長鏈非編碼RNA對間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響

王健雄 徐勝前

炎癥和新骨形成是強直性脊柱炎的疾病特征，異位骨化和新骨形成也是導致強直性脊柱炎患者脊柱強直乃至殘疾的主要原因[1]，但典型的影像學改變常出現(xiàn)在疾病發(fā)生多年之后，因此探討其成骨機制對強直性脊柱炎的早期治療及預防脊柱強直的發(fā)生具有重要意義。具有自我更新和多向分化潛能的間充質(zhì)干細胞來源于中胚層，在骨膜、肌肉、外周血及全身結(jié)締組織等多處均有存在。如骨髓間充質(zhì)干細胞作為生殖成纖維細胞的多能祖細胞，可以分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞，是成人骨髓中能分化為成骨細胞和脂肪細胞的主要干細胞來源[2]。這些干細胞對骨關節(jié)疾病異位骨化和新骨發(fā)生的影響及其參與調(diào)控的機制一直在探討中。近年來，隨著生物信息學、表觀遺傳學的發(fā)展，目前已有不少研究顯示長鏈非編碼RNA(LncRNA)與成骨、成肌、脂肪生成相關。炎癥、輻射射線等因素均可通過影響LncRNA的表達，從而改變成骨分化能力[3]。綜上，我們推測LncRNA可能通過影響間充質(zhì)干細胞的方式參與成骨相關疾病的發(fā)生發(fā)展。

一、LncRNA的生物學功能

LncRNA是長度>200個核苷酸的非編碼RNA。在哺乳動物的基因組序列中，4%～9%序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本是LncRNA。LncRNA起初被認為是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有生物學功能。然而，近年來的研究表明，人類基因組編碼了近50 000個LncRNA，其中大部分具有組織特異性，在劑量補償效應、表觀遺傳調(diào)控、細胞周期調(diào)控和細胞分化調(diào)控等眾多方面發(fā)揮重要作用[4]。LncRNA具有豐富多樣的生物學功能：(1)發(fā)揮微小RNA(miRNA，miR)的海綿樣吸附作用；(2)作為結(jié)構組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復合體；(3)干擾蛋白編碼基因的表達；(4)抑制RNA聚合酶Ⅱ或介導染色質(zhì)重構和組蛋白修飾；(5)與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補雙鏈，干擾mRNA的剪切，進而產(chǎn)生不同的剪切形式；(6)與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補雙鏈，在Dicer酶作用下產(chǎn)生內(nèi)源性的小干擾RNA(siRNA)，調(diào)控基因的表達水平；(7)結(jié)合特定蛋白，調(diào)節(jié)蛋白活性；(8)與特定蛋白結(jié)合，從而改變該蛋白的胞質(zhì)定位。鑒于這些LncRNA可通過多種方式參與生命體內(nèi)重要的調(diào)控過程，目前已成為研究熱點。

二、干細胞來源及其生物學特性

間充質(zhì)干細胞作為常見的成體干細胞之一，廣泛分布于全身各大組織中，如骨髓、牙髓、脂肪。作為生殖成纖維細胞的多能祖細胞，在LncRNA多種途徑及骨形成蛋白(BMP)信號通路、Wnt/β-連環(huán)蛋白(catenin)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路等多個經(jīng)典信號通路的參與下，具有分化為多種細胞組織的潛能，可以分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞，是成骨細胞和脂肪細胞的主要干細胞來源。如來源廣泛的骨髓間充質(zhì)干細胞，早在1867年，德國病理學家Cohnbeim首次提出了骨髓中存在間充質(zhì)干細胞，隨后的研究證明其具有向中胚層和神經(jīng)外胚層來源的組織細胞分化的能力，以及自我復制能力和多項分化潛能。牙源性干細胞則是牙再生研究中使用最多的種子細胞，包括牙髓干細胞、牙乳頭細胞、牙周膜干細胞等，其分化、增殖能力強，免疫原性低，對受植區(qū)環(huán)境的適應能力強，被認為是可替代骨髓干細胞成為干細胞研究的更好來源之一。其他組織的間充質(zhì)干細胞、鼠間充質(zhì)干細胞增殖能力也很強，且具有多項分化潛能，在實驗中應用廣泛。甚至在既往只因其參與組織的代謝、促進血管生成等作用而受到關注的、來源于脂肪組織中的再生細胞-脂肪干細胞，近期被學者指出，可利用LncRNA調(diào)控脂肪干細胞成骨分化，從而應用于干細胞治療，以減輕骨髓干細胞的提取有創(chuàng)操作所產(chǎn)生的疼痛癥狀[5]。

