家蠶分子標(biāo)記輔助育種相關(guān)基因研究進(jìn)展

楊 尚 王佩儀 趙 鵬 袁 穎 呂穎賢 崔自學(xué) 黃永震 朱緒偉*

(1.河南省蠶業(yè)科學(xué)研究院，河南鄭州 450000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；3.河南省農(nóng)學(xué)會(huì)，鄭州 450000)

桑蠶(BombyxmoriL.)又稱家蠶，屬節(jié)肢動(dòng)物門昆蟲綱鱗翅目蠶蛾科蠶蛾屬桑蠶種，是以桑葉為食料的泌絲昆蟲。它起源于中國(guó)，對(duì)世界蠶絲業(yè)的發(fā)展和絲綢文明作出了巨大貢獻(xiàn)。桑蠶是完全變態(tài)昆蟲，生活周期短，一生經(jīng)過卵、幼蟲、蛹、成蟲四個(gè)形態(tài)、生理機(jī)能完全不同的發(fā)育階段。整個(gè)世代只有幼蟲期攝食，并為之后的生命活動(dòng)積貯營(yíng)養(yǎng)。目前，我國(guó)擁有家蠶種質(zhì)資源1 000多份，選用覆蓋所有28個(gè)連鎖群的100個(gè)SSR(Simple Sequence Repeat，SSR)標(biāo)記構(gòu)建了510個(gè)家蠶品種資源的指紋圖譜，實(shí)現(xiàn)了從分子水平能夠?qū)Ω黝惣倚Q品種進(jìn)行鑒別，并可根據(jù)品種指紋圖譜，分析品種間的分子遺傳距離及親緣關(guān)系。分子標(biāo)記是用于遺傳育種的重要工具，是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，直接反映DNA水平遺傳多態(tài)性。RFLP(restriction fragment length polymorphism)、RAPD(random amplification of polymorphic DNA)、AFLP(amplified fragment length polymorphisms)、SSR(simple sequence repeats)和SNP(single nucleotide polymorphism)等分子標(biāo)記陸續(xù)被應(yīng)用到家蠶遺傳育種中[1]，這一系列分子標(biāo)記和家蠶基因組學(xué)信息為家蠶遺傳育種如何突破傳統(tǒng)資源利用的極限提供了新的思路和靶標(biāo)。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，部分靶標(biāo)已經(jīng)被成功應(yīng)用至家蠶遺傳育種工作中，在產(chǎn)量、質(zhì)量、抗性等方面累積了大量的轉(zhuǎn)基因素材，也開拓了生物反應(yīng)器、害蟲防控等新的應(yīng)用領(lǐng)域。

1 家蠶分子標(biāo)記輔助育種相關(guān)基因

1.1 生長(zhǎng)發(fā)育方面

昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育過程受蛻皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)和保幼激素(juvenile hormone，JH)的協(xié)同作用，20E具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，可刺激細(xì)胞分裂，可以使昆蟲生長(zhǎng)出新的表皮；JH是可保持昆蟲幼蟲性狀和促進(jìn)成蟲卵巢發(fā)育的激素。Liu等[2]研究了20E在家蠶中的表達(dá)及其調(diào)控途徑，發(fā)現(xiàn)20E通過在家蠶表皮不同區(qū)域的同源結(jié)構(gòu)域蛋白POU-M2、antennapedia(Antp)和abdominal-B(Abd-B)正向調(diào)控Clip-domain serine protease 13(CLIP13)的轉(zhuǎn)錄，從而影響蛻皮過程。在轉(zhuǎn)錄水平上，CLIP13在表皮不同區(qū)域的表達(dá)具有明顯的時(shí)空特異性，同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子POU-M2、Antp和Abd-B分別在頭囊、胸部和腹部表現(xiàn)出與CLIP13相似的表達(dá)變化趨勢(shì)。POU-M2、Antp和Abd-B通過直接與CLIP13啟動(dòng)子中的順式反應(yīng)元件結(jié)合參與了CLIP13的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。RNA干擾介導(dǎo)的POU-M2、Antp和Abd-B沉默導(dǎo)致CLIP13在頭包膜、第1至第3胸段表皮和第7至第10腹段表達(dá)下降。He等[3]發(fā)現(xiàn)前體microRNA-14(pre-miR-14)在家蠶中編碼兩個(gè)成熟的miRNA，Bmo-miR-14-5p和Bmo-miR-14-3p，都調(diào)控著20E信號(hào)通路中的各種基因，他們?cè)谕懫ず罅⒓丛黾?，有效地抑制?0E的生物合成、上游調(diào)控和下游應(yīng)答基因。且Bmo-miR-14-5p比Bmo-miR-14-3p具有更強(qiáng)的發(fā)育調(diào)控作用。Qian等[4]研究發(fā)現(xiàn)PKA介導(dǎo)的磷酸化作用通過干擾家蠶BR-C與DNA的結(jié)合抑制其活性，而20E信號(hào)通路可緩解PKA介導(dǎo)的BR-C磷酸化，從而維持其轉(zhuǎn)錄活性。

