植物人工種子技術(shù)研究進展

胡文斌，張少飛，楊文，孫娜

（隴南師范高等?？茖W(xué)校，甘肅成縣 742500）

人工種子是指將植物離體培養(yǎng)產(chǎn)生的胚狀體或能發(fā)育成完整植株的分生組織，用含有營養(yǎng)物質(zhì)的胚乳和具有保護功能的種皮包埋而形成的顆粒體。人工種子技術(shù)是建立在組織培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)上，利用化學(xué)材料對胚狀體進行包埋等方法而建立起來的技術(shù)，具有容易制備、育種周期短、成本低、可直接播種等優(yōu)點，有望代替組織培養(yǎng)技術(shù)成為瀕危植物、經(jīng)濟作物繁殖和優(yōu)良品種選育的新技術(shù)。筆者對人工種子技術(shù)近幾年來的研究進行綜述，以期為人工種子制作工藝及技術(shù)的優(yōu)化提供參考。

1 人工種子材料的選擇

人工種子在研究過程中，一般將植物分成2 種類型：一類是具有一定研究基礎(chǔ)的植物，這類植物結(jié)構(gòu)簡單、生長周期短、特征明顯，很容易與其他植物區(qū)分開來，同時已建立好體細胞胚胎發(fā)生系統(tǒng)，稱為模式植物，如胡蘿卜、苜蓿、芹菜、花椰菜、萵苣等[1]；另一類是一些經(jīng)濟作物或者中藥材，如蕙蘭、鐵皮石斛、半夏、三七、馬鈴薯、小麥、玉米、青天葵等[2-4]。目前為止，研究人員已經(jīng)對多種類型的植物進行了人工種子研究，研究范圍已經(jīng)從過去的模式植物轉(zhuǎn)向經(jīng)濟作物、觀賞植物、中藥材、瀕危植物等各種類型，并呈一定的上漲趨勢。

2 體細胞胚的同步化調(diào)控

體細胞胚的同步化是利用一定的方法將體細胞胚的分化程度控制在某一生長階段，最終得到大小相同、形態(tài)及分化程度相近的胚狀體。如果體細胞胚的成熟度不同，所形成的人工種子萌發(fā)速度也會有差異，這樣就不便于管理，只有獲得大量同步化的體細胞胚，避免人工種子在包埋時再根據(jù)胚的大小、成熟度等來篩選體細胞胚等繁瑣的過程，才能節(jié)約大量人力、物力和財力，有效提高生產(chǎn)效率，為實現(xiàn)工廠化的生產(chǎn)目標奠定基礎(chǔ)。

因此，體細胞胚的同步化是人工種子實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)的前提，目前，常用的體細胞胚同步化方法主要有物理方法和化學(xué)方法2 種，其中物理方法主要有過篩分級分選、密度梯度離心、低溫培養(yǎng)、滲透壓調(diào)節(jié)等，化學(xué)方法主要有饑餓法、抑制劑法、外源激素調(diào)控等[5]。

3 人工種子的包埋基質(zhì)

3.1 人工胚乳

人工胚乳是介于人工種皮和胚狀體之間，為胚狀體提供礦質(zhì)元素、維生素以及激素等營養(yǎng)物質(zhì)的成分，是胚狀體萌發(fā)生長的營養(yǎng)來源。人工胚乳所含的物質(zhì)是體細胞胚萌發(fā)的培養(yǎng)基成分，主要有MS 培養(yǎng)基、B5 培養(yǎng)基、N6 培養(yǎng)基和SH 培養(yǎng)基等[6]。同時，人工胚乳中還需添加一定的碳源，如蔗糖、果糖、麥芽糖和淀粉等，主要起維持胚乳內(nèi)外的滲透壓以及給胚狀體提供營養(yǎng)的作用。

