干細(xì)胞移植治療血栓閉塞性脈管炎的研究進(jìn)展

周 密 谷涌泉

首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院血管外科/首都醫(yī)科大學(xué)血管外科研究所/首都醫(yī)科大學(xué)血管外科學(xué)系，北京 100053

血栓閉塞脈管炎（thromboangiitis obliterans，TAO）也稱為Buerger’s病，是一種以手和腳的中小動(dòng)脈和靜脈反復(fù)進(jìn)行性炎性反應(yīng)和血栓為特征的非動(dòng)脈粥樣硬化的節(jié)段性、炎性動(dòng)脈狹窄或閉塞疾病。TAO發(fā)病原因尚不清楚，在有吸煙史的男性中最常見，TAO的截肢率和致殘率極高[1]。但研究表明，TAO的發(fā)展與吸煙、營養(yǎng)失調(diào)、自身免疫、內(nèi)皮細(xì)胞活化等有關(guān)，目前主要治療方法包括鼓勵(lì)戒煙、避免被動(dòng)吸煙、藥物治療、運(yùn)動(dòng)療法、常規(guī)血運(yùn)重建、患肢保暖、交感神經(jīng)切除術(shù)和疼痛控制[2]。但在嚴(yán)重的缺血性潰瘍和靜息痛患者中，積極的手術(shù)治療并不能延緩患者的病情進(jìn)展及改善預(yù)后，因此，可以嘗試使用其他治療方法。干細(xì)胞療法是通過注射細(xì)胞而進(jìn)行的試驗(yàn)性療法，這些細(xì)胞能夠形成新生血管，改善局部循環(huán)并有助于潰瘍的愈合，緩解靜息痛[3-7]。成體干細(xì)胞的細(xì)胞來源主要包括骨髓干細(xì)胞、外周血干細(xì)胞（peripheral blood stem cell，PBSC）等，其中骨髓干細(xì)胞是目前應(yīng)用最多的細(xì)胞來源；用于治療缺血患肢細(xì)胞移植的細(xì)胞主要有間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC），內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cell，EPC）等，但部分無法耐受取骨髓手術(shù)的患者可以經(jīng)細(xì)胞動(dòng)員后從外周血中獲取干細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞移植。本文從干細(xì)胞移植治療TAO的機(jī)制和臨床常用的骨髓干細(xì)胞移植、PBSC移植、脂肪組織間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose tissue-derived mesenchymal stem cell，ATMSC）移植和標(biāo)記干細(xì)胞移植等方面綜述干細(xì)胞移植治療TAO的有效性和安全性的進(jìn)展。

1 干細(xì)胞治療TAO的機(jī)制

干細(xì)胞移植后可以通過多種分子生物學(xué)機(jī)制改善組織修復(fù)和促進(jìn)血管新生。Mathiyalagan等[8]研究發(fā)現(xiàn)，向小鼠缺血后肢注射人CD34+細(xì)胞來源的干細(xì)胞外泌體可通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞攝取微小核糖核酸-126-3p（microRNA-126-3p，miRNA-126-3p）來抑制SPRED-1基因表達(dá)，同時(shí)上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子、血管生成素1、血管生成素2和基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)，從而改善肢體灌注。源自內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞（endothelial colony forming cell，ECFC）的細(xì)胞外囊泡可以通過與α4和β1整合素的相互作用整合到內(nèi)皮細(xì)胞中，并通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮型一氧化氮合成酶的產(chǎn)生和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B途徑相關(guān)的信使RNA（messenger RNA，mRNA）的轉(zhuǎn)運(yùn)來刺激血管生成。同樣，MSC來源的外泌體可以通過調(diào)控血小板源性生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、表皮細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、Wnt通路及核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）蛋白的轉(zhuǎn)移來調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能[9]，還可以通過下調(diào)微小核糖核酸-31（microRNA-31，miRNA-31）來抑制缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1）的作用[10]，從而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的功能，MSC可以通過旁分泌途徑分泌大量生長因子和細(xì)胞因子，這些因子可以促進(jìn)新血管的形成和受損組織的重塑。除此之外，干細(xì)胞移植還可以通過定向分化為EPC促進(jìn)新生血管形成及分泌生長因子等調(diào)節(jié)血管新生，具體的分子機(jī)制復(fù)雜，需要進(jìn)一步深入探究。