Yokoyama等[5]對(duì)家蠶Kosetsu品系和日本野桑蠶種群的滯育誘導(dǎo)層次分子機(jī)制進(jìn)行了比較分析，表明母本胚胎發(fā)育過程中的溫度信號(hào)主要通過熱敏感瞬時(shí)受體電位錨蛋白1(thermosensitive transient receptor potential ankyrin 1，TRPA1)和滯育激素(diapause hormone，DH)信號(hào)通路影響滯育決定。盡管家蠶的DH信號(hào)通路和TRPA1的熱敏感性都是保守的，但其胚胎滯育是依賴于光周期的。由此他們推測(cè)TRPA1激活的信號(hào)與Kosetsu中參與滯育誘導(dǎo)的信號(hào)通路密切相關(guān)，因?yàn)門RPA1敲除突變體中溫度依賴的誘導(dǎo)被光周期誘導(dǎo)所取代，從而選擇性地利用溫度信息作為誘導(dǎo)信號(hào)。

在家蠶生育能力方面， Fujii等[6]利用家蠶和野桑蠶之間的體色多態(tài)性差異，發(fā)現(xiàn)Bm-cN-Ⅱ基因決定了家蠶p-oily突變體表型，其功能是將肌苷酸轉(zhuǎn)化為肌苷，可能與家蠶雄蛾生育能力的遺傳有關(guān)。Kasahara等[7]對(duì)家蠶的dmrt11E基因(Bombyxdmrt11E，Bmdmrt11E)進(jìn)行了功能分析，發(fā)現(xiàn)該基因在幼蟲最后齡期的子房中優(yōu)先表達(dá)，成蟲期其mRNA在卵細(xì)胞中積累。當(dāng)用CRISPR/ Cas9介導(dǎo)敲除Bmrt11E導(dǎo)致卵子發(fā)生缺陷，會(huì)產(chǎn)生透明液體的異常卵子，這些卵子的生育能力和血脂水平顯著降低。通過對(duì)照和突變體昆蟲在兩個(gè)發(fā)育階段的卵巢轉(zhuǎn)錄組比較，發(fā)現(xiàn)了6個(gè)可能受Bmdmrt11E控制的基因。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)了由家蠶組蛋白賴氨酸n -甲基轉(zhuǎn)移酶無卵基因(Bombyxmorihiston-lysineN-methyltransferaseeggless，BmEgg)第9 -13外顯子環(huán)化的 circEgg主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，其表達(dá)量隨家蠶發(fā)育階段的變化而變化。circEgg過表達(dá)時(shí)BmEgg基因的線性轉(zhuǎn)錄水平降低。circEgg通過海綿吸收bmo-miR-3391-5p，編碼circEgg- p122蛋白，調(diào)控組蛋白修飾。

在家蠶胚胎發(fā)育過程中， Liu等[9]研究發(fā)現(xiàn)使用GAL4/UAS系統(tǒng)過表達(dá)miR-14轉(zhuǎn)基因會(huì)導(dǎo)致家蠶幼蟲發(fā)育遲緩，幼蟲和蛹體型變小，20E效價(jià)降低。相反，使用轉(zhuǎn)基因CRISPR/Cas9系統(tǒng)破壞miR-14會(huì)導(dǎo)致早熟游走期，且20E滴度增加。

