或影響基因甲基化水平來抑制卵巢發(fā)育相關(guān)基因的表達。

3.3 EDCs對魚類性逆轉(zhuǎn)的誘導作用

性逆轉(zhuǎn)是指動物雌雄個體在一定條件下相互轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。在性腺性分化期用EDCs處理幼魚可起到性逆轉(zhuǎn)作用，但具體的誘導機制目前尚沒有準確定論。雌激素類EDCs暴露可能會導致處于性分化時期的魚類發(fā)生由雄性到雌性的轉(zhuǎn)變，雄激素類EDCs暴露誘導魚類由雌性到雄性的轉(zhuǎn)變，兩種不同類型的EDCs互相起拮抗作用。谷偉等證實17α-MT暴露可以誘導雌性虹鱒魚的雄性化[48]。李廣麗等[49]通過對2齡赤點石斑魚雌魚腹部埋植17α-MT處理，發(fā)現(xiàn)17α-MT可對赤點石斑魚性逆轉(zhuǎn)具有不同程度的誘導效應。LET處理使金錢魚性腺出現(xiàn)不同程度的由雌性向雄性的性逆轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為卵母細胞退化，精原細胞出現(xiàn)[34]。然而有研究表明，某些EDCs的作用表現(xiàn)出互相拮抗。李棟發(fā)現(xiàn)不同濃度的2,4-DCP暴露均可導致斑馬魚雌性化；但與單一2,4-DCP處理相比，不同濃度2,4-DCP與法倔唑聯(lián)合暴露均使雌性斑馬魚的比例極顯著下調(diào)，致使斑馬魚性別比例向雄性偏轉(zhuǎn)[12]。

而EDCs對魚類的性逆轉(zhuǎn)的誘導機制可能與foxl2、cyp19a、amh、gsdf等基因有關(guān)，雄激素類EDCs可通過改變cyp19a等基因的表達使魚類發(fā)生由雌性到雄性的性逆轉(zhuǎn)。研究表明對金錢魚性腺基因分析發(fā)現(xiàn)，amh、gsdf、Sox9b等基因在雌性生殖器中的表達量明顯低于雄性，而foxl2、cyp19a等基因在卵巢中表達水平更高[50]。而LET暴露可通過改變cyp19a基因的表達，影響暗紋東方鲀仔幼魚的性別分化，降低雌性比例，且不同暴露時間和濃度對雌性比例的影響也不同[51]。大于100 μg/g劑量的腹部埋植LET對胡子鲇向雄性分化具有顯著誘導效應，cyp19a1b在其性腺分化中可能起間接作用，但foxl2是其性腺分化的直接因素[52]。而17α-MT調(diào)控雌激素的生物合成從而影響胡子鲇性分化也與foxl2的表達受抑制有關(guān)[53]。這說明一定濃度的雌激素類EDCs可通過抑制amh、gsdf等雄性相關(guān)基因的表達，促進foxl2、cyp19a等雌性相關(guān)基因的表達，并通過促進雄性激素向雌性激素轉(zhuǎn)化、誘導雄性魚類Vtg生成等多種途徑聯(lián)合的方式來抑制雄性性腺的分化或誘導雌性性腺的分化；而雄激素類EDCs作用相反。

4 展望

目前，學者們就EDCs對魚類性腺開展了上述Vtg、性類固醇激素以及性腺相關(guān)基因研究，得出大量有價值的結(jié)果，但也存在一些問題：(1)目前，對魚類Vtg的研究集中在Vtg水平及相關(guān)基因的表達方面，而對Vtg受體、受體基因及其與Vtg之間的調(diào)控關(guān)系的研究報道相對較少；(2)目前對各種EDCs性質(zhì)未有明確認識，同性質(zhì)EDCs不同濃度下暴露對魚類的影響機制還不太明確，不同類的EDCs的聯(lián)合作用也具有不確定性，可能表現(xiàn)出協(xié)同、拮抗、相加等不同的效果；(3)目前EDCs對雄性決定基因及相關(guān)基因的研究較少。因此，未來可以在以下三個方面就EDCs對魚類性腺干擾的分子作用機制進行深入研究：(1)進一步對Vtg受體及基因進行研究。(2)深入研究EDCs聯(lián)合毒性對性腺的作用機制。(3)深入研究EDCs對雄性決定基因以及相關(guān)調(diào)控基因的影響作用。