2 骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植

骨髓單個(gè)核細(xì)胞（bone marrow mononuclear cell，BMMNC）包括造血祖細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞、單核細(xì)胞、EPC和非造血譜系細(xì)胞。這些細(xì)胞被大量細(xì)胞因子和生長因子募集到受損組織中，引發(fā)抗炎作用并減少纖維化，從而防止細(xì)胞凋亡。在局部缺血的肢體模型中，自體BM-MNC的局部注射可增強(qiáng)血管生成和側(cè)支血管形成[11]。通過直接注射BM-MNC可以通過分泌血管生成生長因子和細(xì)胞因子來增加毛細(xì)血管水平的新生血管形成，同時(shí)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生旁分泌作用，從而改善了缺血組織的血液供應(yīng)。而缺血性組織無法募集修復(fù)所需的細(xì)胞，當(dāng)注射BM-MNC后，隨著側(cè)支成熟和穩(wěn)定，缺血組織的血供得到改善，從而促進(jìn)潰瘍和截肢傷口的愈合。Tateishi-yuyama等[5]報(bào)道重癥肢體缺血（critical limb ischemia，CLI）患者的干細(xì)胞療法顯示，肌內(nèi)注射BM-MNC的細(xì)胞療法可延長無截肢間隔時(shí)間，并改善缺血性患肢疼痛、潰瘍大小和無痛步行距離，表明注射BM-MNC是治療CLI的一種安全有效的方法。Idei等[3]比較BM-MNC注射治療外周缺血性疾?。╬eripheral arterial disease，PAD）患者和TAO患者的療效，發(fā)現(xiàn)BM-MNC移植后4年無截肢率在PAD患者中為48%，在TAO患者中為95%。Matoba等[4]研究也有相似的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)接受BM-MNC注射的TAO患者有更高的無截肢生存率，同時(shí)在TAO診斷后長達(dá)10年的隨訪中沒有大截肢，證明干細(xì)胞療法的安全性和有效性不低于傳統(tǒng)的血管重建療法，而且TAO患者的干細(xì)胞療法比PAD患者更有效。Kondo等[7]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于CLI的患者，采用自體BM-MNC注射是可行且安全的，特別是對(duì)于由TAO或膠原病相關(guān)血管炎引起的CLI患者。Guo等[12]研究總結(jié)了TAO患者長達(dá)10年的隨訪結(jié)果，BM-MNC注射的患者10年無截肢生存率為85.3%，而單獨(dú)口服阿司匹林的患者10年無截肢生存率為40%，注射BM-MNC后患肢的潰瘍面積、趾肱指數(shù)、經(jīng)皮氧分壓（transcutaneous pressure of oxygen，TcPCO2）和疼痛評(píng)分也有明顯改善，但接受BM-MNC注射治療的患者和僅接受阿司匹林的患者之間的踝肱指數(shù)（ankle brachial index，ABI）沒有顯著差異。因此，BM-MNC注射治療可以作為難治性TAO的患者安全、有效的替代治療方案。

3 全骨髓細(xì)胞移植

既往研究顯示，治療性血管生成多使用BM-MNC或外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PB-MNC）作為干細(xì)胞治療的介質(zhì)。然而，從整個(gè)骨髓細(xì)胞或外周血細(xì)胞中分離PB-MNC非常復(fù)雜且價(jià)格昂貴，并且容易受到污染，而全骨髓細(xì)胞（whole bone marrow stem cell，WB-MSC）中的許多細(xì)胞因子也可以通過細(xì)胞移植發(fā)揮有效促進(jìn)新生血管的作用。Franz等[13]研究了肌內(nèi)注射自體WB-MSC治療有癥狀的TAO患者臨床效果，結(jié)果顯示55.6%患者達(dá)到臨床改善，43.2%患者經(jīng)血管造影結(jié)果評(píng)估得到明顯改善。WB-MSC移植治療后1、3和5年無截肢率分別為91.9%、88.5%和84.6%。Lenk等[14]研究也評(píng)價(jià)了WB-MSC在TAO中的CLI患者中的臨床應(yīng)用效果，在隨訪6個(gè)月時(shí)，患者在盧瑟福分級(jí)、疼痛評(píng)分、平均無痛行走時(shí)間和趾肱指數(shù)方面表現(xiàn)出顯著改善，與基線相比，ABI雖然增加，但無顯著性差異，76.5%的缺血性潰瘍表現(xiàn)出了完全或改善的愈合。因此，WB-MSC是一種安全有效的TAO替代或輔助治療方式，可改善CLI患者的臨床結(jié)局。