在絲腺發(fā)育相關(guān)基因?qū)用嫔系母牧伎梢詭椭藗儷@得更高品質(zhì)的蠶絲，Hou等[10]經(jīng)染色質(zhì)免疫沉淀和測(cè)序，確定了Dfd(TheBombyxmoriDeformed)為Sage的下游靶基因，并證實(shí)Sage可以通過與SGF1競(jìng)爭(zhēng)抑制Dfd的表達(dá)。通過RNA干擾(RNAi)敲除Dfd后，中間絲腺細(xì)胞數(shù)量減少，后絲腺變直，同時(shí)，Sericin1(Ser1)和絲素蛋白基因的不再是嚴(yán)格的區(qū)域性表達(dá)。這些變化最終導(dǎo)致了Dfd RNAi繭組成的改變。Kajiura等[11]以昆蟲的N-糖基化為重點(diǎn)，鑒定了參與哺乳動(dòng)物復(fù)雜N-聚糖生物合成的家蠶N-乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶(Bombyx mori N- acetylgaltosaminyltransferase，BmGalNAcT)，BmGalNAcT定位于高爾基體，廣泛表達(dá)于各器官和5齡幼蟲中絲腺發(fā)育階段。同時(shí)他們證實(shí)了BmGalNAcT將GalNAc轉(zhuǎn)移到GlcNAcbeta1，2-R的非還原末端，具有beta1，4-連鎖。他們也發(fā)現(xiàn)BmGalNAcT介導(dǎo)半乳糖和N-乙酰氨基葡萄糖殘基的轉(zhuǎn)移，但不介導(dǎo)葡萄糖或葡萄糖醛酸從UDP-糖供體底物向N-聚糖的轉(zhuǎn)移。他們證明了家蠶具有一種新型的多功能糖基轉(zhuǎn)移酶，但其N-糖基化受到內(nèi)源性N-糖基化機(jī)制的嚴(yán)格調(diào)控。Ruan等[12]采用高通量RNA-seq技術(shù)，研究了秋鳳、白玉、Nd-s(D)和Nd蠶5齡第3天后絲腺中l(wèi)ncRNA和mRNA的表達(dá)譜。發(fā)現(xiàn)26 767個(gè)新lncRNAs和6 009個(gè)新mRNA，秋鳳與Nd-s(D)和秋鳳與Nd相比，絲蛋白基因和絲腺轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平降低，而許多與自噬、凋亡、RNA降解、泛素介導(dǎo)的蛋白水解和熱休克蛋白增多。故大量負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成和分泌的基因在Nd中表達(dá)顯著減少。Luan等[13]利用正向遺傳學(xué)方法在Z染色體主效QTL中確定了控制蠶絲產(chǎn)量的基因，使用極端表型的亞種并選擇了高產(chǎn)菌株872B和低當(dāng)量應(yīng)變IS-Dazao作為親本的回交群體BC1 M，Z染色體上的基因候選映射區(qū)域縮小至134 kb的染色體。通過時(shí)空表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域的BmAbl1與絲腺發(fā)育相關(guān)，在高產(chǎn)株系和低產(chǎn)株系的后絲腺中差異表達(dá)。在BmAbl1中，在84頭不同產(chǎn)量的家蠶中檢測(cè)到一個(gè)位于第10外顯子區(qū)域的插入-缺失(indel)和位于第6內(nèi)含子區(qū)域的SNP與繭殼重量有關(guān)。