目前，適宜作為人工胚乳基質(zhì)的材料有海藻酸鈉、果膠酸鈉、瓊脂、明膠、樹膠等[6]，這些材料各有優(yōu)勢，目前常用的是海藻酸鈉，因其具有通透性好、無毒、具有生物相容性及價格低廉等優(yōu)點，至今仍是人工胚乳基質(zhì)的首選，但它也存在很多問題，如易黏連、易滲漏、易失水、吸水回漲性差、機械強度差等，為了克服這些困難，研究人員嘗試用復(fù)合材料來制備人工胚乳，比如在人工胚乳中添加殼聚糖、活性炭、木薯淀粉、保水劑等[7-9]。同時，培養(yǎng)基成分由于含有營養(yǎng)物質(zhì)而易污染，因此，人工胚乳中常通過添加防腐劑、抗生素及農(nóng)藥等的方式來提高其防腐性能，也是人工種子實現(xiàn)長時間貯藏以及田間播種的關(guān)鍵技術(shù)之一[10-11]。

3.2 人工種皮

人工種皮分內(nèi)種皮和外種皮2 種，內(nèi)種皮也就是人工胚乳，外種皮是能保持人工胚乳中的水分和營養(yǎng)物質(zhì)，同時具有一定強度以防止外來機械破壞并具一定的透氣性成分。目前，內(nèi)種皮的研制還依賴于無菌條件，僅有內(nèi)種皮包埋的人工種子機械強度差、易污染等，不利于機械化播種。

人工種子要想同自然種子一樣貯藏、包裝及運輸，還需要附加人工外種皮來增強其保水性及機械強度等。外種皮不但可以提高人工種子的保水性、防止內(nèi)種皮中的營養(yǎng)外滲，還可以降低土壤中微生物、溫度及pH 等環(huán)境因素對種胚萌發(fā)率、成苗率的影響。同時也便于人工種子的貯藏、運輸及播種，外種皮目前最常用的制備方法仍然是通過在海藻酸鈉中添加多糖（如殼聚糖）。黃和平等[12]研究發(fā)現(xiàn)當種皮基質(zhì)為4%海藻酸鈉+2% CaCl2+2%殼聚糖時，四倍體盾葉薯蕷人工種子的萌發(fā)率和成苗率最高。李偉平等[13]以白及種子為材料，研究發(fā)現(xiàn)以4.0%海藻酸鈉+0.2 mol/L CaCl2+0.4 mg/L 青霉素+0.3%多菌靈+0.2%苯甲酸鈉為人工種皮基質(zhì)，其成苗率最高，可以在有菌基質(zhì)中生長。胡根海等[14]以陸地棉營養(yǎng)芽為材料，發(fā)現(xiàn)人工種皮基質(zhì)為4%海藻酸鈉+1%甲基纖維素+1.0%苯甲酸鈉+0.02～0.04 mg/L 青霉素+0.5 mg/L 多效唑時，人工種子的萌發(fā)率達到了95%。

4 人工種子的包埋方法

人工種子的包埋方式目前主要有機械包埋和手工包埋2 種，機械包埋主要是利用人工種子包埋機進行包埋，但是還有許多方面需要改進，不能完全代替手工包埋。包埋方法主要有液膠包埋法、干燥法和離子交換法3 種[15]。液膠包埋法是將體細胞胚混合到溫度較高的膠液中，然后將容有胚狀體的膠液滴注到有小坑的模板上，待溫度下降即可形成膠丸狀的人工種子。干燥法是指利用聚氧乙烯等高聚物對胚狀體進行包埋，干燥后休眠的人工種子可以長時間保存，人工種子需要長時間貯藏時可用這種方法。離子交換法是指通過離子交換的方法使外種皮固化后形成一個堅硬的外殼，將繁殖體包埋起來，最終形成一個具有一定機械強度的凝膠顆粒，目前，最常用的方法是將胚狀體用海藻酸鈉包埋后，再轉(zhuǎn)到CaCl2溶液中與Ca2+發(fā)生離子交換，最后形成球狀膠囊。