4 PBSC移植

既往研究表明，EPC可以從成人、小鼠和兔子的外周血中分離出來，而粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）可以增強(qiáng)骨髓細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化，也可以動(dòng)員外周血中CD34+、CD133+和KDR+細(xì)胞，并具有分化為EPC的能力，同時(shí)也可以動(dòng)員EPC進(jìn)入外周血，從而進(jìn)一步在病理和非病理?xiàng)l件下整合到新生血管中。與BM-MNC移植相比，PBSC移植無需全身麻醉，可重復(fù)采集，患者更易接受。Miyamoto等[15]研究通過主要觀察指標(biāo)（受累肢體的疼痛和冷感）及次要觀察指標(biāo)（跛行距離、ABI、TcPCO2和皮膚溫度）來評(píng)估PBSC移植治療TAO的臨床效果，細(xì)胞移植后4周，患肢的疼痛和冷感均有不同程度的改善，疼痛評(píng)分和冷感評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)跛行距離、ABI、TcPCO2和皮膚溫度也得到顯著改善。CD34+干細(xì)胞含有EPC，可以分化為缺血組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而促進(jìn)血管生成[4,16-17]。純化的CD34+細(xì)胞移植（purified CD34+cell transplantation，PuCeT）在治療CLI中已顯示出良好的短期效果，Heo等[18]研究評(píng)估了PuCeT治療血管炎性CLI患者的臨床療效，移植后5年，無大截肢生存率為88.89%，平均無痛行走時(shí)間增加，潰瘍愈合率為85.71%，復(fù)發(fā)率為11.11%，恢復(fù)勞動(dòng)能力率為65.38%，在治療過程中未觀察到嚴(yán)重的不良反應(yīng)。Wan等[19]進(jìn)行的一項(xiàng)回顧性隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)外周血來源的純化CD34+細(xì)胞（peripheral blood-derived purified CD34+cell，PCC）移植治療效果與未純化的PBSC類似，PBSC移植后，傷口愈合率、靜息痛、無痛行走時(shí)間、ABI、TcPCO2和生活質(zhì)量得到顯著改善。因此，無論是PCC還是PBSC，外周血來源的干細(xì)胞移植對(duì)于TAO的療效是準(zhǔn)確且持久的。

5 ATMSC移植

MSC具有多種功能，可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，MSC移植在下肢缺血模型中可以誘導(dǎo)新生血管形成。脂肪組織在人體中豐富并可持續(xù)生成，因此，脂肪組織可以作為MSC的理想組織來源。研究表明，ATMSC具有與骨髓基質(zhì)細(xì)胞來源的MSC相似生物學(xué)特性[20]。Yamamoto等[21]臨床研究顯示，ATMSC移植6個(gè)月后，Wong-Baker面部表情評(píng)分得到了顯著性改善，同時(shí)明顯增加了患者跛行距離并促進(jìn)傷口的愈合，但沒有改善患者的最大步行距離和ABI，考慮原因?yàn)锳TMSC移植后形成許多小側(cè)支動(dòng)脈，從而增加遠(yuǎn)端肢體血供；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ATMSC在裸鼠后肢局部缺血模型中可促血管生成，主要是由ATMSC衍生的旁分泌因子發(fā)揮作用，包括血管生成和抗凋亡因子。因此，多次肌內(nèi)ATMSC注射是在其他治療方式難以起效的TAO患者中實(shí)現(xiàn)治療性血管生成的安全替代方案。

6 標(biāo)記干細(xì)胞移植

多項(xiàng)研究表明，更均質(zhì)、純化標(biāo)記干細(xì)胞移植可以增加“活性”細(xì)胞比例，從而改善缺血肢體的灌注。Fang等[22]使用PCC移植治療CLI，截肢率更低。醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）是干細(xì)胞中保守的一種氧化酶，有研究發(fā)現(xiàn)與低ALDH活性的人來源BMMNC相比，靜脈輸注高ALDH活性的人來源BM-MNC后，小鼠的缺血性肢體灌注明顯改善，毛細(xì)血管密度明顯增加。流式細(xì)胞學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，高ALDH活性的人來源BM-MNC所 包 含 的CD34+、CD133+、CD14+和CD117+（c-kit+）細(xì)胞比例更高[23]。也有研究發(fā)現(xiàn)接受高劑量的CD34+的PBSC移植治療缺血性肢體，截肢率明顯降低，而CD34+低劑量組截肢率為43%，安慰劑組截肢率達(dá)75%，截肢率降低與CD34+的PBSC的數(shù)量相關(guān)[24-25]。RESTORECLI試驗(yàn)移植了自體“組織修復(fù)細(xì)胞”，該細(xì)胞由擴(kuò)增的CD90+MSC和CD14+細(xì)胞組成，肌內(nèi)注射后1年無截肢生存率增加[26]，因此純化標(biāo)記干細(xì)胞移植可能是治療TAO更好的選擇。