Yin等[14]分析了BombyxmandarinaScalloped(BmSd)在家蠶翅發(fā)育過程中的作用，該基因被認(rèn)為是海馬通路相關(guān)基因之一，發(fā)現(xiàn)BmSd在家蠶翅膀發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用。在u11中，BmSd表達(dá)量在游走期逐漸減少，而在p50中表達(dá)量則相反。當(dāng)小siRNA在p50菌株游走期敲除BmSd時(shí)，57.9%的個(gè)體表現(xiàn)出小翅。此外，ex、kibra和無翅表達(dá)水平在BmSd敲除突變體中降低。聚類規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR) / CRISPR相關(guān)蛋白9介導(dǎo)的BmSd缺失誘導(dǎo)了50%的小翅個(gè)體，表明Hippo信號(hào)通路參與并在家蠶翅發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮重要作用。Uno等[15]研究發(fā)現(xiàn)RabX6參與了家蠶大腦中睪丸生長(zhǎng)和雄性特異性神經(jīng)肽分泌的調(diào)節(jié)。

Yang等[16]利用RNA測(cè)序(RNA-seq)對(duì)l-4i突變體及其野生型菌株P(guān)33研究發(fā)現(xiàn)，2 013個(gè)基因顯著下調(diào)，其中剪接體snRNP組裝、蛋白折疊和蛋白分解代謝等20個(gè)生物學(xué)過程在這些下調(diào)基因中顯著富集。在l-4i突變體中，2 405個(gè)基因顯著上調(diào)，其中嘌呤堿基代謝過程、核苷代謝過程和重新合成過程等20個(gè)生物過程顯著富集。表明多種生物學(xué)過程和通路的不平衡以及RNA選擇性剪接產(chǎn)生的異常蛋白質(zhì)可能導(dǎo)致l-4i突變體的死亡。

1.2 免疫方面

Shen等[17]從家蠶中克隆了CTL基因CTL-S6的全長(zhǎng)cDNA。moriCTL-S6的開放閱讀框(ORF)編碼378個(gè)氨基酸，其中包含一個(gè)分泌信號(hào)肽。CTL-S6 mRNA在中腸的轉(zhuǎn)錄水平最高，在大腸桿菌或黃體微球菌感染下，其在脂肪體和血細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。純化的重組CTL-S6能與細(xì)菌細(xì)胞壁成分結(jié)合，包括枯草芽孢桿菌的肽聚糖(PGN)和脂多糖，重組CTL-S6參與了血細(xì)胞的包封和黑化。此外，在家蠶的血淋巴中加入重組CTL-S6能顯著提高酚氧化酶活性。表明moriCTL-S6可能作為一種識(shí)別外源病原菌、刺激酚氧化酶原通路和參與先天免疫的模式識(shí)別受體。Yin等[18]表明circRNA可能參與桑蠶脂肪體的免疫應(yīng)答。利用高通量RNA測(cè)序分析了在桑蠶脂肪體中差異表達(dá)(differentially expressed，DE)環(huán)狀RNA、microRNAs(miRNAs)和mRNA對(duì)Bombyx mori nucleopolyhedrosis virus(BmNPV)感染的反應(yīng)。共鑒定出77個(gè)與BmNPV感染相關(guān)的DEcircRNAs、32個(gè)DEmiRNAs和730個(gè)DEmRNAs。構(gòu)建了DEcircRNA / DEmiRNA / DEmRNA和DEcircRNA / DEmiRNA / BmNPV基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并驗(yàn)證了circ_0001432及其對(duì)應(yīng)的miRNA (miR-2774c和miR-34065p)和mRNA(778467和101745232)在網(wǎng)絡(luò)中的差異表達(dá)，檢測(cè)了circ_0001432的組織特異性表達(dá)及其在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況。通過對(duì)DEmRNAs、DEmiRNAs靶基因以及網(wǎng)絡(luò)中DEcircRNAs宿主基因的KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)這些基因在多種代謝通路和信號(hào)通路中富集，在昆蟲免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。