三、LncRNA抑制間充質(zhì)干細胞成骨分化

骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)擁有多重分化潛能和自我更新能力，LncRNA參與其中一系列調(diào)節(jié)。在最近一項研究中，?；撬嵘险{(diào)基因1(TUG1)通過與Smad蛋白同源物5(Smad5)的50～90個氨基酸區(qū)域互補并阻斷其核轉(zhuǎn)位[4]，或結(jié)合miR-204-5p調(diào)節(jié)Runt相關轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)的轉(zhuǎn)錄后表達，來抑制BMSCs的成骨分化[6]。這種LncRNA-miRNA模式是成骨分化的重要調(diào)控途徑之一。同樣，雙熒光素酶報告證實WNT2B是促進BMSCs成骨分化的關鍵基因，miR-370-3p被認為可以調(diào)控基因WNT2B，LINC00707對miR-370-3p的海綿樣吸附作用可減少其對WNT2B的負調(diào)節(jié)，以達到促進成骨分化的作用[7]。通過此方式的還可通過LncRNA PGC1β-OT1調(diào)節(jié)內(nèi)源性miR-148a-3p及其靶基因賴氨酸特異性脫甲基酶的表達，導致脂肪蓄積并抑制成骨細胞的分化[8]。針對BMSCs還發(fā)現(xiàn)了一些其他的調(diào)控方式，如LncRNA SEMA3B-AS1下調(diào)肌動蛋白細胞骨架、粘著斑和細胞外基質(zhì)-受體相互作用的相關蛋白質(zhì)的表達，增加剪接體中蛋白質(zhì)的表達，顯著改變了成骨過程[9]。LncRNA SNHG1則被證明可通過Nedd4泛素化調(diào)控p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號通路，抑制BMSCs的成骨分化[10]。

在牙周病研討中，牙周膜干細胞(PDLSCs)是最廣為研究的間充質(zhì)干細胞之一。在該類干細胞的研究中，對LncRNA MEG3的研究廣泛而富有爭議。有研究報道，MEG3過表達促進了磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(Akt)下游蛋白IRS1和p-Akt的表達[11]，并可與異質(zhì)核核糖核蛋白Ⅰ相互影響從而抑制BMP2的表達，降低成骨分化能力。而在Wnt/β-catenin信號通路的研究中，MEG3調(diào)節(jié)Wnt基因啟動子上的H3K27me3水平，以促進PDLSCs成骨分化[12]。既往文獻報道，MEG3還可通過結(jié)合miRNA的方式，如結(jié)合miR-133a-3p、miR-27a-3p參與正調(diào)節(jié)，結(jié)合LY294002參與負調(diào)節(jié)[11-13]。

在針對瓣膜間充質(zhì)細胞(VICs)的研究中發(fā)現(xiàn)，LncRNA OIP5-AS1可以通過上調(diào)miR-137靶基因TWIST1抑制VICs的成骨分化[14]。RUNX2反義鏈LncRNA RUNX2-AS1在小鼠實驗中可被外來體傳遞給骨髓干細胞，在重疊區(qū)域與RUNX2形成RNA雙鏈體，后者通過降低剪接效率抑制轉(zhuǎn)錄，導致鼠間充質(zhì)干細胞成骨潛能降低[15]。而在炎癥環(huán)境下，LncRNA POIR下調(diào)導致循環(huán)中miR-182表達水平的進一步增加，使FoxO1基因抑制Wnt/β-catenin信號通路下游細胞周期蛋白D1的表達，進而抑制成骨分化[1]。