7 其他類型的干細(xì)胞移植

與其他來源的干細(xì)胞相比，人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cell，UC-MSC）免疫原性低，易于體外擴(kuò)增，Szoke等[27]研究發(fā)現(xiàn)，UC-MSC移植后24 h，血清腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素-6水平顯著升高，表明UC-MSC具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)特性，可以促進(jìn)傷口的愈合。Gupta等[28]研究證明UC-MSC移植是治療動(dòng)脈硬化及TAO導(dǎo)致的CLI有效治療手段。Powell等[29]研究發(fā)現(xiàn)，給予TAO患者注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stromal cell，BM-MSC）可以明顯減輕靜息痛，促進(jìn)潰瘍愈合，提高ABI及步行距離，顯示出良好的TAO治療效果。不同細(xì)胞類型的干細(xì)胞移植治療TAO的臨床效果較好，基因修飾的干細(xì)胞移植可能是將來干細(xì)胞精準(zhǔn)治療的方向。

8 移植適應(yīng)證和移植方法的選擇

患有動(dòng)脈粥樣硬化的CLI患者與患有TAO的CLI患者相比，其骨髓細(xì)胞表現(xiàn)出功能受損和EPC數(shù)量減少。因此，自體干細(xì)胞療法對(duì)患有TAO的CLI患者更有效。但是干細(xì)胞移植療法的效果與缺血程度有關(guān)，Gao等[30]的研究證明，與盧瑟福分級(jí)為4～5級(jí)患者相比，盧瑟福分級(jí)為6級(jí)患者對(duì)干細(xì)胞療法無反應(yīng)。自體干細(xì)胞移植可能在下肢缺血性疾病的早期階段更有效，如在間歇性跛行的患者中療效更佳[31]。因此，對(duì)于無條件進(jìn)行血運(yùn)重建或血運(yùn)重建失敗的TAO患者，盡早進(jìn)行干細(xì)胞移植能夠使患者能夠獲得更好的預(yù)后。在干細(xì)胞移植方法的選擇上主要有經(jīng)動(dòng)脈給藥和肌內(nèi)注射。相關(guān)研究證實(shí)，肌內(nèi)注射后干細(xì)胞的存活率和滯留性較差，無法整合到移植患者的血管組織中[31]，PROVASA試驗(yàn)研究了動(dòng)脈內(nèi)注射BM-MNC治療缺血性肢體的效果，證實(shí)可以顯著緩解靜息痛，潰瘍的愈合同BM-MNC注射的劑量呈正相關(guān)，但是同安慰劑相比，并沒有降低截肢率，因此將經(jīng)動(dòng)脈給藥和肌內(nèi)注射結(jié)合可能是更好的給藥方式，有助于降低截肢率[32]。

9 生物安全性

干細(xì)胞作為一種具有高度復(fù)制和分化潛能的細(xì)胞，移植后的致癌風(fēng)險(xiǎn)及免疫和遺傳方面的穩(wěn)定性是需要著重考慮的問題，特別是干細(xì)胞移植后細(xì)胞增殖的調(diào)控仍然是亟需解決的問題，防止干細(xì)胞癌變?nèi)匀皇潜ＷC患者移植安全性的首要問題，既往研究顯示干細(xì)胞的致癌性是由其自身特性和培養(yǎng)環(huán)境決定的，雖然干細(xì)胞移植治療血栓閉塞性脈管炎的研究中尚無細(xì)胞癌變的相關(guān)報(bào)道，但是其致癌風(fēng)險(xiǎn)仍不能忽視，需要國內(nèi)外相關(guān)部門對(duì)干細(xì)胞移植的整個(gè)流程制定統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和完整的體系，從而規(guī)范干細(xì)胞的制備和移植，保證干細(xì)胞移植的生物安全性。另外，PBSC移植在G-CSF動(dòng)員后，會(huì)有大量的BM-MNC入血，同時(shí)促進(jìn)血小板的聚集活化，不僅顯著增加了血液黏度，同時(shí)也提高了血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)，需要輔助以規(guī)范的抗凝治療，目前干細(xì)胞移植治療TAO的相關(guān)研究均無嚴(yán)重不良事件發(fā)生[12,14-15,18,32-34]，是安全且具有光明前景的治療手段。

綜上所述，干細(xì)胞治療TAO具有良好的有效性和安全性。各種干細(xì)胞來源的移植治療TAO均可以促進(jìn)缺血患肢的毛細(xì)血管新生，增加側(cè)支循環(huán)的建立，改善患肢微循環(huán)，增加缺血組織灌注，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，降低截肢率，改善患者生活質(zhì)量。需要權(quán)衡患者的身體條件、病變特點(diǎn)、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)等因素綜合考慮，制定個(gè)體化的干細(xì)胞移植方案，從而提高干細(xì)胞療法治療TAO臨床療效。