5 人工種子的貯藏

由于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有一定的季節(jié)性，因此，獲得的人工種子不一定能及時播種于大田，人工種子胚乳含有豐富的營養(yǎng)，這就有可能導(dǎo)致其在貯藏過程中出現(xiàn)萌發(fā)的現(xiàn)象，同時人工種子含水量也比較高，失水后容易皺縮，因此，人工種子的貯藏是亟待解決的一個難題。想要解決這個問題則要從多方面著手，如包埋基質(zhì)的完善、呼吸作用抑制失水后吸水回脹的研究等，目前人工種子貯藏方法主要有干燥法、低溫法、抑制劑法、超低溫保存法及多種方法組合等[16]。干燥法是通過脫水使胚狀體生長停止，從而人工種子進入休眠而達到貯藏的目的。低溫法一般將人工種子保存于4℃條件下，利用低溫環(huán)境來抑制人工種子的新陳代謝，從而達到長期保存的目的，但是低溫保存人工種子則需要耗費大量的人力、物力和財力。抑制劑法是在人工胚乳中添加適當?shù)拿撀渌岬却龠M其休眠而達到貯藏的目的。液體石蠟法是在人工種子包埋后通過涂抹或者浸入液體石蠟的方式來抑制其呼吸作用，從而達到長期保存的目的。超低溫保存法是利用超低溫冰箱或者液氮對人工種子進行保存的方法，在超低溫條件下，人工種子的新陳代謝或者生命活動幾乎完全停止，在適當條件下進行解凍即可播種于大田。

6 人工種子的防腐

由于人工胚乳中含有糖類等營養(yǎng)物質(zhì)，這些營養(yǎng)物質(zhì)容易受到細菌、真菌等的污染，進而影響其貯藏效果、人工種子的萌發(fā)率，以及企業(yè)的生產(chǎn)效率。因此，只有做好人工種子的防腐工作，才能延長其貯藏時間，提高其萌發(fā)率和企業(yè)的生產(chǎn)效率。而目前的防腐措施主要是給人工胚乳中添加抗生素、農(nóng)藥、防腐劑等來提高人工種子的防腐效果，如青霉素[4，13-14]、多效唑[14]、多菌靈[10]、苯甲酸鈉[14]等。

同時有些植物材料在培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分裂分化過程中，會向培養(yǎng)基釋放褐色類物質(zhì)，從而導(dǎo)致褐變的發(fā)生，能夠發(fā)生褐變的外植體有很多，如鐵皮石斛[16]、核桃[17]、牡丹[18]等，因此，在人工種子制作過程中，可以在人工胚乳中添加PVP、硫代硫酸鈉、活性炭、硝酸銀等來減少褐變的發(fā)生。

7 討論及展望

目前人工種子的研究仍然處于試驗階段，還有許多問題需要解決。人工種胚基本上都是通過組織培養(yǎng)獲得，與天然種子相比，在生理生化方面還有著很大差別，人工種胚體內(nèi)蛋白質(zhì)含量較低，同時在抗性、休眠及生長發(fā)育等方面還與天然種子差距較大；同時，體細胞胚的同步化研究措施存在操作復(fù)雜、易污染、周期長且同步化效率不高等問題；人工胚乳和人工種皮材料與天然種子也存在很大差距，保水性較差，機械強度不夠等，同時胚乳的成分也有待于進一步優(yōu)化，這就縮短了人工種子的貯藏時間；人工種子對播種條件的要求也較高，如果防腐工作不到位就會嚴重影響其萌發(fā)率和成苗率；人工種子的生產(chǎn)仍然以人工為主，機械化及自動化程度不高[2，15，19]。

人工種子是在組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的一種新的育種方式，具有廣闊的應(yīng)用前景，但離大規(guī)模的推廣應(yīng)用還有很長的路要走。但是隨著對人工種子技術(shù)研究的深入以及制作工藝的優(yōu)化，人工種子的制作成本將會進一步下降，貯藏時間將會進一步延長，種胚的萌發(fā)率和成苗率也會進一步提高，人工種子極有可能成為瀕危植物保護、經(jīng)濟作物育種及珍稀中藥材繁殖的主要方式。相信在不久的將來，人工種子與天然種子相比也將具有獨特的競爭優(yōu)勢，人工種子將展現(xiàn)出巨大的競爭優(yōu)勢和廣闊的應(yīng)用前景。