四、LncRNA促進間充質(zhì)干細胞成骨分化

相比抑制成骨分化，既往研究中報道了更多促進成骨分化的LncRNA，它們在不同細胞中調(diào)控成骨分化的作用不盡相同。實驗中我們常利用幾種成骨相關基因確認成骨分化，包括成骨細胞分泌蛋白(OCN)、骨唾液酸蛋白(BSP)和堿性磷酸酶(ALP)的表達等[16]。研究報道在成骨培養(yǎng)時，LncRNA ANCA能調(diào)控上游網(wǎng)絡促進牙周間充質(zhì)干細胞成骨分化、脂肪分化和神經(jīng)分化，可作為miR-758海綿，還可調(diào)節(jié)Notch2表達。Notch2是Notch2-wnt/β-catenin信號通路的關鍵因子。LncRNA ANCA對同期培養(yǎng)的牙髓干細胞、根尖乳頭干細胞幾乎沒有影響[17]。通過miRNA海綿作用調(diào)控的還包括lncPCAT1組成的前反饋網(wǎng)絡，lncPCAT1吸附miR-106a-5p共同調(diào)控BMP2和E2F5的表達，E2F5又可以反過來促進lncPCAT1轉(zhuǎn)錄的方式誘導牙周干細胞成骨分化[18]。其他一些研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)TWIST1、上調(diào)TUG1都可調(diào)節(jié)牙周干細胞的成骨分化，被認為在牙周組織工程和骨再生中應用前景廣闊[19-20]。

炎癥是導致骨疾病的重要誘因之一，通過模擬骨髓炎炎性微環(huán)境后的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)結(jié)果顯示，炎性細胞因子白細胞介素(IL)-1A、IL-6和腫瘤壞死因子分泌增加。茜素紅染色和血清堿性磷酸酶(ALP)檢測結(jié)果表明，炎性微環(huán)境抑制了BMSCs的成骨分化。與正常人對照組相比，總共發(fā)現(xiàn)了2 033個LncRNA異常表達。在這些LncRNA中，641個被下調(diào)，1 392個被上調(diào)[21]。H19是哺乳動物發(fā)育中最豐富和最保守的非編碼轉(zhuǎn)錄本之一，H19在細胞生物學中的重要性及其在控制細胞或組織分化中的潛在作用正在研究中，有學者證明了H19在骨形成蛋白9(BMP9)刺激骨髓干細胞的早期階段急劇上調(diào)，隨后迅速下降并逐漸恢復到基礎水平，該過程與BMP9誘導的成骨表達相關，且能通過Notch信號通路逆轉(zhuǎn)。H19通過調(diào)節(jié)Notch信號通路的miRNA而充當BMP9信號傳導的重要介質(zhì)。Li等[22]在骨質(zhì)疏松的研究中發(fā)現(xiàn)，H19與Dickkopf相關蛋白4(Dkk4)在切除后肢的小鼠中顯著下調(diào)和上調(diào)。實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)結(jié)果顯示，H19表達水平在3和4周分別降低64.5%和68.4%，而Dkk4的表達水平增加117.8%和426.8%，當Dkk4過表達后，Wnt信號通路下游的3個關鍵基因(c-Myc、ZEB1和SNAIL)顯著下調(diào)。提示β-catenin表達的時間依賴性主要發(fā)生在第3周后，H19、Dkk4和Wnt信號通路均對廢用性骨質(zhì)疏松至關重要。H19同樣也有經(jīng)典miRNA海綿吸附作用的報道，H19結(jié)合miR-675不僅下調(diào)Smad3磷酸化以減少組蛋白去乙酰化酶向Runx2靶基因的募集，而且還可抑制組蛋白去乙?；?/5表達。這種作用顯著抑制組蛋白去乙?；傅幕钚?，抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導的內(nèi)源性OCN啟動子組蛋白H4的去乙?；?，從而促進成骨分化[23]。在骨質(zhì)疏松癥患者相關的研究中，LncRNA MALAT1也被提及。骨質(zhì)疏松癥患者BMSCs中MALAT1的表達明顯降低，miR-30、miR-143是MALAT1的潛在結(jié)合分子，敲低MALAT1或過表達miR-30、miR-143會抑制成骨細胞分化[24]。類似地，將人類主動脈瓣膜間質(zhì)細胞成骨誘導后，也可觀察到MALAT1海綿miR-204正向調(diào)節(jié)Smad4表達，促進成骨分化的作用。針對BMSCs的lncRNA研究還涉及DANCR，在BMSCs成骨分化過程中DANCR表達水平顯著降低。通過下調(diào)DANCR，BMSCs中S期細胞數(shù)量、ALP活性水平、成骨標志物基因mRNA的表達和礦化基質(zhì)沉積異常增加。其對于成骨分化的調(diào)節(jié)既不是細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶依賴性也不是應激活化蛋白激酶依賴性的，而是p38MAPK依賴性的[25]。其他如OG、PRNCR1分別通過人異質(zhì)核核糖核蛋白K促進啟動子H3K27的乙?；瘉砑せ罟切螒B(tài)發(fā)生蛋白信號通路(BMP信號通路)和抑制miR-211-5p正向調(diào)節(jié)CXCR4的方式，上調(diào)和下調(diào)骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化[26]。除了成骨分化，LncRNA也與肌生成、脂肪生成相關[4]，LncRNA KCNQ1OT1通過激活Wnt/β-catenin信號通路和對miR-214海綿樣作用促進鼠間充質(zhì)干細胞(MMSCs)成骨分化[27]。LncRNA TCONS_0004196與miR-204-5p和miR-125a-3p結(jié)合增加MMSCs的成骨分化能力，并減弱其脂肪分化。