1.3 性別決定方面

在家蠶中，雌性是由W染色體上的顯性雌性化因子決定的。家蠶雙性基因(Bombyxmoridoublesex，Bmdsx)是果蠅雙性基因的同源基因，是性別決定級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最底層基因。從家蠶中分離到具有性別特異性的調(diào)控基因Sxl同源物。在家蠶基因組中還沒有發(fā)現(xiàn)跨同源物。盡管存在這些差異，但家蠶的dsx同源物(Bmdsx)與性別決定有關(guān)。Bmdsx產(chǎn)生選擇性剪接的mRNA亞型，編碼在dsx中觀察到的性別特異性轉(zhuǎn)錄因子。Sakai等[19]對(duì)家蠶性別決定級(jí)聯(lián)的雙開關(guān)基因Bmdsx和BmIMP的表達(dá)模式進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)分析顯示雄性Bmdsx在雌蟲產(chǎn)卵后27和29 h表達(dá)，最終在32 h消失。此外，BmIMPmRNA在這些雌性中也有表達(dá)，其表達(dá)水平與雄性型Bmdsx mRNA相當(dāng)，說明家蠶性別決定的主開關(guān)基因在這一時(shí)期在雌性中表達(dá)，抑制了性別決定基因的雄性特異性表達(dá)模式。

從性別基因?qū)用嫔系母牧伎梢詭椭藗兏脤?shí)現(xiàn)選育， Xu等[20]研究了雄性特異性基因修飾系統(tǒng)，認(rèn)為BmR1p或Bmbeta4p這兩個(gè)啟動(dòng)子可能作為調(diào)控睪丸特異性基因表達(dá)的不同調(diào)控因子，可幫助更好地了解昆蟲睪丸特異性基因的功能。

Nakata等[21]研究了家蠶Bmdsx在大腦發(fā)育過程中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在大腦中Bmdsx以性別和發(fā)育階段依賴的方式差異表達(dá)，Bmdsx在性二態(tài)神經(jīng)回路的發(fā)育中發(fā)揮作用，但神經(jīng)回路與蠶蛾的性行為無關(guān)。BmDSX蛋白表達(dá)細(xì)胞位于蛹和成蟲大腦的背內(nèi)側(cè)區(qū)，在雄性和雌性中分別構(gòu)成兩個(gè)和一個(gè)神經(jīng)簇。bmdsx陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量在蛹期早期至中期達(dá)到高峰，表明在這一時(shí)期兩性神經(jīng)回路已經(jīng)建立。Bmdsx在體細(xì)胞性發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，它的pre-mRNA性別特異性剪接產(chǎn)生兩個(gè)剪接變體：一種編碼雌性特異性多肽，另一種編碼雄性特異性多肽，它們只在c端不同。Bmdsx的開放閱讀框由5個(gè)外顯子組成，其中外顯子3和4是雌性特異性的，在雄性中被跳過。

Xu等[22]發(fā)現(xiàn)雄性蠶蛾的求偶和交配行為是通過突變屬于兩個(gè)保守途徑的性別決定級(jí)聯(lián)基因來調(diào)控的。Bmdsx基因表達(dá)的缺失通過降低BmOR1基因產(chǎn)物的表達(dá)，顯著降低了對(duì)主要信息素組分bombykol的外周感知，而BmOR1基因的產(chǎn)物完全阻礙了成年雄性的求偶。并且他們發(fā)現(xiàn)交配行為是由另一個(gè)性別分化基因Bmfru獨(dú)立調(diào)控的，Bmfru的喪失完全阻礙了交配，但雄性表現(xiàn)出正常的求偶行為，Bmfru表達(dá)的缺失由于下調(diào)了BmOR3的表達(dá)，顯著降低了對(duì)次要信息素組分bombykal的感知。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)BmOR3產(chǎn)物的丟失在終止雄性交配行為中起著關(guān)鍵作用。Liu等[23]在HEK293T細(xì)胞中使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，證實(shí)了miR-2738抑制BmPSI、Bmdsx和BmMasc的轉(zhuǎn)錄。使用CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的miR-2738的遺傳中斷增加了BmPSI和BmMasc轉(zhuǎn)錄本的水平，而Bmdsx的剪接未受miR-2738缺失或過表達(dá)的影響。表明miR-2738是家蠶性別決定基因的一個(gè)次要調(diào)控因子。