對于同樣分化潛能巨大的LncRNA ADSCs，可通過PCAT1的海綿樣作用，吸附miR-145-5p參與的TLR信號通路、HIF1A-AS2與miR-665相互作用導致IL-6增加并激活PI3K/Akt信號通路等方式促進ADSCs成骨分化[23-28]。

五、LncRNA調(diào)控間充質(zhì)干細胞成骨分化相關信號通路

成骨細胞分化受多種基因和信號通路調(diào)節(jié)。TGF-β/BMP信號通路是依賴于一系列Smad蛋白參與調(diào)控成骨分化，包括受體調(diào)節(jié)的Smads(R-Smads)、共同伴侶Smads(Co-Smads)和抑制性Smads(I-Smads)。通過BMP-2/Smad/Runx2信號通路激活增強人骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨細胞分化[26]，當成骨信號轉(zhuǎn)導到骨髓干細胞的細胞質(zhì)中時，Smad5被磷酸化，然后被導入細胞核，誘導、抑制間充質(zhì)多能細胞和前成骨細胞的成骨細胞分化[29]。在此過程中，Smad5核轉(zhuǎn)位對成骨信號轉(zhuǎn)導至關重要。

Wnt/β-catenin信號通路在人類的成骨分化中起重要的調(diào)節(jié)作用，是骨折治療的最常見靶點之一。Wnt/β-catenin信號通路在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)成骨細胞相關基因WNT2B蛋白、RUNX2和成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(OSX)等的表達。OSX作為RUNX2的下游靶基因，在成骨細胞分化中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。調(diào)節(jié)RUNX2的表達后，可促進OSX基因和蛋白的表達水平均升高。Wnt2B可抑制ALP的表達，調(diào)節(jié)成骨的關鍵基因如RUNX2和OSX的表達，從而調(diào)節(jié)骨形成過程。

MAPK信號通路包括JNK、ERK1/2和p38途徑，已經(jīng)成為細胞生理學的主要調(diào)控因子，是成骨分化關鍵的觸發(fā)因素[25]。特別是p38途徑，通過活化MAPK促進蛋白激酶2(MK2)磷酸化，從而抑制MK2造成骨質(zhì)流失[30]。

雖然TLR信號通路對脂肪干細胞成骨分化方面的研究有限，但一些證據(jù)提示TLR4參與骨骼系統(tǒng)的多個生物過程。據(jù)報道，TLR信號通路可通過骨鈣蛋白將動脈成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞。在骨相關感染性疾病中，TLR2和TLR4與成骨細胞中人β-防御素-3的產(chǎn)生增加有關。另有研究報道，過表達熱休克蛋白60(HSP60)可使TLR4表達上調(diào)，在骨丟失中扮演關鍵作用。在后續(xù)研究中，沉默TLR4幾乎可消除HSP60介導的骨間充質(zhì)干細胞凋亡。

此外，如NOTCH1可以通過改變HES1、HEY1、RUNX2、BMP2、Sox9的表達促進骨化，對骨穩(wěn)態(tài)具有關鍵調(diào)控作用[31]。胰島素樣生長因子1(IGF-1)也可通過ERK和JNK MAPK途徑促進骨生成。PI3K/Akt信號通路對骨生成和軟骨內(nèi)骨化也非常重要，有研究報道其通過RUNX2、BMP誘導成骨表達。動物實驗也證實，阻斷PI3K/Akt信號通路會對骨化造成負面影響[32]。

六、間充質(zhì)干細胞與疾病

目前的研究集中于發(fā)現(xiàn)疾病狀態(tài)下具有差異表達的LncRNA。如強直性脊柱炎患者的間充質(zhì)干細胞的成骨分化能力顯著高于健康人，這種差異被認為是強直性脊柱炎病理性骨生成可能的基礎機制之一。相關研究報道了強直性脊柱炎患者與健康人之間存在差異表達的LncRNA和mRNA，二者被認為參與調(diào)控間充質(zhì)干細胞的成骨分化。膝關節(jié)骨性關節(jié)炎患者的軟骨間充質(zhì)干細胞也發(fā)現(xiàn)類似的成骨能力差異。此外，牙髓間充質(zhì)干細胞在炎癥環(huán)境下會失去成骨分化的潛能，且細胞傳代9次后仍可觀察到該現(xiàn)象。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA可改善炎癥環(huán)境中被抑制的細胞的成骨分化能力[21]。最新研究表明，脂肪干細胞可以替代骨髓間充質(zhì)干細胞作為骨再生的細胞來源，在骨質(zhì)疏松中脂肪源干細胞擁有更穩(wěn)定的成骨分化周期[28]。

健康人成骨分化的促進與抑制保持相對平衡，隨著更多相關的LncRNA被發(fā)現(xiàn)，為骨腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤、骨關節(jié)術后的骨溶解、心臟瓣膜鈣化等疾病的預后和治療方式找到了新的方向。但LncRNA結(jié)合miRNA、結(jié)合蛋白、介導各個信號通路在間充質(zhì)干細胞成骨分化中的分子機制仍有待確定。對于間充質(zhì)干細胞而言，盡管不同來源的間充質(zhì)干細胞均具有成骨分化潛能，但終究存在各自來源組織的特點，這種差異可能與不同組織的基因、細胞因子、表面受體有關，那么不同來源的間充質(zhì)干細胞在LncRNA的調(diào)控下，應用于同種疾病時是否可以彌補這種差異需要進一步研究。

七、總結(jié)與展望

有效避免強直性脊柱炎導致的異位骨化和新骨形成是臨床亟待解決的問題，結(jié)構損傷嚴重影響患者的組織功能、身心健康及生存質(zhì)量。近年來，lncRNA對擁有多向分化潛能的間充質(zhì)干細胞成骨分化的調(diào)控作用已成為研究的熱點，進一步深入研究強直性脊柱炎疾病相關的lncRNA及其分子調(diào)控機制，為理解強直性脊柱炎的發(fā)病機制和開發(fā)潛在的生物學標志物提供了新思路。