piRNA是家蠶W染色體衍生的、雌性特異性的雌性化因子。家蠶的piRNA生物發(fā)生機(jī)制比果蠅的更簡(jiǎn)單，因?yàn)榧倚Q沒有依賴相型piRNA的轉(zhuǎn)錄沉默機(jī)制。Kiuchi等[24]研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)piRNA是由Fem的piRNA前體產(chǎn)生的。Fem序列串聯(lián)排列在W染色體的性別決定區(qū)。雌性胚胎中雌性衍生的piRNA介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)抑制導(dǎo)致了雄性特異性剪接變異的家蠶雙性(Bmdsx)，該基因在性別分化級(jí)聯(lián)的下游末端起作用。在家蠶Z染色體上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)Fem源piRNA的靶基因，命名為Masc，它編碼一種ccch型鋅指蛋白。并發(fā)現(xiàn)Fem piRNA沉默Masc信使RNA是在雌性胚胎中產(chǎn)生Bmdsx雌性特異性亞型的必要條件，而且Masc蛋白控制著雄性胚胎中的劑量補(bǔ)償和雄性化。Katsuma等[25]分別對(duì)siRNA和piRNA通路的核心因子Ago2和Siwi進(jìn)行了CRISPR/ Cas9介導(dǎo)的基因組編輯，發(fā)現(xiàn)在Ago2和Siwi突變的細(xì)胞中，大約有一半的等位基因包含功能缺失突變，與對(duì)照細(xì)胞相比，突變細(xì)胞的生長(zhǎng)速度較慢。Siwi突變的細(xì)胞中piRNAs的數(shù)量顯著減少，但沒有觀察到轉(zhuǎn)座因子整體去抑制。雖然潛伏感染的BmLV的RNA量在Ago2和Siwi突變的細(xì)胞中均增加，但siRNA和piRNA通路分別傾向于靶向BmLV基因組和亞基因組RNA。Nishida等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在家蠶中Zucchini(Zuc)內(nèi)切酶缺失對(duì)3'- 5'外切酶修剪器(Trim)和Nibbler3’-5’外切酶(Nbr)水平?jīng)]有影響，但導(dǎo)致了Papi復(fù)合物中piRNA中間體的異常積累，并通過重組Zuc處理這些中間體形成成熟的piRNA。Papi僅在與PIWI結(jié)合并磷酸化時(shí)才發(fā)揮其RNA結(jié)合活性。還證明了家蠶piRNA的5'端是由PIWI切片機(jī)活性形成的，但獨(dú)立于Zuc，而3'端是由Zuc內(nèi)切酶形成的。

1.4 抗病方面

在基因?qū)用嫔系母牧伎梢詭椭藗儷@得抗病的蠶品種，BmNPV病毒的傳染性和致病性強(qiáng)，是蠶業(yè)生產(chǎn)中最容易給蠶農(nóng)帶來經(jīng)濟(jì)損失的病原之一。從宿主家蠶入手， Jiang等[27]將BmNPV的ie-1、helicase、gp64和vp39分別構(gòu)建了多個(gè)轉(zhuǎn)基因RNAi載體，對(duì)轉(zhuǎn)基因幼蟲的抗BmNPV能力、病毒基因MRNA水平和BmNPV含量進(jìn)行系統(tǒng)比較和分析。之后發(fā)現(xiàn)分別轉(zhuǎn)入家蠶內(nèi)源抗病毒基因Bmlipase-1[28]和外源hycu-ep32基因[29]，調(diào)控家蠶免疫通路的關(guān)鍵基因Bm Spry和Bm PGRP2[29]，都可以提高家蠶抗BmNPV病毒能力。Wu等[30]研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)bmo-miR-2819可以通過下調(diào)BmNPV IE-1基因的表達(dá)來抑制BmNPV復(fù)制，說明細(xì)胞miRNAs可以通過調(diào)節(jié)病毒基因的表達(dá)來影響病毒感染。Dong等[31]在家蠶細(xì)胞中建立了一個(gè)高效的BmNPV誘導(dǎo)ATAD3A-KO轉(zhuǎn)基因家蠶系，提高了基因靶向性和抗病毒效率。

從病毒入手，Zhang等[32]研究BmNPV的ie-1和lef-1基因，構(gòu)建載體制備出了抗性提高的轉(zhuǎn)基因家蠶。Singh等[33]研究發(fā)現(xiàn)在BmNPV感染早期，bmnpv-miR-3可通過負(fù)向調(diào)控DNA 結(jié)合蛋白(P6.9)和其他晚期基因的表達(dá)來逃避宿主的早期免疫應(yīng)答。另外，Chen等[34]利用轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)化技術(shù)和 CRISPR/ Cas9系統(tǒng)，在家蠶體內(nèi)直接裂解BmNPV基因組DNA，促進(jìn)病毒清除，建立了一種新的抗病毒策略。家蠶細(xì)胞質(zhì)多角體病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus，BmCPV)也是家蠶經(jīng)濟(jì)害蟲家蠶的主要病原。Guo等[35]研究發(fā)現(xiàn)BmCPV-miR-1可以通過上調(diào)家蠶凋亡抑制蛋白(Bombyx mori inhibitor of apoptosis protein，BmIAP)的表達(dá)來抑制被感染家蠶的細(xì)胞凋亡，為病毒的復(fù)制提供了更好的細(xì)胞環(huán)境。

Zhang等[36]認(rèn)為家蠶蛋白酶抑制劑BmaSPI51活性位點(diǎn)的特定氨基酸序列以及C端形成的二硫鍵是其具有較高抗真菌活性的關(guān)鍵因素，突變導(dǎo)致了馴化過程中抗真菌活性發(fā)生了變化。

1.5 全基因組選擇育種方面

Li等[37]對(duì)本地和基因改良的家蠶品系進(jìn)行了全基因組選擇性掃描分析，認(rèn)為改良可能影響了蠶的神經(jīng)系統(tǒng)。他們鑒定出24個(gè)具有強(qiáng)選擇信號(hào)的基因組區(qū)域，其中8個(gè)區(qū)域包含13個(gè)候選基因，其中6個(gè)基因注釋了與神經(jīng)信號(hào)反應(yīng)相關(guān)的功能。在這6個(gè)基因中，BGIBMGA004050編碼家蠶CREB-regulated transcription coactivator 1 (BmCRTC1)，該基因參與了能量傳感通路。簡(jiǎn)單重復(fù)序列 (simple sequences repeats，SSRs)是共顯性表達(dá)，廣泛分布于真核生物的基因組中，是優(yōu)良的遺傳標(biāo)記，甘麗萍等[38]研究搜索到家蠶全基因組中SSRs序列為141 311個(gè)位點(diǎn)，總長(zhǎng)度為2.41 Mb，全基因組SSRs六種堿基重復(fù)類型的數(shù)量和密度分布模式為：?jiǎn)螇A基>四堿基>三堿基>二堿基>五堿基>六堿基，說明全基因組以單堿基為主要堿基類型，六種堿基類型中五堿基SSRs G-C含量最高。張正斌等[39]構(gòu)建兩個(gè)抗性品系的BC3M和BC4M分離群體，利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)2b-RAD(基于IIB型限制性內(nèi)切酶的RAD)進(jìn)行親本和雜交分離群體的基因組測(cè)序，篩選位于染色體上與抗性相關(guān)的多態(tài)性SNP標(biāo)記，進(jìn)行抗性品種的基因型分析。獲得抗性親本AN、野BN的多態(tài)性SNP標(biāo)記11 919個(gè)和12 293個(gè)，推測(cè)AN、野BN兩個(gè)品系的Bm NPV高抗性與抗性主基因和其他抗性基因的聯(lián)合作用有關(guān)。

2 展 望

家蠶作為鱗翅目昆蟲的模式生物，其豐富的研究?jī)r(jià)值還需進(jìn)一步探索，眾多基因的功能都可以在家蠶中體現(xiàn)，生長(zhǎng)發(fā)育、性別決定、生物鐘相關(guān)基因等都可以為昆蟲的研究提供有效參考。家蠶是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，其產(chǎn)生的蠶絲是重要的紡織原料，以蠶絲貿(mào)易為代表開辟的絲綢之路，更是孕育了早期的東西方文明的交流與傳播，因此關(guān)于家蠶的研究仍具有極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、文化價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。